絲素/明膠復(fù)合材料的比例對(duì)小鼠止血性能的影響

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(浙江理工大學(xué)浙江省絲纖維材料和加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，杭州 310018)

0 引 言

自人類(lèi)在地球上出現(xiàn)以來(lái)，大量出血而導(dǎo)致的死亡，是縮短人類(lèi)平均壽命的主要原因之一。在士兵受傷、手術(shù)中病人意外出血、交通事故導(dǎo)致人員受傷等情況下，如果止血不及時(shí)，很有可能會(huì)造成非常嚴(yán)重的后果[1]。目前研究比較多的止血材料有殼聚糖、海藻酸鈉、多孔沸石、纖維原蛋白等，關(guān)于新型止血材料的研究是當(dāng)前一個(gè)非常熱門(mén)的話題。

絲素蛋白是蠶絲的主要成分，約占總質(zhì)量的75%。絲素蛋白作為一種天然大分子，不僅具有人體所必需的多種氨基酸，對(duì)機(jī)體無(wú)毒性，無(wú)致敏性和刺激作用，而且可大部分被生物體所降解，因此其在生物醫(yī)學(xué)中被廣泛應(yīng)用，如骨組織修復(fù)、藥物載體、傷口敷料等[2-4]。之前已有研究表明絲素蛋白具有一定的止血作用，但與殼聚糖、多孔沸石等止血材料相比，止血時(shí)間過(guò)長(zhǎng)[5-6]。

明膠也是一種天然高分子化合物，主要由動(dòng)物的膠原蛋白部分水解而來(lái)。明膠的應(yīng)用十分廣泛，在食品工業(yè)、醫(yī)藥領(lǐng)域、制造業(yè)等均可見(jiàn)到。在醫(yī)藥領(lǐng)域，明膠是被人們較早發(fā)現(xiàn)具有止血功能的材料[7]，明膠海綿已被普遍地應(yīng)用于臨床。

本文將脫膠后的絲素蛋白溶液與明膠溶液按一定比例進(jìn)行共混，冷凍干燥制得絲素/明膠復(fù)合止血材料，并與純絲素蛋白材料進(jìn)行對(duì)比研究。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

蠶繭(產(chǎn)自浙江省湖州地區(qū))；明膠(分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；無(wú)水氯化鈣(分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司)；無(wú)水乙醇(分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司)；無(wú)水碳酸鈉(分析純，杭州高晶精細(xì)化工有限公司)；自制去離子水；透析袋(截留分子質(zhì)量8kD)；明膠海綿(桂林?？瞪t(yī)療器械有限公司)；抗凝劑(3.8%檸檬酸鈉溶液)；聚乙二醇(分析純，分子量10000，國(guó)藥化學(xué)集團(tuán)試劑有限公司)；新鮮兔血(含抗凝劑)；健康成年SD大鼠若干只(浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，性別不限，質(zhì)量為260 g±20 g)。

1.2 絲素/明膠復(fù)合材料的制備

將適量去蛹蠶繭置于體積為1 L、質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的Na2CO3溶液，在溫度為98 ℃的水浴中加熱3 h，得到去除絲膠的蠶絲。采用濃度為0.5%苦味酸胭脂紅對(duì)絲素的脫膠程度進(jìn)行檢驗(yàn)，用去離子水對(duì)完全脫膠后的絲素進(jìn)行清洗，并置于溫度為80 ℃烘箱中，直至烘干。將適量烘干后的絲素置于CaCl2/C2H5OH/H2O摩爾比為1∶2∶8的三元體系溶液其中，在88 ℃的水浴中加熱3 h，得到絲素蛋白溶液。對(duì)絲素蛋白溶液進(jìn)行減壓過(guò)濾，去除不溶性雜質(zhì)，得到較為純凈的絲素蛋白溶液。再將過(guò)濾所得的溶液裝入截留分子質(zhì)量為8kD的透析袋中，并放置于去離子水中進(jìn)行透析，透析時(shí)間為72 h，每隔12 h對(duì)所用去離子水進(jìn)行更換。將透析的溶液連同透析袋放入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%的聚乙二醇(分子量10000)溶液中一段時(shí)間，濃縮得到質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的絲素溶液。另配制質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的明膠溶液：將適量明膠置于一定量去離子水中，并在60 ℃的水浴中加熱攪拌得到透明澄清的明膠溶液。將絲素溶液和明膠溶液分別按質(zhì)量比10∶0、9∶1、8∶2、7∶3、6∶4的比例混合，充分?jǐn)嚢?。再將交?lián)后的溶液倒入培養(yǎng)皿中，放入溫度為-80 ℃的超級(jí)低溫冰箱，冰凍12 h。最后將其放入溫度為-80 ℃的冷凍干燥機(jī)中72 h，得到絲素/明膠復(fù)合止血材料。

