六倍體小麥TaHKT2;2基因的克隆與多樣性分析

李孟軍，李亞青，張士昌，張 楠，史占良

(石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院/河北省小麥工程技術(shù)中心，河北 石家莊 050041)

土壤鹽漬化是一個全球性問題，能引起作物大幅減產(chǎn)。鹽害的主要形式之一是高Na+脅迫。因此，植物維持體內(nèi)Na+/K+平衡的能力與其耐鹽性密切相關(guān)。高親和性鉀轉(zhuǎn)運蛋白(HKT)基因家族中的一些成員是已確證的植物Na+轉(zhuǎn)運蛋白。因此，植物HKT基因家族成員在維持植物體內(nèi)Na+/K+平衡方面扮演著極其重要的角色。

Schachtman等[1]利用酵母突變菌株(CY162)首次從六倍體小麥根cDNA文庫中克隆了HKT1(HKT2;1)，該基因編碼一個高親和性鉀轉(zhuǎn)運蛋白。后續(xù)工作證明，TaHKT1在酵母和爪蟾卵母細(xì)胞中具有高親和性 K+/Na+協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白特征；在高濃度外源Na+情況下，TaHKT1也具有低親和性Na+轉(zhuǎn)運蛋白特性[2-3]。

根據(jù)小麥TaHKT2;1 cDNA序列，Uozumi等[4]從擬南芥中克隆了HKT1(AtHKT1;1)。爪蟾卵母細(xì)胞、酵母和大腸桿菌中的分析數(shù)據(jù)顯示，AtHKT1;1介導(dǎo)Na+的轉(zhuǎn)運，同時，在一定程度上介導(dǎo)K+的轉(zhuǎn)運。在過量表達(dá)AtHKT1;1的擬南芥中，Na+在根中大量積累，同時Na+向地上部的轉(zhuǎn)運減少，從而提高了擬南芥的耐鹽性。大量研究表明，AtHKT1;1在植物體內(nèi)的主要作用是避免過量Na+在擬南芥地上部的積累[5-8]。

利用TaHKT2;1 cDNA和Ni-OsHKT2;1 cDNA 做探針，從水稻中克隆了3個HKT2;1同源基因,包括Ni-OsHKT2;1、Po-OsHKT2;1、Po-OsHKT2;2。在氨基酸序列水平上，Ni-OsHKT2;1與 Po-OsHKT2;1序列相同，而與Po-OsHKT2;2的序列一致性為91%[9]。 在水稻日本晴基因組中發(fā)現(xiàn)了7個HKT基因和2個假基因,其中，有功能的基因均由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成[10]。Ren等[11]利用圖位克隆技術(shù)從水稻抗鹽品種(Nona Bokra)克隆了SKC1。SKC1是決定水稻地上部K+含量的主效QTL，與OsHKT1;5對應(yīng)。SKC1在水稻抗鹽品種(Nona Bokra) 和鹽敏感品種(Koshihikari) 之間僅有4個氨基酸差異。OsHKT2;1 屬于類型Ⅱ HKT 轉(zhuǎn)運蛋白,但是其Na+轉(zhuǎn)運能力與 類型Ⅰ成員類似。根據(jù)外源Na+和K+濃度高低，OsHKT2;1表現(xiàn)出不同的通透性：Na+/K+同向運輸、Na+單向運輸和抑制狀態(tài)[12]。OsHKT2;2在植物細(xì)胞中介導(dǎo)Na+-K+同向運輸[13]。No-OsHKT2;2/1 5′端與OsHKT2;2 5′端對應(yīng)，而其3′端與OsHKT2;1 3′端對應(yīng)。No-OsHKT2;2/1對Na+和K+表現(xiàn)出強(qiáng)通透性，這與OsHKT2;2類似，但與OsHKT2;1相反[14]。

