大豆TST基因的生物信息學(xué)及表達(dá)模式分析

李文濱，張永艷，王金陽(yáng)，徐玲秀，宋 偉，趙 雪，韓英鵬

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所，哈爾濱 150030）

糖（Sucrose）為光合作用主要產(chǎn)物，為植物生長(zhǎng)發(fā)育提供碳架與能量[1]，影響植物產(chǎn)量。大豆產(chǎn)量為多基因控制復(fù)雜性狀，存在明顯環(huán)境互作效應(yīng)，傳統(tǒng)生理與遺傳學(xué)研究方法難以分析其遺傳本質(zhì)與調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步明確復(fù)雜糖代謝和糖轉(zhuǎn)運(yùn)基因網(wǎng)絡(luò)中決定大豆糖積累的關(guān)鍵基因，可為大豆品質(zhì)改良提供理論指導(dǎo)，為探索作物光合產(chǎn)物積累與轉(zhuǎn)運(yùn)分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)，具有重要理論意義與實(shí)用價(jià)值。在大豆生長(zhǎng)發(fā)育過程中，蔗糖為主要光合產(chǎn)物，其含量影響花、莢形成，決定全株籽粒重和籽粒飽滿程度[2-3]。植物中糖運(yùn)輸主要由糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（Sugar transporter）介導(dǎo)，目前已在水稻、玉米等作物中發(fā)現(xiàn)多個(gè)糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[4]。糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可介導(dǎo)糖在韌皮部長(zhǎng)距離運(yùn)輸，葉脈、根、種子、果實(shí)、胚及花粉中均有分布，對(duì)作物生物學(xué)和經(jīng)濟(jì)學(xué)產(chǎn)量影響較大[5-6]。其中液泡膜糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白TST（Tonoplast sugar transporter）主要負(fù)責(zé)將糖從胞質(zhì)中跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡，定位于液泡膜上，TST基因具有單糖和二糖轉(zhuǎn)運(yùn)功能。在TST基因蛋白結(jié)構(gòu)中，第6和7跨膜區(qū)中間有1個(gè)長(zhǎng)親水環(huán)位于胞質(zhì)，該環(huán)為糖感應(yīng)器[7]。目前其功能和特性研究主要集中于擬南芥、甜菜西瓜和蘋果等作物。擬南芥中存在3個(gè)同源基因，其中AtTST1和AtTST2表達(dá)量較高，在糖高度積累花粉中表達(dá)量最高[8]。AtTST1、AtTST2敲除突變顯著降低液泡中Glu、Fru、Suc積累[8-9]及擬南芥生物產(chǎn)量；AtTST1過量表達(dá)，可提高生物量，增加種子產(chǎn)量[9]。甜菜中TST2是蔗糖特定轉(zhuǎn)運(yùn)因子[10]，質(zhì)子轉(zhuǎn)運(yùn)體，耦合蔗糖在液泡中大量積累，可提高產(chǎn)量。在其他作物中，TST基因表達(dá)量與含糖量正相關(guān)，TST基因表達(dá)豐度可調(diào)控其產(chǎn)量或品質(zhì)[11-12]。結(jié)果表明，TST為液泡膜上負(fù)責(zé)糖轉(zhuǎn)運(yùn)關(guān)鍵蛋白并對(duì)作物產(chǎn)量具有重要影響。

目前在基因組水平上大豆GmTST基因家族的生物信息學(xué)分析及功能研究尚未見報(bào)道。本文從調(diào)控源到庫(kù)關(guān)系角度，利用已公布大豆基因組序列信息，采用生物信息學(xué)方法，在基因組水平上預(yù)測(cè)GmTST基因，通過序列分析、進(jìn)化分析、組織表達(dá)特異性分析及表達(dá)模式分析等，為進(jìn)一步研究GmTST基因功能提供參考及理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

植物材料為大豆willimas82，由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 生物信息來(lái)源