1.3 絲素/明膠復(fù)合材料的結(jié)構(gòu)表征

利用場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡(FESEM,ULTRA55,Carl Zeiss Jena)觀察止血材料的縱截面的表面形貌，測(cè)試時(shí)的工作電壓為3.0 kV，測(cè)試模式為SE2。利用傅里葉變換紅外光譜儀(Nicolet 5700，Thermo Electron)測(cè)定止血材料的紅外光譜，選擇KBr壓片法進(jìn)行測(cè)試，測(cè)試時(shí)掃描范圍為4000～400 cm-1掃描次數(shù)為128次，分辨率為4 cm-1。

1.4 絲素/明膠復(fù)合材料止血性能測(cè)試

1.4.1 凝血指數(shù)(BCI)測(cè)試

根據(jù)Shih等的研究[8]，凝血指數(shù)(BCI)可用來(lái)表征止血材料的止血效果。取新鮮兔血若干毫升并加入抗凝劑(體積比為9∶1)，并配置質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2 mol/L的氯化鈣溶液靜置。稱(chēng)取100 mg止血材料于燒杯并在37 ℃環(huán)境中預(yù)熱5 min。然后加入0.10 mL抗凝兔血，同時(shí)加入0.02 mL氯化鈣溶液，再將燒杯置于37 ℃環(huán)境下5 min。之后加入25.00 mL去離子水，再于37 ℃環(huán)境下放置5 min。最后取0.20 mL上層清液，用可見(jiàn)光分度計(jì)(波長(zhǎng)540 nm)測(cè)試吸光度(abs)值。測(cè)試時(shí)，設(shè)置空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組(明膠海綿)，每個(gè)樣品重復(fù)測(cè)試6次后取平均值。BCI按式(1)計(jì)算，一般來(lái)說(shuō)，BCI的數(shù)值越小，表示止血材料的止血效果越好。

(1)

1.4.2 凝血時(shí)間測(cè)試

各組材料的凝血時(shí)間采用Behrens等[9]研究的方法進(jìn)行測(cè)定。將48孔板放置于37 ℃恒溫水浴中，然后稱(chēng)取50 mg止血材料置于離心管中，于37 ℃預(yù)熱5 min后依次加入0.50 mL抗凝兔血和0.1 mL 0.2 mol/L氯化鈣溶液。每隔15 s傾斜離心管，觀察血液的凝固的程度，直至血液不流動(dòng)為止，記錄凝血時(shí)間。其中，空白對(duì)照組不加止血材料，只加入氯化鈣溶液，陽(yáng)性對(duì)照組加入相同質(zhì)量的明膠海綿和氯化鈣溶液。測(cè)試時(shí)，每組材料重復(fù)3次平行實(shí)驗(yàn)并取平均值。

1.4.3 活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)和凝血酶原時(shí)間(PT)測(cè)定