硬粒小麥(T.turgidumL.subsp.durumDesf.)品系149基因組中具有2個重要耐鹽相關(guān)基因(Nax1和Nax2)，其作用是從葉片中排出Na+。含有Nax1和Nax2的小麥品系表現(xiàn)出從根部到地上部的低水平的Na+轉(zhuǎn)運能力和高水平的K+轉(zhuǎn)運能力。含Nax1小麥株系Na+積聚在葉的基部。Nax2僅在根部發(fā)揮作用，其方式類似于普通小麥中的Kna1[15]。TmHKT1;4-A2是1個假定的類OsHKT1;4的Na+轉(zhuǎn)運蛋白基因,該基因是Nax1的候選基因，位于小麥第2染色體的長臂上[16]。Nax2在硬粒小麥5A染色體長臂上的位置與Kna1在普通小麥4D染色體長臂上的位置具有高度共線性。Nax2和Kna1與HKT 基因家族HKT1;5對應(yīng)[17]。TmHKT1;5-A編碼位于質(zhì)膜上的高親和性Na+特異性轉(zhuǎn)運蛋白，負(fù)責(zé)由Nax2位點控制的地上部Na+排斥表型。鹽土地上的田間試驗表明，TmHKT1;5-A顯著降低葉中Na+濃度，將硬粒小麥的產(chǎn)量提高25%[18]。利用品系間常規(guī)雜交和分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)將Nax1和Nax2轉(zhuǎn)入了六倍體小麥。Nax1和Nax2分別將葉片中Na+降低了50%和30%，而Nax1和Nax2共同作用將葉片中Na+降低了60%。Nax1和Nax2基因具有提高普通小麥的耐鹽性的潛力[19]。

Garciadeblás等[10]根據(jù)水稻HKT基因家族推測六倍體小麥可能含有18個甚至更多HKT基因，其中6個或者更多HKT序列與HKT2;1類似。但是，普通小麥HKT基因家族除TaHKT2;1和TaHKT1;5外，少見對有關(guān)其他成員的報道。為此，在深入分析普通小麥TaHKT2;1和TaHKT1;5的基礎(chǔ)上[20-21]，克隆了六倍體小麥TaHKT2;2，并對不同來源、不同遺傳背景的六倍體小麥TaHKT2;2 基因多樣性進(jìn)行了分析，探討了TaHKT2;2在小麥人工馴化過程中的演化進(jìn)程。對TaHKT2;2的研究不僅有助于探討TaHKT2;2在六倍體小麥耐鹽機(jī)制中的作用，而且為篩選對Na+耐受性強(qiáng)的TaHKT2;2奠定了基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

矮敗中國春基因組BAC文庫由1×106個克隆組成，插入片段118 kb，覆蓋小麥基因組6.5 倍。粗山羊草(Aegilopstauschii)AL8/78 基因組BAC 文庫包含6.5×104個克隆，覆蓋粗山羊草基因組1.7 倍。12個普通小麥材料分別為：中國春、小白麥、百農(nóng)3217、赤小麥、蘇麥3號、紅袖子、茶淀紅、萊州953、內(nèi)鄉(xiāng)188、品春16、偃展1號、Opta 85。

1.2 小麥BAC文庫的篩選

根據(jù)TaHKT2;1 cDNA序列 (Genbank No.U16709)設(shè)計引物篩選矮敗中國春和粗山羊草AL8/78基因組BAC文庫。以BAC混合池質(zhì)粒為模板，用引物TaHKT1F/TaHKT1R進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物上鏈： 5′-ATGGGCCGGGTGAAAAGAT-3′；下鏈:5′-AGGGGACATGAGCGAGCAG-3′。PCR反應(yīng)程序：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，35個循環(huán)。

1.3 TaHKT2;1和 HKT2;2全長cDNA和基因組序列克隆

以含有TaHKT2;2的BAC單克隆質(zhì)粒為模板，根據(jù)TaHKT2;2已克隆片段序列設(shè)計測序引物，使用ABI 3730XL DNA Analyzer測序獲取TaHKT2;2的5′和 3′末端。重復(fù)上述步驟，直至獲得TaHKT2;2-B、TaHKT2;2-D、AeHKT2;2基因組序列，包括其5′ 側(cè)翼序列。以普通小麥基因組DNA和cDNA為模板，根據(jù)含有TaHKT2;2 基因單克隆BAC質(zhì)粒測序數(shù)據(jù)設(shè)計引物，擴(kuò)增TaHKT2;2全長基因組序列和cDNA序列。以普通小麥基因組DNA和cDNA為模板，根據(jù)TaHKT2;1 cDNA序列(GenBank No.U16709)設(shè)計引物，擴(kuò)增TaHKT2;1全長基因組序列和cDNA序列。所用引物見表1。