其他信息來(lái)源為美國(guó)生物國(guó)立信息中心（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）（NCBI）核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中注冊(cè)擬南芥（Arabidopsis thaliana）、甜菜（Beta vulgaris）TST氨基酸序列、其GenBank Accession分別為：擬南芥TST1（NM_101937）；擬南芥TST2（NM_001342 340）；甜菜（XM_010680330）。

1.1.3 引物

利用Primer Exprexx軟件設(shè)計(jì)引物，由哈爾濱博士生物工程公司合成，克隆引物為：正向5'-CCATGGGATTACGAAACTAACTGAAACG-3',反向5'-GGTTACCGAATTTATCATGTCCTTGGG-3'，對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)分別為CCATGG，GGTTAC。實(shí)時(shí)定量基因、內(nèi)參基因所用引物序列見表1。

1.1.4 主要試劑

植物RNA提取試劑盒購(gòu)自O(shè)mega公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自上海捷瑞生物工程有限公司；Taq DNA聚合酶、DNA marker、Trizol reagent、T4 DNA連接酶、pGEM-T Easy Vector T克隆試劑盒均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific公司；DNA純化回收試劑盒購(gòu)自omega公司。

表1 基因及PCR引物序列信息Table1 Information of genes and Primer sequence

1.1.5 質(zhì)粒與菌種

大腸桿菌trans-t1感受態(tài)購(gòu)自全式金公司，pGEM-T Easy購(gòu)自TaKaRa公司。

1.1.6 測(cè)序

基因測(cè)序由哈爾濱博士生物工程公司完成。

1.2 方法

1.2.1 大豆TST及其同源基因系統(tǒng)發(fā)育分析

在Phytozome網(wǎng)站（Version 12.0）使用BLAST工具，分別在NCBI網(wǎng)站檢索擬南芥TST1、TST2和甜菜TST2蛋白序列，BLASTp查找大豆TST基因，同時(shí)將檢索蛋白序列后續(xù)分析。應(yīng)用MEGA[13]構(gòu)建雙子葉模式植物擬南芥（Arabidopsis thaliana）、大豆（Glycine max（L.）Merr）、甜菜（Beta vulgaris）進(jìn)化樹，檢驗(yàn)Bootstrap（參數(shù)設(shè)為1 000）系統(tǒng)發(fā)生樹。

1.2.2 大豆TST基因組織特異性表達(dá)

分別取william82真葉期與三出期各部位、花及R4-R8期果，液氮研磨后按照試劑盒方法提取各處理樣品總RNA，采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)和NanoDrop?Lite紫外分光光度計(jì)聯(lián)合檢測(cè)RNA濃度，純度合格后按說(shuō)明書將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，通過正向引物F（5'GTGTCAGCCATACTGTCCCC ATT 3'）和反向引物 R（5'GTTTCAAGCTCT TGCT CGTAATCA 3'）擴(kuò)增大豆Actin基因檢驗(yàn)cDNA質(zhì)量。設(shè)計(jì)大豆TST基因熒光定量引物并檢測(cè)引物特異性。

熒光定量PCR檢測(cè)法反應(yīng)體系參考試劑盒使用說(shuō)明書。本試驗(yàn)采用三步法PCR擴(kuò)增程序，PCR程序包括：預(yù)變性95℃15 min，95℃10 s，60℃20 s，72℃20 s，40個(gè)循環(huán)。被測(cè)基因PCR產(chǎn)物相對(duì)豐度采用內(nèi)參基因法，對(duì)于相對(duì)定量ΔΔCT方法，CT值由3次試驗(yàn)重復(fù)取平均數(shù)，相對(duì)拷貝數(shù)由 2-ΔΔCT計(jì)算得到（ΔΔCT=CT目的基因-CT內(nèi)參Actin基因）。