活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)和凝血酶原時(shí)間(PT)是臨床上用來(lái)判斷凝血機(jī)理的兩個(gè)重要指標(biāo)[10]。APTT用來(lái)測(cè)試內(nèi)源性凝血，PT用來(lái)測(cè)試外源性凝血。將0.05 mL的貧血小板血漿和APTT試劑混合于試管中，并在37 ℃的水浴中放置5 min后再將待測(cè)試樣(比例不同的各組止血材料和陽(yáng)性對(duì)照組明膠海綿)和0.05 mL氯化鈣溶液(濃度為0.2 mol/L)加入于試管中，用全自動(dòng)凝血分析儀測(cè)試反應(yīng)時(shí)間。每組材料重復(fù)三次并取平均值。PT的測(cè)試方法與APTT的測(cè)試方法類(lèi)似。

1.4.4 血小板吸附率測(cè)定

取1.80 mL抗凝兔血于離心管并加入200 mg止血材料，空白對(duì)照組不加入任何物質(zhì)，陽(yáng)性對(duì)照組加入200 mg明膠海綿。在37 ℃恒溫水浴中放置10 min。再將血液離心(1000 r/min)5 min，取上層清液(富血小板血漿)，用五項(xiàng)血球儀測(cè)試血漿中的血小板數(shù)目[11]。按式(2)計(jì)算血小板吸附率：

血小板吸附率/%=

(2)

1.4.5 大鼠斷尾止血實(shí)驗(yàn)

將麻醉后的大鼠放置于實(shí)驗(yàn)操作臺(tái)，在距離大鼠尾巴尖端5 cm處用手術(shù)刀將尾巴切斷。用濾紙吸去第一滴流出的血液，并將1 cm×1 cm大小的止血材料覆蓋于傷口處，另外在尾巴與實(shí)驗(yàn)臺(tái)面中間放置一張濾紙，同時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)。每隔30 s更換濾紙，并觀察出血狀況，當(dāng)沒(méi)有血液滴到濾紙上時(shí)，即為止血完畢，記錄出血時(shí)間[12]。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 19.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，采用x±s表示結(jié)果。p<0.05時(shí)數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 絲素/明膠復(fù)合止血材料的微觀形貌和結(jié)構(gòu)分析

2.1.1 絲素/明膠復(fù)合止血材料的微觀結(jié)構(gòu)分析

圖1是純絲素止血材料和絲素/明膠復(fù)合止血材料的縱截面FESEM圖像，從圖中可以發(fā)現(xiàn)絲素/明膠復(fù)合止血材料為層狀多孔結(jié)構(gòu)，而純絲素止血材料并不具備此結(jié)構(gòu)。另外，隨復(fù)合止血材料中明膠比例的增加，層狀多孔結(jié)構(gòu)更加明顯，如圖1(b)-(e)所示。

圖1 絲素/明膠復(fù)合止血材料的縱截面FESEM照片

2.1.2 絲素明膠復(fù)合止血材料的FTIR圖譜

圖2為三種止血材料的紅外光譜圖。由圖2可以發(fā)現(xiàn)，純絲素蛋白在1645、1537、1240 cm-1出現(xiàn)三個(gè)吸收峰，依次對(duì)應(yīng)酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ鍵。明膠的酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ、酰胺Ⅲ出現(xiàn)在1643、1548、1240 cm-1，而絲素/明膠復(fù)合止血材料的紅外光譜圖中這三個(gè)吸收峰的位置分別為1647、1533、1240 cm-1。與純絲素蛋白、明膠止血海綿相比，絲素和明膠復(fù)合后的材料沒(méi)有生成新的化學(xué)鍵，這說(shuō)明絲素和明膠是物理共混。

圖2 各組止血材料的紅外光譜

2.3.1 凝血指數(shù)(BCI)

