2013～2015年黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)研究

呂文河，敖 翔，呂典秋，閔凡祥，白雅梅，王曉丹

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所，哈爾濱 150086；3.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

馬鈴薯是我國重要糧食作物和經(jīng)濟(jì)作物之一，具有適應(yīng)性強(qiáng)、產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富等特性和一定藥用價值[1]。馬鈴薯生產(chǎn)過程易受病害影響，其中晚疫病尤為嚴(yán)重。馬鈴薯晚疫?。↙ate blight）為致病疫霉（Phytophthora infestans）引起的毀滅性病害。晚疫病可發(fā)生于馬鈴薯整株，嚴(yán)重時導(dǎo)致馬鈴薯莖葉死亡和塊莖腐爛。一般可造成馬鈴薯減產(chǎn)20%～30%，甚至50%以上至絕收。

致病疫霉屬于異宗配合、半活體營養(yǎng)型卵菌，存在A1、A2兩種交配型。兩種交配型同時存在，可通過有性生殖發(fā)生基因重組，產(chǎn)生卵孢子。Niederhauser首次發(fā)現(xiàn)大量卵孢子，證實(shí)晚疫病菌存在A2交配型[2]。20世紀(jì)80年代后，國內(nèi)外學(xué)者相繼報道A2交配型，“新”群體擴(kuò)散，晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)組成逐漸復(fù)雜[3]。張志銘等測定國內(nèi)多省菌株，在內(nèi)蒙古和山西菌株中發(fā)現(xiàn)3株A2交配型[4]。隨后其他省市發(fā)現(xiàn)A2交配型[5-7]。朱杰華測定2000年采集黑龍江省不同地點(diǎn)45株晚疫病菌株，僅克山發(fā)現(xiàn)1株A2交配型菌株[8]。但金光輝等后續(xù)報道中未發(fā)現(xiàn)A2交配型[9-11]，近年王騰等再次證實(shí)黑龍江省內(nèi)存在A2交配型菌株[12-14]。生理小種為晚疫病菌重要表現(xiàn)型之一，其組成與變異直接關(guān)系馬鈴薯晚疫病發(fā)生與流行[15]。國內(nèi)各地晚疫病菌生理小種組成逐漸復(fù)雜，發(fā)現(xiàn)“超級毒力小種”[11，16-17]。目前，馬鈴薯晚疫病防治手段主要為化學(xué)防治，其中苯基酰胺類殺菌劑甲霜靈（metalaxyl）對晚疫病防效較好，具有保護(hù)兼治療作用，但極易產(chǎn)生抗藥性。國內(nèi)外已相繼發(fā)現(xiàn)抗性菌株[7，18]。朱杰華等測定晚疫病菌對甲霜靈敏感性，發(fā)現(xiàn)黑龍江省內(nèi)大多數(shù)馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)均已存在抗性菌株，并占據(jù)主導(dǎo)地位[8，11-12，19]。A2交配型影響黑龍江省晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)，不同年份、地點(diǎn)甲霜靈類殺菌劑使用存在差異，因此對晚疫病菌株群體結(jié)構(gòu)開展持續(xù)性研究十分必要。

本研究通過測定2013～2015年黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌株交配型、甲霜靈敏感性并作生理小種鑒定，探究黑龍江省晚疫病菌群體遺傳結(jié)構(gòu)變化，以期為晚疫病防治提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)待測菌株為2013～2015年采集自黑龍江省齊齊哈爾、綏化、哈爾濱和佳木斯，經(jīng)分離、純化后保存（菌株由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物脫毒苗木研究所提供）。

交配型A1、A2標(biāo)準(zhǔn)菌株均由比利時瓦隆農(nóng)業(yè)研究中心提供。

98%甲霜靈原藥購自先正達(dá)公司，用二甲基亞砜（DMSO）將原藥配制成100 mg·mL-1濃度母液備用。

用于鑒定生理小種寄主共12份（r，R1-R11），均為瓶裝組培苗（由國際馬鈴薯中心提供）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黑麥培養(yǎng)基制備

稱取60 g黑麥（1 L培養(yǎng)基）于量杯中，加入蒸餾水浸泡24 h，將上清液倒出，保留備用。用破碎機(jī)將浸泡后黑麥打碎，加入適量蒸餾水于100℃水浴1 h，水量不超過1 L。水浴后將上清液與之混合，再用4層紗布過濾、棄去殘?jiān)?。濾液中加瓊脂15 g和蔗糖15 g，定容至1 L，攪拌均勻后加熱至瓊脂、蔗糖融化，然后分裝至500 mL錐形瓶中，封口后放入121℃高壓濕熱滅菌鍋中25 min，出鍋后搖勻倒入平皿以備用。

