CSP對改善小鼠睡眠功能的研究

楊文彬，陳 磊，王 美，趙靜宇，史向華，薛潤苗，郭素萍

（山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西太原030006）

隨著社會的高速發(fā)展，生活節(jié)奏加快，工作壓力增高，失眠現(xiàn)象常有發(fā)生，成為許多人的困擾，給生活和工作帶來不便，甚至誘發(fā)其他疾病的發(fā)生，引起人們高度關(guān)注［1］。當前在臨床上治療睡眠障礙主要依賴于鎮(zhèn)靜催眠類藥物，但長期服用所伴隨產(chǎn)生的毒副作用對患者造成潛在危害［2］。所以，從中醫(yī)藥寶庫中研發(fā)改善睡眠功能的相關(guān)產(chǎn)品備受關(guān)注，意義重大。

山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院生物工程室長期致力于冬蟲夏草菌絲的相關(guān)研究，積累了豐富經(jīng)驗［3-5］，課題組前期以冬蟲夏草、酸棗仁、茯苓提取物為主要原料，結(jié)合中醫(yī)理論及前期基礎(chǔ)研發(fā)配置成中藥復(fù)方（簡寫為CSP）。本實驗旨在對CSP改善睡眠功能進行初步評價，為進一步深入研究及開發(fā)相關(guān)藥品、保健品奠定科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 昆明種小鼠，雄性，清潔級，18～22 g，動物許可證號：SCXK（軍）2012-0004。實驗動物使用許可證書編號：SYXK（晉）2017-0001。動物飼養(yǎng)12 h晝夜節(jié)律光照，溫度22℃～26℃，濕度40%～70%。飼料由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，許可證號為SCXK（京）2014-0010。

1.1.2 藥品與試劑 受試物以冬蟲夏草、酸棗仁、茯苓提取物為主要原料配置而成（文中簡寫為CSP），本受試物由山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院生物工程實驗室制備（樣品為棕黃色液體，流動性良好，以蟲草含量計算，濃度為0.125 g/mL）；戊巴比妥鈉（pentobarbital sodium salt Merck：P11011）；巴比妥鈉（分析純，批號：20170221）；氯化鈉注射液（石家莊制藥四廠，國藥準字H13023200）。

1.2 實驗方法

本實驗參照《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范2003》與《實驗藥理方法學(xué)》（人民衛(wèi)生出版社，第4版），對CSP進行改善睡眠功能實驗評價。

本研究設(shè)計3批實驗，實驗一批進行直接睡眠實驗和延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗，實驗二批進行戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗，實驗三批進行巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗。實驗結(jié)果測定在24℃～25℃安靜環(huán)境下進行。

1.2.1 分組與給藥 每批實驗均設(shè)CSP高、中、低3個劑量組和1個空白對照組，按隨機數(shù)字表法隨機分組。人用劑量為每日2.5 g/60 kg，即0.042 g/kg（以蟲草含量計算）。高、中、低劑量組分別每天灌胃劑量為人用劑量30倍（1.26 g/kg）、20倍（0.84 g/kg）、10 倍（0.42 g/kg），給藥30 d。小鼠灌胃體積為20 mL/kg，戊巴比妥鈉和巴比妥鈉腹腔注射劑量為10 mL/kg。

1.2.2 直接睡眠實驗 觀察受試組動物給予受試樣品，對照組給予同體積溶劑后，是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。睡眠以翻正反射消失為指標。當小鼠置于背臥位時，能立即翻正身位。如超過60 s不能翻正者，即認為翻正反射消失，進入睡眠。翻正反射恢復(fù)即為動物覺醒，翻正反射消失至恢復(fù)這段時間為動物睡眠時間，記錄空白對照組與受試樣品組入睡動物數(shù)及睡眠時間［6］。