圖3為各組別不同比例共混止血材料的BCI值。從圖3中可知，與空白對(duì)照組、純絲素蛋白組(BCI為71.90%±0.59%)相比，各組分絲素/明膠復(fù)合止血材料的BCI值顯著減小。絲素明膠質(zhì)量比為9∶1、8∶2、7∶3和6∶4四組的BCI值分別為47.20%±0.65%、37.30%±0.69%、34.30%±0.96%和35.90%±0.46%。明膠海綿組的BCI值為87.50%±1.18%。隨著止血材料中明膠比例增加，BCI值減小，止血效果增強(qiáng)，但當(dāng)明膠比例過(guò)大時(shí)，BCI值反而增大，止血效果減弱。同時(shí)絲素明膠質(zhì)量比為7∶3時(shí)凝血指數(shù)達(dá)到最小值，優(yōu)于其它各實(shí)驗(yàn)組。結(jié)果表明將明膠與絲素蛋白進(jìn)行共混得到止血材料的止血效果顯著增強(qiáng)，優(yōu)于純絲素蛋白和明膠海綿。這可能是因?yàn)橹苽涞玫降闹寡牧暇哂袑訝疃嗫捉Y(jié)構(gòu)，可使紅細(xì)胞填塞其中，進(jìn)而使BCI值減小，止血性能增強(qiáng)。

圖3 各組止血材料凝血指數(shù)(BCI)

2.3.2 凝血時(shí)間分析

圖4為不同比例絲素/明膠共混止血材料的凝血時(shí)間柱狀圖。如圖4所示，不同比例的止血材料凝血時(shí)間依次為(11.90±0.38)、(10.00±0.42)、(7.60±0.11)、(5.70±0.31)、(5.60±0.14) min，明膠海綿組為(9.90±0.38) min，空白對(duì)照為(14.90±0.38) min。由此可知，與空白對(duì)照組相比，隨著絲素蛋白中加入明膠比例的增加，制備得到的止血材料凝血時(shí)間縮短，止血效果得到了顯著提高，當(dāng)絲素明膠質(zhì)量比大于8∶2時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的凝血時(shí)間開(kāi)始短于明膠海綿組；但當(dāng)明膠比例達(dá)到一定程度后，止血效果不再加強(qiáng)，如比例為6∶4組與7∶3相比，凝血時(shí)間沒(méi)有明顯區(qū)別。絲素/明膠復(fù)合止血材料可以顯著縮短凝血時(shí)間，這可能是因?yàn)槎嗫谞畹闹寡牧嫌休^好的吸水性，使血液的局部濃度增大，加速血液凝固。

圖4 各組止血材料體外凝血時(shí)間

2.3.3 活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)和凝血酶原時(shí)間(PT)分析

圖5為各組止血材料的APTT和PT時(shí)間的折線圖。從圖5中可以發(fā)現(xiàn)隨著止血材料中明膠比例的改變，各組APTT的反應(yīng)時(shí)間發(fā)生變化。各實(shí)驗(yàn)組的APTT值分別為(26.09±0.13)、(20.13±0.11)、(19.86±0.23)、(18.92±0.14) s和(19.01±0.13) s，空白對(duì)照組和明膠海綿組分別為(29.58±0.57) s和(19.53±0.07) s。復(fù)合止血材料可以明顯縮短APTT反應(yīng)時(shí)間，APTT反應(yīng)時(shí)間最短的是7∶3組。與此相反的是，PT的反應(yīng)時(shí)間沒(méi)有明顯的規(guī)律，分別為(11.90±0.19)、(10.95±0.08)、(10.42±0.11)、(10.34±0.07)、(10.76±0.10) s，與明膠海綿組(9.92±0.07) s和空白對(duì)照組(11.10±0.57) s相比，沒(méi)有顯著的區(qū)別。這說(shuō)明，在整個(gè)凝血過(guò)程中，絲素/明膠復(fù)合止血材料是通過(guò)內(nèi)源性凝血來(lái)縮短血液凝固時(shí)間的。這可能是因?yàn)榻z素和明膠可以促進(jìn)血小板釋放凝血因子FⅫ，并將FⅫ激活為FⅫa，進(jìn)而啟動(dòng)整個(gè)內(nèi)源性凝血,縮短凝血時(shí)間。

