手性農(nóng)藥甲霜靈在土壤微生物中降解的研究*

石健 張奇 楊睿璐 李春建 范素素 張政

（1.南通大學(xué)分析測(cè)試中心，江蘇 南通 226019；2.南通大學(xué)交通與土木工程學(xué)院 江蘇 南通 226019；3.南通大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 南通 226019）

0 引言

在已商品化的化學(xué)農(nóng)藥中，手性農(nóng)藥占很大比率，且有應(yīng)用越來越普遍的趨勢(shì)。手性農(nóng)藥對(duì)映體具有相同的物理化學(xué)性質(zhì)，但生物毒性、生物蓄積、生物降解等生物學(xué)效應(yīng)不同［1］。然而，手性農(nóng)藥總是作為外消旋化合物銷售和使用，這使得手性污染物往往被忽視。因此，我們有必要研究手性農(nóng)藥在土壤中的對(duì)映選擇性作用。但是，由于手性對(duì)映體往往具有相同的物理化學(xué)性質(zhì)，對(duì)它們的分離分析工作就變得十分困難。到目前為止，已經(jīng)用高效液相色譜（HPLC）［2］，氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）［3］、液相色譜-質(zhì)譜（LC-MS）［4］和核磁共振（NMR）［5］等方法對(duì)手性物質(zhì)進(jìn)行拆分。高效液相色譜法具有“三高一廣”的特點(diǎn)：高壓、高效、高靈敏度，應(yīng)用范圍廣。CHEN S等［4］采用正相高效液相色譜法測(cè)定丙環(huán)唑?qū)τ丑w在水、土壤、葡萄中的立體選擇性，該方法成功應(yīng)用于實(shí)際樣品的選擇性分析。QIN F等［6］建立一種反相高效液相色譜法來分離丁烯氟蟲腈對(duì)映體，采用纖維素類手型固定相分離和測(cè)定，討論了不同流動(dòng)相組成對(duì)分離的影響。LIU T等［1］利用高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)了農(nóng)利靈對(duì)映體的分離，并將該法運(yùn)用于農(nóng)利靈對(duì)映體在土壤中的降解研究，其研究發(fā)現(xiàn)，農(nóng)利靈對(duì)映體降解符合一級(jí)動(dòng)力學(xué)。

甲霜靈［N-（2，6-二甲基苯基）-N-（甲氧基乙?；?D，L-丙氨酸甲酯］（圖1）是用來控制各種農(nóng)作物、蔬菜和水果中真菌病害的最常用的殺真菌劑之一，通過抑制體內(nèi)菌絲體蛋白質(zhì)的合成，使其生長(zhǎng)異常而死亡。甲霜靈具有一對(duì)對(duì)映異構(gòu)體，（+）-S-甲霜靈和（-）-R-甲霜靈，甲霜靈對(duì)映體在土壤、植物、動(dòng)物等多種介質(zhì)中的對(duì)映選擇性降解［7］。

圖1 甲霜靈結(jié)構(gòu)式示意

因此，本工作擬建立一種簡(jiǎn)單高效的正相高效液相色譜法對(duì)甲霜靈兩種對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行分離分析，同時(shí)研究甲霜靈對(duì)映體在土壤中的立體選擇性降解，為甲霜靈對(duì)映體的科學(xué)使用提供依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 樣品采集與前處理

1.2 高效液相色譜方法驗(yàn)證

為驗(yàn)證方法有效性、測(cè)定線性、基質(zhì)效應(yīng)、回收率、精密度、檢出限（LOD）和定量限（LOQ）等參數(shù)，在正己烷中溶解甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品，得到對(duì)映體質(zhì)量濃度為5、15、25、35、45 mg/L一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積為坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸分析。

通過回收率研究來檢查方法的準(zhǔn)確性和精確性。在空白樣品中加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液來測(cè)定回收率，確定3個(gè)水平和5個(gè)重復(fù)以計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

LOD和LQD分別為3倍和10倍信噪比（S/N）。

手性分離評(píng)價(jià)參數(shù)采用分離度：

式中，t為對(duì)映體的保留時(shí)間，w1/2為半峰寬。Rs大于1.5時(shí)，認(rèn)為達(dá)到基線分離。

通常分析土壤中有機(jī)物降解過程采用一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)模型，其方程與半衰期（t1/2）的計(jì)算如下［8］：