1.2.3 GmTST2.1基因克隆

根據(jù)定量結(jié)果挑選主拷貝基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)包括起始密碼和終止密碼的5'端及3'端引物，引入合適酶切位點(diǎn)?？寺CR反應(yīng)體系參考試劑盒說(shuō)明書。PCR反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性10 min，94℃變性30 s，58℃復(fù)性30 s，72℃延伸30 s，擴(kuò)增適當(dāng)次數(shù)；72℃延伸10 min，置于4℃保存?；厥誔CR產(chǎn)物，參照試劑盒說(shuō)明書將回收產(chǎn)物與pGEM-T easy載體連接過夜，連接體系10 μL：1 μL pGEM-T easyVector，1 μL T4 DNA Ligase，1 μL 10×T4 DNA Ligase buffer，5 μL PCR 產(chǎn)物，2 μL 去離子水。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌trans-t1，在LB固體培養(yǎng)基上篩選，LB固體培養(yǎng)基含Kan抗性。選取陽(yáng)性菌株用于基因測(cè)序。

1.2.4 GmTST2.1生物信息分析及功能預(yù)測(cè)

應(yīng)用 ProtParam（http://web.expasy.org/protparam/）在線工具分析氨基酸序列理化性質(zhì)[14-16]。利用ProtScale（http://web.expasy.org/protscale/）工 具 中Hphob./Kyte＆Doolittle算法分析氨基酸序列親水性與疏水性。蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/；蛋白質(zhì)的信號(hào)肽預(yù)測(cè)：http：//www.cbs.dtu.dk/ser-vices/SignalP/；蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)：SOPM（https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html）；使用 http：//swissmodel.expasy.org/在線工具[17-18]，以willimas82的TST2.1蛋白氨基酸序列為模板，預(yù)測(cè)TST2.1基因編碼蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 大豆TST基因分子進(jìn)化分析

根據(jù)擬南芥、甜菜TST蛋白氨基酸序列在大豆數(shù)據(jù)庫(kù)中BLAST檢索、篩選，共得到10個(gè)大豆同源TST基因，在數(shù)據(jù)庫(kù)（Phytozome Version12.0）中上述基因被注釋為主要轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物轉(zhuǎn)錄本并作后續(xù)分析[19-20]，構(gòu)建大豆、擬南芥、甜菜3個(gè)物種進(jìn)化樹（見圖1）。大豆基因TST與擬南芥親緣較近。Glyma 06G015000和Glyma04G015000兩個(gè)基因高度同源，Glyma01G015730和Glyma11G087700兩個(gè)基因高度同源，Glyma02G311700和Glyma14G000900兩個(gè)基因高度同源。

2.2 大豆TST基因組織特異性表達(dá)分析

大豆品種willimas82作為試驗(yàn)材料，actin作內(nèi)參基因熒光定量PCR擴(kuò)增，根據(jù)進(jìn)化樹分析結(jié)果，本試驗(yàn)在與擬南芥、甜菜同源性較近基因中同源性為100%的Glyma06G015000和Glyma04G0 15000、Glyma02G311700和Glyma14G000900、Glyma 01G157300和Glyma11G087700及同源性為99%的兩個(gè)基因中各選1個(gè)基因和Glyma16G112500作表達(dá)量模式分析。各基因分別為GmTST2.1（Glyma 04G000300）、GmTST2.2（Glyma02G311700）、GmTST2.3（Glyma06G015000）、GmTST3.1（Glyma16G1125 00）、GmTST3.2（Glyma01G157300）。

圖1 擬南芥、甜菜和大豆3個(gè)物種的TST蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig.1 TST protein phylogenetic tree of Arabidopsis thaliana,beet and soybean three species

2.2.1 大豆TST基因在大豆生育期時(shí)期相對(duì)表達(dá)