1.2.2 晚疫病菌分離與純化

選取易感病品種馬鈴薯塊莖表面消毒，切成V字型薯片（5 mm厚），斜面切一深槽，將馬鈴薯單病斑葉片夾入深槽，置于18℃光周期培養(yǎng)箱高濕黑暗培養(yǎng)5～7 d。待長出菌絲后，挑取少量菌絲于黑麥培養(yǎng)基上18℃光周期培養(yǎng)箱高濕黑暗培養(yǎng)，7 d后在菌落邊緣切取有單菌絲培養(yǎng)基置于黑麥培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)。菌落形成后即轉(zhuǎn)移至黑麥斜面培養(yǎng)基保存?zhèn)溆肹20]。

1.2.3 交配型測定

采用皿內(nèi)對峙法測定交配型[9]：在黑麥培養(yǎng)基上，將直徑為6 mm待測菌株菌餅分別與同等尺寸A1、A2標(biāo)準(zhǔn)菌株菌餅對峙培養(yǎng)，兩菌餅間距1.5～2.0 cm。將接菌培養(yǎng)皿倒置于18℃暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng)直至兩菌落相交。顯微鏡觀察兩菌落相交處卵孢子產(chǎn)生情況和待測菌株單獨(dú)培養(yǎng)時是否有卵孢子產(chǎn)生。如果待測菌株僅與A2對峙培養(yǎng)時產(chǎn)生卵孢子，則該菌株為A1交配型；反之，僅與A1對峙培養(yǎng)時產(chǎn)生卵孢子則為A2交配型；如果待測菌株單獨(dú)培養(yǎng)時即產(chǎn)生卵孢子，則為自育型菌株。

1.2.4 甲霜靈敏感性測定

采用菌落直徑法測定甲霜靈敏感性[21]：取直徑為8 mm待測菌株菌餅接種到含甲霜靈0、5、100 μg·mL-1黑麥培養(yǎng)基，每個處理3次重復(fù)。置于18℃光周期培養(yǎng)箱高濕黑暗培養(yǎng)7 d（對照菌落直徑大于50 mm），十字交叉法量取菌落直徑。甲霜靈敏感性劃分標(biāo)準(zhǔn)[22]如下：敏感菌株（S）：含甲霜靈5、100 μg·mL-1平板菌落直徑≤40%對照菌落直徑；中抗菌株（MR）：含甲霜靈5 μg·mL-1平板菌落直徑≥40%對照菌落直徑且100 μg·mL-1平板菌落直徑≤40%對照菌落直徑；高抗菌株（R）：含甲霜靈 5、100 μg·mL-1平板菌落直徑≥40%對照菌落直徑。

1.2.5 生理小種鑒定

將待測菌株預(yù)培養(yǎng)10 d，在培養(yǎng)皿中加入適量滅菌水，用涂布棒將孢子囊充分洗出，過濾吸出液體即為孢子囊懸浮液，4℃環(huán)境下2～3 h待其釋放游動孢子即為游動孢子懸浮液，利用血球計(jì)數(shù)板將濃度調(diào)至5×104個·mL-1備用。每個鑒別寄主3瓶苗（r=3），每瓶5株組培苗。采用活體接種[23]，取游動孢子懸浮液10 μL，分別接種在瓶內(nèi)鑒別寄主葉片上，每個鑒別寄主接種30片葉。接種后放置在20℃光周期培養(yǎng)箱高濕黑暗培養(yǎng)12 h，隨后移至20℃光周期培養(yǎng)箱（16 h光照，8 h黑暗）。培養(yǎng)5 d后觀察鑒別寄主是否發(fā)病，如鑒別寄主接種部位有菌絲和孢子囊產(chǎn)生，即確定為侵染；如無癥狀或出現(xiàn)免疫性壞死，即確定為不侵染。統(tǒng)計(jì)每個鑒別寄主發(fā)病情況，根據(jù)Black等[24]毒性基因與鑒別寄主基因型關(guān)系表確定待測菌株生理小種名稱，并分析生理小種復(fù)雜性（Gleason（HG）多樣性指數(shù)，Shannon（HS）多樣性指數(shù)[25]）和毒力基因復(fù)雜性（Ci和Cp指數(shù)[26]）。

HG=（Np-1）/lnN；HS=-∑iPiln（Pi）。

Np：分離鑒定出生理小種個數(shù)，N：菌株數(shù)；Pi：第i個生理小種頻率。

Ci=∑j（PjVj），j=1……Np；CP=（∑jVj）/Np。

Ci：每個菌株毒力基因平均值，Cp：每個小種毒力基因平均值，Pj：第j個生理小種頻率，Vj：第j個生理小種毒力基因數(shù)目，Np：分離鑒定出生理小種個數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 交配型測定