圖5 各組止血材料APTT和PT的反應(yīng)時(shí)間

2.3.4 血小板粘附率分析

表1是各組止血材料血小板粘附率。從表中可以發(fā)現(xiàn)，當(dāng)絲素明膠質(zhì)量比為6∶4時(shí)，止血材料的粘附率達(dá)到最大值(44%)，但其與7∶3組(43%)和明膠海綿組(41%)相比沒(méi)有明顯差別。血小板的粘附率隨著止血材料中明膠的比例增加而變大，其對(duì)血小板有良好的粘附性，但當(dāng)止血材料中的明膠達(dá)到一定比例時(shí)，粘附率不再顯著增加。這說(shuō)明復(fù)合止血材料可以通過(guò)促進(jìn)血小板的聚集，加速血栓的形成，縮短止血時(shí)間。

表1 各組止血材料血小板粘附率

2.3.5 大鼠斷尾實(shí)驗(yàn)分析

圖6是各組大鼠斷尾實(shí)驗(yàn)的止血時(shí)間，從圖中發(fā)現(xiàn)絲素明膠質(zhì)量比為7∶3的止血材料具有良好的止血效果，大鼠出血時(shí)間最短(5.50±0.46) min，止血性能明顯優(yōu)于明膠海綿組(9.60±0.42) min和空白對(duì)照組(14.50±0.43) min。結(jié)合實(shí)驗(yàn)過(guò)程對(duì)此進(jìn)行分析，認(rèn)為主要原因是當(dāng)止血材料中不加入明膠或者明膠比例較小時(shí)(10∶0、9∶1、8∶2)，止血材料的水溶性較好，容易被血液溶解，無(wú)法緊貼創(chuàng)面，進(jìn)而沒(méi)有較好的止血效果；當(dāng)明膠比例較大時(shí)(6∶4)，止血材料不易溶解于血液，無(wú)法快速的激活啟動(dòng)內(nèi)源性凝血，不能加速血液凝固。因此，比例適當(dāng)?shù)慕z素明膠止血材料，會(huì)部分被血液溶解，有利于緊貼創(chuàng)面，而復(fù)合止血材料的層狀多孔結(jié)構(gòu)又會(huì)使血液的粘度增大，吸附血小板，啟動(dòng)內(nèi)源性凝血，促進(jìn)血塊的形成，進(jìn)而達(dá)到最佳的止血效果。

圖6 各組材料的止血時(shí)間

3 結(jié) 論

本文中將水解后的再生絲素蛋白溶液與明膠按一定比例進(jìn)行共混，冷凍干燥后得到具有良好止血效果的復(fù)合止血材料。經(jīng)過(guò)測(cè)試所得結(jié)論如下：

復(fù)合止血材料與純絲素蛋白材料相比具有更加明顯的多孔結(jié)構(gòu)，容易吸收水分，將使血液的局部濃度增大，加速血液凝固，可推知具有層狀多孔結(jié)構(gòu)的材料具有良好的止血效果。絲素明膠質(zhì)量比為7∶3的材料的凝血指數(shù)(BCI)最小，值為34.30%±0.96%，明顯低于純絲素蛋白組和明膠海綿組。在凝血時(shí)間的測(cè)試中，絲素明膠質(zhì)量比為7∶3的材料止血時(shí)間為(5.70±0.31) min，與絲素明膠質(zhì)量比為6∶4組(5.60±0.14) min的相差不大，但明顯優(yōu)于其他各組。復(fù)合止血材料主要的止血機(jī)理是內(nèi)源性止血，因?yàn)楦鹘M材料的APTT時(shí)間有顯著的變化，最小值為(18.92±0.14) s(絲素明膠質(zhì)量比7∶3)，空白對(duì)照組和明膠海綿組分別為(29.58±0.57) s和(19.53±0.07) s。各組材料的PT值沒(méi)有明顯的區(qū)別。在血小板吸附實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)隨著組分中明膠比例的升高，材料的血小板的吸附性增強(qiáng)，但當(dāng)明膠比例達(dá)到30%后，吸附性不再顯著增強(qiáng)。大鼠斷尾實(shí)驗(yàn)表明，絲素明膠質(zhì)量比為7∶3的止血材料的止血時(shí)間最短，約為(5.50±0.46) min，止血效果優(yōu)于其他組別。

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