5個(gè)GmTST基因在大豆不同生育期時(shí)期相對(duì)表達(dá)量變化情況見圖2。

結(jié)果表明，在大豆生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期GmTST基因表達(dá)量差異顯著，普遍表現(xiàn)為花中表達(dá)量最高，下胚軸/莖中表達(dá)量最低。大豆生長(zhǎng)發(fā)育過程中GmTST2.1基因在大豆不同組織器官中表達(dá)量依次為：花＞子葉＞葉＞葉柄＞根＞種子＞頂芽＞莖＞下胚軸，其中花中表達(dá)量為下胚軸中表達(dá)量67倍（見圖2A）。GmTST2.2基因在大豆不同生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)期表達(dá)量在子葉中表達(dá)量最高，莖表達(dá)量最低，子葉中表達(dá)量為莖表達(dá)量242倍；GmTST2.2基因在大豆不同組織器官中均有表達(dá)，表達(dá)量依次為：子葉＞花＞葉＞根＞葉柄＞種子＞頂芽＞下胚軸＞莖；大豆生長(zhǎng)發(fā)育過程中相同組織器官在真葉期和三出期莖、下胚軸和頂芽表達(dá)量無(wú)顯著差異，子葉、花與其他組織表達(dá)量差異顯著（見圖2B）。GmTST2.3基因在大豆不同組織器官中表達(dá)量依次為：花＞葉柄＞根＞子葉＞葉＞頂芽＞莖＞種子＞下胚軸，其花中表達(dá)量最高，表達(dá)量最低為下胚軸，花中表達(dá)量為下胚軸中表達(dá)量121倍；大豆TST2.3基因在大豆生長(zhǎng)發(fā)育過程中，相同組織器官在真葉期和三出期下胚軸無(wú)顯著差異，花與其他組織中表達(dá)量差異顯著（見圖2C）。圖2D為GmTST3.1基因在大豆不同生育期時(shí)期相對(duì)表達(dá)量變化情況。在大豆生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期，GmTST3.1基因在除花以外其他組織中表達(dá)量普遍較低，莖中表達(dá)量最低，花中表達(dá)量為莖484倍；TST3.1基因在大豆不同組織器官中均有表達(dá)，表達(dá)量依次為:花＞子葉＞根＞葉柄≥葉＞種子＞頂芽＞下胚軸＞莖；大豆生長(zhǎng)發(fā)育過程中，相同組織器官在真葉期和三出期無(wú)顯著差異，花與其他組織表達(dá)量差異顯著。圖2E為GmTST3.2基因在大豆生育期時(shí)期相對(duì)表達(dá)量變化情況，在大豆生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期GmTST3.2基因表達(dá)量不同，具體表現(xiàn)為葉中表達(dá)量最高，莖中表達(dá)量最低，葉中表達(dá)量為莖118倍；TST3.2基因在大豆不同組織器官中均有表達(dá)，其表達(dá)量依次為：葉＞花＞種＞葉柄＞頂芽＞子葉≥根＞下胚軸＞莖；大豆生長(zhǎng)發(fā)育過程中，TST3.2基因在真葉期和三出期葉組織器官差異顯著，花、葉中表達(dá)量較其他組織差異顯著。

2.2.2 TST基因在大豆生殖期表達(dá)量變化

GmTST基因在大豆生育期時(shí)期相對(duì)表達(dá)量變化情況見圖3。

由圖3可知，大豆生殖生長(zhǎng)發(fā)育過程中，基因表達(dá)量呈先降再升最后急劇下降趨勢(shì)；在大豆生殖生長(zhǎng)發(fā)育不同時(shí)期TST基因表達(dá)量不同，R4期基因表達(dá)量開始下降，R5～R6期表達(dá)水平較低且穩(wěn)定，R6～R7期表達(dá)量開始上升，可能為糖在大豆種子中大量積累時(shí)期，R7～R8期基因表達(dá)量急劇下降，主要將大豆中糖轉(zhuǎn)換為蛋白質(zhì)、脂肪及其他物質(zhì)；整體水平為TST2.1表達(dá)量相對(duì)較高。

圖2 5個(gè)GmTST基因在大豆生育期時(shí)期相對(duì)表達(dá)量變化情況Fig.2 Change of relative expression of five GmTST gene during soybean growth period