測定待測菌株交配型，結(jié)果見表1。在132株晚疫病菌株中，A1交配型90株，占供試菌株68.18%；A2交配型42株，占供試菌株31.82%（見圖1 A），未發(fā)現(xiàn)自育型菌株。由年際A2交配型分布情況看，A2交配型出現(xiàn)頻率呈先升后降趨勢，2014年達(dá)到最高（57.14%），超過A1交配型占比（見圖1 B）。由地域交配型情況看，綏化地區(qū)未發(fā)現(xiàn)A2交配型；哈爾濱和齊齊哈爾地區(qū)檢測 到A1、A2兩種交配型分別占總菌株65.28%、57.50%，A1交配型占優(yōu)勢（見圖1 C）。齊齊哈爾地區(qū)A2交配型出現(xiàn)頻率波動較大，呈先升后降趨勢；哈爾濱地區(qū)A2交配型頻率變化明顯，3年間呈下降趨勢。

表1 2013～2015年黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌交配型和甲霜靈敏感性Table1 Mating type and metalaxyl sensitivity of Phytophthora infestans isolates in Heilongjiang Province during 2013-2015

2.2 甲霜靈敏感性測定

測定待測菌株甲霜靈敏感性，結(jié)果見表1。在127株晚疫病菌株中，敏感菌株、中抗菌株、高抗菌株分別占17.32%、4.72%、77.95%（見圖2 A）。在年際上，抗性菌株占比相對較高，并呈逐漸升高趨勢；敏感菌株占比呈逐漸降低趨勢，2015年為最低（11.76%）（見圖2 B）。在地域上，綏化地區(qū)敏感菌株占比最高，達(dá)35.00%，哈爾濱地區(qū)最低，敏感菌株占總菌株8.82%（見圖2 C）。

圖2 2013～2015年黑龍江省晚疫病菌甲霜靈敏感性占比Fig.2 Frequency of Phytophthora infestans isolatesmetalaxyl sensitivity in Heilongjiang Province during 2013-2015

2.3 生理小種鑒定

采自2013～2015年齊齊哈爾、綏化、哈爾濱和佳木斯4個地區(qū)84株馬鈴薯晚疫病菌株中，共鑒定出37個生理小種類型，全部為復(fù)合毒力基因小種，優(yōu)勢小種為1.3.4.7.9.10（占總菌株13.10%）（見表2）。由表2可知，2013、2014和2015年優(yōu)勢小種分別為1.3.4.7.10.11，1.2.3.4.5.6.7.8.9.10.11和1.3.4.7.9.10，發(fā)生頻率分別為11.11%；21.43%和28.95%。

表2 2013～2015年黑龍江省晚疫病菌生理小種鑒定結(jié)果Table2 Identification of physiological races of Phytophthora infestans isolates collected from Heilongjiang Province during 2013-2015

由圖3可知，毒力基因avr1、avr3、avr4、avr7、avr10各年份均表現(xiàn)較高頻率，avr2、avr5、avr6、avr8表現(xiàn)頻率呈先升后降趨勢，avr7、avr9表現(xiàn)頻率3年間逐漸升高，avr11則呈逐步降低趨勢。由表3可知，2014年晚疫病菌株復(fù)雜程度最高（HG=5.102，HS=2.682，Ci=8.857，Cp=8.167），2013～2015年黑龍江馬鈴薯晚疫病菌生理小種和小種毒力基因復(fù)雜程度呈升高趨勢。

圖3 2013～2015年黑龍江省晚疫病菌生理小種毒力基因出現(xiàn)頻率Fig.3 Frequency of virulence gene of Phytophthora infestans isolates in Heilongjiang Province during 2013-2015

表3 2013～2015年黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌生理小種及生理小種毒力基因復(fù)雜性指數(shù)Table3 Physiological races and virulence gene complexity of Phytophthora infestans isolates in Heilongjiang Province during 2013-2015