1.2.3 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗 為確定戊巴比妥鈉最小閾上催眠劑量與最大閾下催眠劑量，以同一批次同一飼養(yǎng)環(huán)境小鼠進行預(yù)實驗。取40只小鼠，按體質(zhì)量隨機分成4組，每組10只，按照體質(zhì)量分別腹腔注射25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg戊巴比妥鈉溶液，記錄小鼠30 min內(nèi)入睡發(fā)生率［7］。其中，動物入睡發(fā)生率100%，但又不使動物睡眠時間過長的戊巴比妥鈉劑量作為最小閾上劑量；動物入睡發(fā)生率10%～20%的戊巴比妥鈉劑量作為最大閾下劑量。動物末次給藥與應(yīng)用給予溶劑及高、中、低CSP 1 h后，給各組動物腹腔注射戊巴比妥鈉最小閾上催眠劑量，注射量為0.1 mL/10 g，以翻正反射消失為指標，觀察受試樣品能否延長戊巴比妥鈉睡眠時間。

1.2.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗 動物末次給予溶劑及高、中、低CSP 1 h后，各組動物腹腔注射戊巴比妥鈉最大閾下催眠劑量，記錄30 min內(nèi)入睡動物數(shù)（翻正反射消失達1 min以上者）。

1.2.5 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗 做正式實驗前先進行預(yù)實驗，確定動物100%入睡，但又不使睡眠時間過長的巴比妥鈉的最小閾上劑量（200～300 mg/kg），用此劑量正式實驗［8］。動物末次給予溶劑及高、中、低CSP 10～20 min后，給各組動物腹腔注射巴比妥鈉，注射量為0.2 mL/20 g，以翻正反射消失為指標，觀察受試樣品對巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

用SPSS17.0軟件統(tǒng)計處理。睡眠時間與睡眠潛伏期為計量資料，采用方差分析，方差齊，計算F值。對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進行適當?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達到正態(tài)分布或方差齊的目的，改用秩和檢驗進行統(tǒng)計。入睡動物數(shù)為計數(shù)資料，用χ2檢驗。

2 結(jié)果

2.1 直接睡眠實驗

連續(xù)給予 1.26 g/kg、0.84 g/kg、0.42 g/kg 劑量的受試物及溶劑30 d后，觀察60 min內(nèi)小鼠的活動情況，在此期間各組動物均未見翻正反射消失，且行為活動正常。說明CSP沒有直接催眠的功能。

2.2 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗

閾劑量篩選：不同劑量（25 mg/kg、30 mg/kg、35 mg/kg、40 mg/kg）戊巴比妥鈉使小鼠30 min內(nèi)的入睡發(fā)生率分別為20%、30%、80%、100%。根據(jù)實驗結(jié)果，確定戊巴比妥鈉最大閾下催眠劑量為25 mg/kg，最小閾上催眠劑量為40 mg/kg。CSP對延長戊巴比妥鈉睡眠時間的影響見表1、圖1。中劑量和高劑量CSP能明顯延長小鼠睡眠時間，與對照組對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表1 CSP對延長戊巴比妥鈉睡眠時間的影響 （±s）

表1 CSP對延長戊巴比妥鈉睡眠時間的影響 （±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.01

組別 劑量（m g/k g） n 睡眠時間（s）對照組 0 1 2 7 8 5.0 8±2 2 9.7 1低劑量組 0.4 2 1 2 8 3 8.9 2±2 0 9.4 7中劑量組 0.8 4 1 2 1 2 4 2.0 8±2 5 1.6 2 1）高劑量組 1.2 6 1 2 1 1 6 5.9 2±2 8 8.8 5 1）

圖1 CSP對延長戊巴比妥鈉睡眠時間的影響

2.3 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗

連續(xù)給予高、中、低劑量的受試物，小鼠睡眠發(fā)生率與對照組比較均有增加趨勢，但用χ2檢驗計算得出差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)果見表2。

表2 CSP對閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠發(fā)生率的影響 （±s）

表2 CSP對閾下劑量戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠發(fā)生率的影響 （±s）