表1 HKT2;1和 HKT2;2擴(kuò)增引物

1.4 序列分析

使用高純度小量質(zhì)粒提取試劑盒(百泰克,北京)提取質(zhì)粒。測序使用BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (ABI) 在 ABI 3730XL DNA Analyzer上進(jìn)行。核酸序列組裝、拼接和比對使用軟件Lasergene SeqMan Ⅱ Module(DNAStar;http:/www.DNAStar.com)。多序列比對使用軟件 ClustalW1.83 software(http://www.ch.embnet.org/ software/ClustalW.html)。系統(tǒng)發(fā)育分析使用軟件MEGA3.1。序列著色使用軟件BoxShade program (http://www.ch.embnet.org/software/ BOX_form.html)。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥基因組BAC文庫中HKT陽性克隆的PCR篩選

以矮敗中國春499個BAC混合池質(zhì)粒為模板，通過3輪PCR擴(kuò)增，從矮敗中國春BAC文庫中鑒定出7個TaHKT陽性混合池。通過PCR產(chǎn)物克隆測序，在7個混合池中鑒定出3個TaHKT基因組序列，分別命名為TaHKT2;1、TaHKT2;2-7B(Genbank No.KF646595)和TaHKT2;2-7D(Genbank No.KF646596)(表2)。在此基礎(chǔ)上，分別從pool-14、pool-88、pool-296中分離了含有TaHKT2;2-7B、TaHKT2;2-7D、TaHKT2;1的BAC單克隆。與預(yù)期一致，在粗山羊草Ae.tauschiiAL8/78 BAC 文庫中，僅從plate-69上鑒定出1個TaHKT陽性單克隆，命名為AeHKT2;2。

2.2 TaHKT2;1和TaHKT2;2的克隆與序列分析

為了分析六倍體小麥萊州953TaHKT2;2-7D的等位變異，PCR產(chǎn)物TA克隆后，隨機(jī)挑取了12個克隆進(jìn)行測序，其中1個克隆插入了2 874 bp的DNA片段。該克隆測序結(jié)果表明，插入的DNA片段中含有TaHKT2;2-7A(Genbank No.KF646594)。通過生物信息學(xué)分析，預(yù)測出TaHKT2;2-D的編碼區(qū)序列，但通過RT-PCR 技術(shù)未能在15個六倍體小麥中克隆該基因的cDNA。通過比較基因組序列與其相應(yīng)的cDNA序列，揭示了TaHKT2;1和TaHKT2;2的基因結(jié)構(gòu)。TaHKT2;1和TaHKT2;2基因結(jié)構(gòu)相同，均由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成，這與水稻的HKT家族研究結(jié)果一致[10]。除TaHKT2;2-7D的第2外顯子外，TaHKT2;1和TaHKT2;2的3個外顯子堿基序列長度相同，4條基因組序列長度不同主要是由內(nèi)含子的長度差異造成的(圖 1)。在推導(dǎo)蛋白的氨基酸序列水平上，TaHKT2;2-7A、TaHKT2;2-7B、TaHKT2;2-7D與TaHKT2;1序列一致性分別為94.2%、92.3%、91.1%，而在核苷酸序列水平上，序列一致性分別89.6%、90.1%、87.9%。在核苷酸序列水平上，TaHKT2;2-7A、TaHKT2;2-7B、TaHKT2;2-7D三者之間的序列一致性在92.5%～94.9%。AeHKT2;2與TaHKT2;2-7D的核苷酸序列一致性為99.8%，而其編碼的蛋白氨基酸序列沒有差異。

圖1 TaHKT2;1和TaHKT2;2結(jié)構(gòu)