3 討論與結(jié)論

本研究測定2013～2015年采自齊齊哈爾、綏化和哈爾濱晚疫病菌株交配型，發(fā)現(xiàn)A2交配型菌株42株，占總菌株31.82%，但綏化市未發(fā)現(xiàn)A2交配型菌株。就地域而言，近年齊齊哈爾市A2交配型菌株占比呈先升后降趨勢，綏化市未發(fā)現(xiàn)A2交配型（2013～2015年），與王騰等[12]研究結(jié)果一致；就年際而言，3年間A2交配型菌株占比呈先升后降趨勢，與張鉉哲等[14]研究結(jié)果不同，具體原因尚待進(jìn)一步研究。A2交配型在黑龍江省多數(shù)馬鈴薯主要產(chǎn)區(qū)均有分布，目前A2交配型總占比低于A1交配型，但部分地區(qū)A2交配型菌株已成為優(yōu)勢病原菌群（如齊齊哈爾市）。綏化市供試菌株中并未發(fā)現(xiàn)A2交配型，這種地區(qū)間病菌群體結(jié)構(gòu)差異，可能因種薯貿(mào)易造成[7-8]。帶病種薯加快A2交配型傳播與流行，改變各地區(qū)晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)[20]。

甲霜靈高抗菌株已普遍存在，并逐漸成為優(yōu)勢菌群[27-29]。本研究結(jié)果表明，黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌已對甲霜靈產(chǎn)生較強(qiáng)抗藥性，抗性菌株頻率呈上升趨勢。一方面可能與A2交配型大量發(fā)現(xiàn)有關(guān)，Pekad等發(fā)現(xiàn)在112株A2交配型菌株中，高抗菌株占98%，49株A1交配型菌株中高抗菌株占69%[30]；另一方面推測與連續(xù)使用甲霜靈類殺菌劑有關(guān)[7,31]。就地域而言，施藥類型不同，可造成抗性菌株頻率差異。金光輝測定2004～2006年黑龍江晚疫病菌甲霜靈敏感性，發(fā)現(xiàn)抗性菌株占總菌株74.29%[32]。王騰等測定2011～2013年黑龍江晚疫病菌株甲霜靈敏感性，測定結(jié)果顯示抗性菌株占83.92%[12]。本研究2013～2015年黑龍江晚疫病菌抗性菌株占比77.95%，說明近10年黑龍江省晚疫病菌對甲霜靈抗藥性總體上升。在高抗菌株優(yōu)勢地區(qū)應(yīng)減少甲霜靈類殺菌劑使用，降低晚疫病菌選擇壓力；在敏感菌株優(yōu)勢區(qū)域，合理制定防治方案，注意輪換用藥，延長藥劑有效使用期限[31,33]。

就生理小種而言，中國馬鈴薯晚疫病生理小種類型已趨于復(fù)雜化[16-17]。王晨從2008～2011年黑龍江省41個晚疫病菌株中鑒定出15個生理小種類型，優(yōu)勢小種為1.2.3.4.5.6.7.9.10.11（24.39%）[34]。金光輝等測定2010年采自黑龍江省84個菌株，鑒定出生理小種類型25個，優(yōu)勢小種為1.3.4.7.8.10.11（27.38%）[35]。本研究在2013～2015年84株晚疫病菌中共鑒定出37個生理小種類型，優(yōu)勢小種為1.3.4.7.9.10（13.10%），說明近年優(yōu)勢小種毒力基因數(shù)目和占比顯著減少，但其他生理小種類型顯著增多。另外，本研究表明，2013～2015年黑龍江省馬鈴薯晚疫病菌生理小種復(fù)雜性和生理小種毒力基因復(fù)雜性總體升高，結(jié)合金光輝等[35]和王騰[36]研究，黑龍江省晚疫病菌生理小種復(fù)雜程度整體呈升高趨勢。其中，2014年研究結(jié)果表明，“超級毒力小種”為當(dāng)年優(yōu)勢小種，盡管此前在黑龍江省已發(fā)現(xiàn)“超級毒力小種”，但最高優(yōu)勢小種毒力基因個數(shù)未達(dá)到11個[37]，可能是病原菌有性生殖使毒力基因重組，形成“超級毒力小種”，增加晚疫病抗性育種難度。

本研究在前人研究基礎(chǔ)上繼續(xù)監(jiān)測2013～2015年黑龍江省晚疫病菌群體結(jié)構(gòu)。目前黑龍江省大部分馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)均發(fā)現(xiàn)A2交配型，甲霜靈抗性菌株占絕對優(yōu)勢，小種復(fù)雜性指數(shù)持續(xù)升高，晚疫病防治難度加大。在防治方面，建議盡量使用非甲霜靈類殺菌劑，防止殺菌劑單一使用使病原菌出現(xiàn)抗藥性；在控制方面，應(yīng)保證種薯質(zhì)量安全，避免帶病種薯遷移、傳播；加強(qiáng)馬鈴薯抗晚疫病育種研究，從源頭控制馬鈴薯晚疫病發(fā)病與流行。

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