式中，Ct和C0分別為藥物在時(shí)間t和初始時(shí)的濃度，k為降解速率常數(shù)。

藥物的立體選擇性一般采用對(duì)映體分?jǐn)?shù)EF來表示［9］：

式中，［S］和［R］分別為手性農(nóng)藥對(duì)映體的峰面積。EF值的范圍為［0，1］，當(dāng)不存在立體選擇性時(shí)，EF值為0.5。

2 結(jié)果與討論

2.1 甲霜靈分析方法的建立

2.1.1 手性柱的選擇

手性固定相在與外消旋體相互作用時(shí)，各對(duì)映體與固定相生成穩(wěn)定性不同的短暫的對(duì)映體復(fù)合物，造成在柱淋洗時(shí)保留時(shí)間不同，從而達(dá)到拆分的目的［10］。目前較為常見的手性固定相有纖維素衍生物涂敷型（Chiralcel OD柱）、直鏈淀粉衍生物涂敷型（Chiralpak AD柱）、直鏈淀粉衍生物鍵合型（Chiralpak IA柱）等，張美等［11］用這幾種手性固定相對(duì)38種手性物質(zhì)進(jìn)行拆分，OD固定相的手性識(shí)別率最高，達(dá)到60%。纖維素衍生物類手性固定相具有優(yōu)良的手性拆分能力，對(duì)各類化合物都表示出極高的手性識(shí)別能力，因此本研究中選用的手性柱Chiralcel ODH。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

正相流動(dòng)相一般選用正己烷、無水乙醇、異丙醇進(jìn)行配比，實(shí)現(xiàn)對(duì)化合物在正相柱上的拆分。本實(shí)驗(yàn)中選用正己烷與無水乙醇混合流動(dòng)相，改變體積比，觀察甲霜靈兩對(duì)映體分離度，見表1。

表1 不同流動(dòng)相比例甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品溶解液的液相參數(shù)

2種流動(dòng)相體積比下，甲霜靈對(duì)映體分離度均大于1.5，而在后續(xù)的土壤實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，土壤樣品在5 min左右會(huì)出現(xiàn)雜質(zhì)峰，因此采用V（正己烷）∶V（無水乙醇）=75∶25有利于實(shí)驗(yàn)的后續(xù)進(jìn)行。

波長(zhǎng)、柱溫、進(jìn)樣量、甲霜靈在紫外光區(qū)220 nm處有最大吸收，因此選擇220 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)［12］。并確定柱溫為35℃，進(jìn)樣量為5L。

2.1.3 對(duì)映體流出順序的確定

在上述優(yōu)化條件的基礎(chǔ)上，采用高效液相法（HPLC）分別檢測(cè)甲霜靈和精甲霜靈標(biāo)準(zhǔn)品，確定甲霜靈對(duì)映體的流出順序（如圖2），（+）-S-甲霜靈先流出，（-）-R-甲霜靈后流出。保留時(shí)間分別為10.39 min和21.78 min。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品液相圖譜（A：甲霜靈；B：精甲霜靈）

2.1.4 方法線性、回收率和檢測(cè)限、定量限

圖3中，標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍為1～50 mg/L，（+）-S-甲霜靈的線性方程為y=10.738x+31.938，相關(guān)系數(shù)R2為0.994 4，（-）-R-甲霜靈的線性方程為y=11.05x-8.920 8，相關(guān)系數(shù)R2為0.999 1。表2中，甲霜靈在不同環(huán)境介質(zhì)中的回收率為71%～107%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD均小于6.6%。兩種對(duì)映體的LOD和LOQ分別為0.011 mg/kg和0.015 mg/kg。

表2 不同添加量甲霜靈在不同介質(zhì)中的回收率

圖3 甲霜靈對(duì)映體標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 甲霜靈對(duì)映體在土壤微生物中的立體選擇性降解

由圖4可知，在滅菌和未滅菌的土壤中加入甲霜靈甲醇溶液，經(jīng)過42 d的培養(yǎng)，甲霜靈在滅菌土壤中降解較少，降解率僅有45%。前30天甲霜靈幾乎不降解，而到第42天其含量有明顯降低，可能是空氣和環(huán)境中的微生物進(jìn)入土壤而引起的降解。而在未滅菌土壤中，32 d時(shí)R-甲霜靈的含量已低于檢測(cè)限，42 d的降解率達(dá)到89%。由此可見，微生物作用是引起甲霜靈降解的首要因素。