圖3 5個(gè)GmTST基因在大豆生殖時(shí)期相對(duì)表達(dá)量變化情況Fig.3 Relative expression of five GmTST genes in soybean reproductive period

2.3 GmTST2.1基因的克隆、生物信息分析及功能預(yù)測(cè)

2.3.1 GmTST2.1基因克隆

以Trisol方法提取RNA，去除雜質(zhì)[21]。willimas82葉片提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄后PCR擴(kuò)增，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到長(zhǎng)度為2 260 bp大豆TST2.1基因cDNA全長(zhǎng)序列（見圖4）。將目的基因回收轉(zhuǎn)化后，挑取正確克隆測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中目的序列比對(duì)，測(cè)序基因與目的序列相似度均為100%。

圖4 RNA和PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果Fig.4 Electrophoresis of RNA and production of PCR

2.3.2 GmTST2.1基因生物信息分析及功能預(yù)測(cè)

為進(jìn)一步確定大豆TST2.1蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，分析預(yù)測(cè)編碼氨基酸組成及理化性質(zhì)。表明willimas 82TST2.1基因CDS區(qū)共編碼734個(gè)氨基酸，氨基酸相對(duì)分子質(zhì)量為78 721.36，理論等電點(diǎn)為5.1，總原子數(shù)為11 167，分子式為C3559H5634N912O1029S33。TST基因編碼肽鏈含有20種氨基酸，其中Leu含量最多為94個(gè)，占該基因編碼氨基酸總數(shù)12.80%；Cys和His酸含量最少，各9個(gè)，各占該基因編碼氨基酸總數(shù)1.20%。該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定系數(shù)為41.53，說(shuō)明此蛋白質(zhì)為不穩(wěn)定蛋白[22]；脂溶指數(shù)為107.04，GRAVY值為0.346，說(shuō)明此蛋白為疏水性蛋白質(zhì)。用Hphob./Kyte＆Doolittle算法分析氨基酸序列親水性與疏水性（見圖5），負(fù)分值氨基酸少于正分值氨基酸，即親水性小于疏水性，表明該蛋白為疏水性蛋白。利用TMHMM Server v.預(yù)測(cè)該基因編碼蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖6所示，GmTST2.1蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為兩端各含有一1個(gè)疏水區(qū)和1個(gè)中間親水區(qū)，疏水區(qū)由6個(gè)跨膜折疊組成。GmTST2.1編碼蛋白有典型N端跨膜結(jié)構(gòu)域-中間胞質(zhì)區(qū)-C端跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域特征，中間胞質(zhì)區(qū)長(zhǎng)度約為250個(gè)氨基酸。

圖5 肽鏈中疏水性與親水性氨基酸位置分布Fig.5 Hydrophobic and hydrophilic amino acids in peptide chains

圖6 GmTST2.1基因編碼蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)特征預(yù)測(cè)Fig.6 Prediction of transmembrane structural characterization of GmTST2.1 gene encoding proteins

使用SOPMA與PSIPRED V3.3工具分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)（見圖7），結(jié)果表明，willimas82 TST2.1蛋白質(zhì)主要由α-螺旋、無(wú)規(guī)則卷曲和片層結(jié)構(gòu)組成，其中α-螺旋占比約為34.47%，片層結(jié)構(gòu)約占22.62%，β-轉(zhuǎn)角約占10.08%，無(wú)規(guī)則卷曲約占32.83%。通過SWISS-MODEL在線軟件，預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果與二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致，進(jìn)一步驗(yàn)證該蛋白結(jié)構(gòu)（見圖8）。

圖7 GmTST2.1蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.7 Secondary structure of GmTST2.1 protein

圖8 GmTST2.1蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig.8 Three-dimensional structure prediction of GmTST2.1 protein