對來自短柄草、水稻、六倍體小麥、一粒小麥的18個禾本科HKT基因家族成員的系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，22個HKT序列分為2組(亞族1和亞族2)，分別與 HKT命名系統(tǒng)中的類型Ⅰ和類型Ⅱ?qū)?yīng)[22](圖 2)。HKT2;3/HKT2;4和HKT2;1/HKT2;2兩對HKT組成了亞族2，其中HKT2;1/HKT2;2形成了1個進(jìn)化枝(圖 2A)。P-loop結(jié)構(gòu)域和 M2D螺旋對于HKT發(fā)揮功能具有重要作用[23]，多序列比對結(jié)果也表明，禾本科HKT2;1和HKT2;2的P-loop和M2D螺旋高度保守(圖 2B)。

Bd.Brachypodium distachyon;Os.Oryza sativa;Ta.T.aestivum;Tm.T.monococcum

2.3 TaHKT2;2的5′側(cè)翼序列克隆與染色體定位

以含有HKT2;2的BAC單克隆質(zhì)粒為模板，采用引物步行測序方法克隆了TaHKT2;2 的5′側(cè)翼序列。HKT2;1和HKT2;2的5′側(cè)翼序列的差異明顯高于其編碼區(qū)序列。TaHKT2;2-7A與TaHKT2;2-7B的5′側(cè)翼序列的核苷酸序列一致性為84.1%，二者與TaHKT2;2-7D的核苷酸序列一致性分別為44.6%和41.1%(圖 3)。 轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS染色表明，TaHKT2;2-7A、TaHKT2;2-7B和TaHKT2;2-7D的5′側(cè)翼序列均能啟動GUS基因的表達(dá)，鹽脅迫均能提高GUS基因的表達(dá)量。根據(jù)TaHKT2;1和TaHKT2;2 5′側(cè)翼序列設(shè)計特異引物，可以非常有效地將4條序列區(qū)分開。以中國春小麥缺四體為模板，采用PCR方法將TaHKT2;2定位在普通小麥第7同源群上(圖4)。

FS1.TaHKT2;1;FS2.TaHKT2;2-7A;FS3.TaHKT2;2-7B;FS4.TaHKT2;2-7D圖3 TaHKT2;1和TaHKT2;2 5′側(cè)翼序列比較

1.NT7A7B;2.NT7A7D;3.NT7B7A;4.NT7B7D;5.NT7D7A;6.NT7D7B;7.中國春;8.陰性對照；M.DNA Marker;NT.中國春缺四體圖4 TaHKT2;2染色體定位

2.4 TaHKT2;2多樣性分析

為了研究普通小麥中TaHKT2;2的自然多樣性，首先對3個TaHKT2;2序列引物特異性進(jìn)行了分析。以中國春小麥基因組DNA為模板，僅擴(kuò)增出1條主帶，PCR產(chǎn)物克隆測序表明，TaHKT2;2引物特異擴(kuò)增目標(biāo)基因(圖5)。以普通小麥基因組DNA為模板，使用高保真Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳分離純化后，使用載體pGEM-T easy 進(jìn)行克隆，每個普通小麥PCR 產(chǎn)物隨機(jī)挑取6個克隆進(jìn)行測序。測序結(jié)果表明，TaHKT2;2引物在12個六倍體小麥基因組DNA中均能特異擴(kuò)增目標(biāo)基因，能夠用來分析普通小麥TaHKT2;2的多樣性。

在12個六倍體小麥中，TaHKT2;2-7A、HKT2;2-7B和TaHKT2;2-7D分別有5、3、2個等位基因，三者各有1個等位基因占主導(dǎo)地位(表 3)。在TaHKT2;2-7A5個等位基因中有4個堿基轉(zhuǎn)換和1個堿基顛換，導(dǎo)致2個帶正電荷氨基酸(Y131H、G501R)、1個帶負(fù)電荷氨基酸(G2D)和1個非極性氨基酸(I27V)的改變。在TaHKT2;2-7B3個等位基因中有5個堿基轉(zhuǎn)換，引起3個氨基酸改變，其中1個為帶負(fù)電荷氨基酸(G528D)。在TaHKT2;2-7D2個等位基因中檢測出1個堿基顛換(G763C)和1個堿基缺失(A640)，這些堿基變化破壞了其編碼區(qū)序列。HKT轉(zhuǎn)運蛋白的P-loop-like結(jié)構(gòu)域高度保守，決定著其底物特異性[23]。在12個普通小麥的TaHKT2;2所有等位基因中，其編碼蛋白的P-loop結(jié)構(gòu)域均未發(fā)生氨基酸變異。以上結(jié)果表明，在馴化過程中TaHKT2;2高度保守，其編碼蛋白的P-loop結(jié)構(gòu)域在其功能中占據(jù)重要地位。