組別 n 入睡動物數(shù) 入睡動物發(fā)生率（%）對照組 1 5 2 1 3.3 0低劑量組 1 4 2 2 1.4 0中劑量組 1 5 3 2 0.0 0高劑量組 1 4 3 1 4.3 0

2.4 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗

用相同批次、相同飼養(yǎng)環(huán)境小鼠進行預(yù)實驗，確定動物100%入睡，但又不使睡眠時間過長的巴比妥鈉的劑量，即最小閾上催眠劑量為300 mg/kg。

對照組及低、中、高劑量樣品組動物睡眠潛伏期見表3、圖2。進一步兩兩比較得出，低劑量動物睡眠潛伏期與對照組相比均值降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；中劑量組和高劑量組的動物睡眠潛伏期與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。

表3 CSP對巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響 （±s）

表3 CSP對巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響 （±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.01

組別 劑量（m g/k g） n 睡眠潛伏期（s）對照組 0 1 4 1 8 4 5.0 7±3 2 6.9 0低劑量組 0.4 2 1 4 1 6 7 7.8 6±5 8 9.5 5中劑量組 0.8 4 1 2 1 3 3 9.7 5±3 8 6.9 9 1）高劑量組 1.2 6 1 4 1 2 3 8.5 7±3 8 9.0 2 1）

3討論

圖2 CSP對巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響

本文通過對CSP改善睡眠功能的研究，結(jié)果表明，CSP沒有明顯直接催眠作用，中劑量組和高劑量組均能明顯延長戊巴比妥鈉睡眠時間和巴比妥鈉睡眠潛伏期時間（P＜0.01），根據(jù)《保健食品檢驗與評價技術(shù)規(guī)范》可說明CSP具有改善睡眠功能的作用，可作為進一步開發(fā)理論依據(jù)。

本次實驗研究的受試物CSP中冬蟲夏草、酸棗仁、茯苓為主要原料，吳垠等［9-10］通過光電法對正常小鼠自主活動的影響、延長戊巴比妥鈉睡眠時間和戊巴比妥鈉睡眠時間閾下劑量催眠實驗等，進行了蟲草菌粉有效部位的藥效研究，并采用RP-HPLC熒光檢測法測定小鼠腦內(nèi)5-HT、5-HIAA、DA、NE等單胺類神經(jīng)遞質(zhì)的含量變化，探討蟲草菌粉有效部位鎮(zhèn)靜催眠的機制。結(jié)果表明蟲草菌粉有效部位有明顯減少正常小鼠自主活動、顯著延長戊巴比妥鈉睡眠時間和戊巴比妥鈉睡眠時間閾下劑量催眠作用，蟲草菌粉有效部位可顯著降低小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE和DA的含量；有鎮(zhèn)靜和改善睡眠作用，其作用機制可能與降低小鼠腦內(nèi)單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE和DA的含量有關(guān)。徐煜彬等［11］評價茯苓及其拆分組分的活性，采用東莨菪堿造成小鼠記憶障礙并應(yīng)用Morris水迷宮實驗，觀察茯苓及其組分對學(xué)習(xí)記憶的影響，同時應(yīng)用抖籠法及戊巴比妥鈉協(xié)同催眠實驗來觀察茯苓及其組分的鎮(zhèn)靜催眠作用，顯示茯苓可改善小鼠學(xué)習(xí)記憶能力且具有鎮(zhèn)靜催眠作用。金陽等［12］以酸棗仁湯對失眠大鼠睡眠周期的影響進行研究，表明酸棗仁湯對電刺激所致失眠大鼠的睡眠周期有影響，且隨著劑量的變化作用不同。

本實驗初步驗證CSP改善睡眠的藥理作用，為進一步闡明該中藥復(fù)方治療失眠的理論與技術(shù)的科學(xué)內(nèi)涵提供了科學(xué)數(shù)據(jù)。

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