3 討論與結(jié)論

生物信息學(xué)是全基因組數(shù)據(jù)分析有效工具，廣泛應(yīng)用于多個(gè)基因家族鑒定、基因結(jié)構(gòu)分析與功能預(yù)測(cè)。本研究在大豆基因組相關(guān)網(wǎng)站中鑒定10個(gè)大豆同源TST基因。通過進(jìn)化樹分析大豆、擬南芥和甜菜3個(gè)物種蛋白，結(jié)果顯示8個(gè)TST基因與擬南芥、甜菜TST基因同源性較近，其中大部分大豆TST和擬南芥TST基因親緣關(guān)系更近，與同為雙子葉植物親緣關(guān)系相符[23]。

GmTST基因分析大豆不同生育期不同組織表達(dá)模式結(jié)果表明，TST基因在各時(shí)期各部位表達(dá)量均不同且差異顯著，普遍表現(xiàn)為花器官中表達(dá)量較高，莖和下胚軸中表達(dá)量較低，與Wormit等[8]、李冬霞[11]研究結(jié)果一致。在大豆生殖生長(zhǎng)時(shí)期，隨著大豆籽粒發(fā)育，其糖含量呈先升后降趨勢(shì)，與侯金鋒[24]研究結(jié)果一致。各基因表達(dá)量在R6～R7期達(dá)最大值，推測(cè)此時(shí)為大豆儲(chǔ)存糖最多且決定產(chǎn)量時(shí)期[2]。在TST基因整體表達(dá)水平上，GmTST2.1表達(dá)量高于其他4個(gè)基因，說(shuō)明GmTST2.1在大豆TST基因中發(fā)揮重要作用。通過基因克隆獲得大豆TST2.1基因并測(cè)序確定其核昔酸序列。生物信息學(xué)工具分析GmTST2.1基因理化性質(zhì)、氨基酸親疏水性、蛋白結(jié)構(gòu)等，發(fā)現(xiàn)GmTST2.1基因編碼734個(gè)氨基酸，為等電點(diǎn)5.1不穩(wěn)定蛋白，其蛋白結(jié)構(gòu)特點(diǎn)為兩端各含一個(gè)疏水區(qū)和一個(gè)中間親水區(qū)，疏水區(qū)由6個(gè)跨膜折疊組成，有典型N端跨膜結(jié)構(gòu)域-中間胞質(zhì)區(qū)-C端跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域特征，與擬南芥[8]、蘋果[25]和葡萄[26]等植物預(yù)測(cè)TST蛋白跨膜區(qū)為11，氨基酸長(zhǎng)度大于700一致，推測(cè)該蛋白與擬南芥、甜菜等中TST蛋白功能類似，在調(diào)節(jié)控制產(chǎn)量方面具有重要作用。本研究結(jié)果為大豆高產(chǎn)基因工程研究提供重要基因資源，為深入研究TST基因參與糖轉(zhuǎn)運(yùn)分子機(jī)理提供依據(jù)?？寺～@得GmTST2.1基因，對(duì)開展大豆新品種分子育種研究具有參考價(jià)值。

[1] 戚繼艷,陽(yáng)江華,唐朝榮.植物蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因與功能[J].植物學(xué)通報(bào),2007,24(4):532-543.

[2] 苗以農(nóng).大豆產(chǎn)量的形成和光合作用[J].植物生理學(xué)通訊,1997,(6):468.

[3] 劉長(zhǎng)鍇,李彥生,涂冰潔,等.鉀肥施用對(duì)菜用大豆生殖生長(zhǎng)期可溶性糖含量及產(chǎn)量的影響[J].大豆科學(xué),2016,35(2):270-274.

[4] Mamun E A,Alfred S,Cantrill L C,et al.Effects of chilling on male gametophyte development in rice[J].Cell Biology International,2006,30(7):583-591.

[5] Riesmeier J W,Willmitzer L,Frommer W B.Evidence for an essential role of the sucrose transporter in phloem loading and assimilate partitioning[J].The EMBO Journal,1994,13(1):1-7.

[6] Gottwald J R,Krysan P J,Young J C,et al.Genetic evidence for the in planta role of phloem-specific plasma membrane sucrose transporters[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2000,97(25):13979-13984.