圖4 甲霜靈對(duì)映體在土壤中降解曲線

通過擬合一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程，我們可以得到降解速率，并計(jì)算得到半衰期（t1/2=ln2/k），如表3所示：

表3 甲霜靈對(duì)映體在土壤中降解擬合方程參數(shù)

甲霜靈對(duì)映體在滅菌土壤中的半衰期相差不大，在75 d左右；而未滅菌土壤中，S-甲霜靈的降解半衰期為49.85 d，R-甲霜靈的半衰期為32.84 d，相差17 d。同時(shí)發(fā)現(xiàn)未滅菌土壤中甲霜靈降解速率更快，半衰期更短。進(jìn)一步證明，微生物作用可以大大加快甲霜靈的降解。

如圖5和表3所示，在未滅菌的土壤中，甲霜靈的兩種對(duì)映體之間存在顯著差異，EF從0.50增加到0.78，降解半衰期與降解速率相差較大，R-甲霜靈優(yōu)先降解。已有研究表明，土壤中甲霜靈降解的立體選擇性與土壤的氧含量和pH有關(guān)。在好氧土壤中，當(dāng)pH值>5時(shí)，R-甲霜靈的降解速率要快于S-對(duì)映體；當(dāng)pH值處于4～5時(shí)，兩對(duì)映體降解速率幾乎相同；而當(dāng)pH值<4時(shí)，S-甲霜靈降解得更快.在厭氧土壤中，也是S-甲霜靈降解得更快［3］。在我們的研究中，土壤是pH值為7.45的表層土，屬于好氧弱堿性土，而R-甲霜靈降解快于S體，這結(jié)果與以前的研究一致。

圖5 甲霜靈在土壤中降解過程EF值

而在滅菌土壤中，兩種對(duì)映異構(gòu)體的降解曲線之間幾乎沒有差異，EF值接近于0.5，可見滅菌土壤中甲霜靈降解不具有立體選擇性。與滅菌的土壤相比，未滅菌土壤含有更多的微生物，這可能是導(dǎo)致其產(chǎn)生立體選擇性的主要原因。施藥后約80%～90%的農(nóng)藥會(huì)進(jìn)入土壤，而土壤中微生物的選擇性降解是產(chǎn)生立體選擇性的主要原因［13-15］。DIAO J等［24］發(fā)現(xiàn)無論是好氧還是厭氧土壤中，S-（+）-乳氟禾草靈比R體都降解得快，而在滅菌土壤中兩對(duì)映體降解速率幾乎相同，證實(shí)了微生物降解是引起立體選擇性的主要原因［15］。

3 結(jié)論

1）本研究中，建立并優(yōu)化了甲霜靈的分離分析方法。采用正相色譜法，利用手性柱Chiralcel ODH，在波長(zhǎng)220 nm，進(jìn)樣量5L，柱溫35℃，流動(dòng)相V（正己烷）∶V（無水乙醇）=75∶25條件下檢測(cè)甲霜靈對(duì)映體。該方法下，甲霜靈對(duì)映體完全分離，且方法準(zhǔn)確度、精密度良好。

2）確定甲霜靈對(duì)映體線性方程為：（+）-S-甲霜靈的線性方程為y=10.738x+31.938，相關(guān)系數(shù)R2為0.9944，（-）-R-甲霜靈的線性方程為y=11.05x-8.9208，相關(guān)系數(shù)R2=為0.999 1。

3）在滅菌土壤中，甲霜靈42天降解率約為45%，且甲霜靈對(duì)映體降解過程中不具有立體選擇性。在未滅菌土壤中，甲霜靈42天降解率達(dá)到89%，且甲霜靈對(duì)映體降解具有明顯的立體選擇性，R-甲霜靈比S-甲霜靈降解的更快。

4）通過比較甲霜靈在滅菌和未滅菌土壤中甲霜靈的降解行為，得到微生物作用是引起甲霜靈降解的主要因素，同時(shí)是導(dǎo)致甲霜靈降解立體選擇性的最重要原因。