M.DL2000 plus;1.中國春DNA;2.ddH2O圖5 TaHKT2;1和TaHKT2;2 PCR引物特異性分析

表3 TaHKT2;2 多樣性分析

3 結(jié)論與討論

水稻基因組中發(fā)現(xiàn)的9個 HKT 基因可分為2個亞族，其中OsHKT2;1、OsHKT2;2、OsHKT2;3和OsHKT2;4在系統(tǒng)進(jìn)化樹上形成1個進(jìn)化枝(亞族2)。Garciadeblás等[10]推測六倍體小麥基因組中可能含有18個甚至更多HKT基因,其中6個甚至更多的HKT基因與HKT2;1類似。根據(jù)TaHKT2;1 cDNA序列，克隆了六倍體小麥的3個TaHKT2;2 序列，TaHKT2;2定位于普通小麥第7同源群。李孟軍等[21]利用中國春小麥缺四體和W7984×Opata85將TaHKT2;1定位于7B染色體長臂，因此，該基因應(yīng)命名為TaHKT2;1-7A(Genbank No.U16709)。到目前為止，利用HKT2;1-7A序列未能在Genbank數(shù)據(jù)庫中檢索到其位于7B和7D染色體上的同源序列。如果以上結(jié)果得到驗證，在六倍體小麥基因組中可能僅有4個與HKT2;1序列相同或類似的HKT序列。

TaHKT2;2與TaHKT2;1具有很高的同源性，但二者存在著不同的表達(dá)模式。利用RT-PCR技術(shù)，無論鹽處理與否，均在中國春、茶淀紅、蘇麥3號、品春16、紅袖子、百農(nóng)3217、冀麥26和早穗30的根部和葉片中檢測到TaHKT2;1的表達(dá)，僅在品春16和百農(nóng)3217的根部和葉片中檢測到TaHKT2;2-7A和TaHKT2;2-7B的表達(dá)，在所有普通小麥中均未擴(kuò)增出TaHKT2-7DcDNA。在水稻和擬南芥中的有功能的HKT基因均由3個外顯子和2個內(nèi)含子組成[10]。六倍體小麥HKT基因家族TaHKT2;1、TaHKT2;2、TaHKT1;5 3個成員，與水稻和擬南芥HKT家族成員具有相同的基因結(jié)構(gòu)。在一粒小麥基因組中，HKT1;4有2個拷貝，TmHKT1;4-A1含有2個內(nèi)含子，但TmHKT1;4-A2僅含有1個內(nèi)含子。DNA凝膠印跡分析表明，六倍體小麥A、B和 D 亞基因組中可能均含有2個類TmHKT1;4拷貝[16]。這些結(jié)果提示，普通小麥HKT家族成員基因結(jié)構(gòu)可能存在著差別。

在分析六倍體小麥TaHKT2;1-7A自然變異的基礎(chǔ)上，選取了部分外來種、地方品種和育成種進(jìn)行TaHKT2;2的等位變異分析[21]。TaHKT2;2在A、B和D基因組上的等位變異數(shù)量不同，其中在A基因組上最多，但在3個基因組中均僅有1個等位變異占主導(dǎo)地位，該結(jié)果與TaHKT2;1-7A的等位變異分布不同[21]。TaHKT2;2在3個基因組上雖然發(fā)生了等位變異，但僅少數(shù)幾個堿基發(fā)生突變，由此導(dǎo)致的氨基酸改變更少。在所有TaHKT2;2等位變異中，均未發(fā)生在HKT轉(zhuǎn)運蛋白P-loop結(jié)構(gòu)域中。以上結(jié)果表明，TaHKT2;2在小麥馴化過程中高度保守，瓶頸效應(yīng)明顯，屬于馴化基因[24]。

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