[7] Linka N,Weber A P M.Intracellular metabolite transporters in plants[J].Molecular Plant,2010,31:21-53.

[8] Wormit A,Trentmann O,Feifer I,et al.Molecular identification and physiologicl characterization of a novel monosaccharide transporter from Arabidopsis involved in vacuolar sugar transport[J].Plant Cell,2006,18(12):3476-3490.

[9] Wingenter K,Schulz A,Wormit A,et al.Increased activity of the vacuolar monosaccharide transporter TMT1 alters cellular sugar partitioning,sugar signaling,and seed yield in Arabidopsis[J].Plant Physiol,2010,15:665-677.

[10] Jung B,Ludewig F,Schulz A,et al.Identification of the transporter responsible for sucrose accumulation in sugar beet taproots[J].Nature Plants,2015,1(1):14001.

[11] 李冬霞.蘋果果糖積累相關(guān)基因MdTSTl和MdFK2啟動(dòng)子功能鑒定及其轉(zhuǎn)錄因子篩選[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2016.

[12] 任毅.西瓜果實(shí)含糖量QTL定位及糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因功能初析[D].北京:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2016.

[13] 朱延明,朱毅,端木慧子,等.大豆GmUGD基因家族生物信息學(xué)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,46(9):23-29.

[14] Gasteiger E,Hoogland C,Gattiker A,et al.Protein identification and analysis tools on the ExPASy server[M].Clifton:Humana Press,2005:571-607.

[15] 趙艷,翟瑩,宮國(guó)強(qiáng),等.大豆PM34基因生物信息學(xué)預(yù)測(cè)及表達(dá)分析[J].廣西植物,2016,36(10):1220-1224.

[16] 于以成,潘校成,徐夢(mèng)潔,等.大豆再生相關(guān)基因GmRUB1的克隆及表達(dá)分析[J].基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué),2016,35(12):3465-3473.

[17] 武小霞,王敏,陳慶山,等.大豆再生相關(guān)基因GmLEC的克隆及生物信息學(xué)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2015,46(4):1-9.

[18] Kushwaha H,Gupta S,Singh V K,et al.In silico characterization and prediction of three dimensional structure of SbDofl,SbDof19,SbDof23 and SbDof24 proteins from Sorghum[Sorghum bicolor(L)Moench][J].Molecular Biotechnol,2013,54(1):1-12

[19] Paterson A H,Wang X,Tang H,et al Synteny and genomic rearrangements[J].Plant Genome Diversity,2012,1:95～207.

[20] 李朋朋,葉嘉,付偉,等.梨PbChiⅡ基因的克隆及熒光定量表達(dá)分析[J].北方園藝,2017,(17):52-60.

[21] 王勇,韋賀遠(yuǎn),劉彬昕,等.洋蔥成花素同源基因AcLFT3的克隆與表達(dá)分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2014,45(9):40-46.

[22] Guruprasad K,Reddy B V B,Pandit M W.Correlation between stability of a protein and its dipeptide composition:A novel approach for predicting in vivo stability of a protein from its primary sequence[J].Protein Eng,1990,4(2):155-161.

[23] 王茂,石永春,劉全軍,等.不同煙草中谷氨酰胺合成酶2基因的生物信息學(xué)分析[J].生物技術(shù)通訊,2009,20(2):199-201.

[24] 侯金鋒.大豆鮮籽粒蔗糖含量的研究及糖代謝相關(guān)基因的克隆與功能分析[D].南京:南京農(nóng)業(yè)大學(xué),2012.

[25] 馬新立.蘋果MdTMTs基因的表達(dá)分析、克隆及其功能的初步鑒定[D].楊凌:西北農(nóng)林科技大學(xué),2014.

[26] Afoufa-Bastien D,Medici A,Jeauffre J,et al.The Vitis vinifera sugar transporter gene family:Phylogenetic overview and macroarray expression profiling[J].BMC Plant Biology,2010(10):22.