瓜蔞種子質(zhì)量標準研究

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(數(shù)字本草中醫(yī)藥檢測有限公司， 河北 保定 071200)

瓜蔞為葫蘆科栝樓屬多年生攀援藤草本植物的果實，植物整株多處部位可入藥，《中華人民共和國藥典2015年版四部(9107通則)》規(guī)定，果實皮入藥為瓜蔞皮，根入藥為天花粉，種子入藥為瓜蔞子。其中瓜蔞子富含油脂、甾醇類、蛋白質(zhì)等成分，具有潤肺化痰，滑腸通便之功效[1]和改善心血管疾病等保健功效[2]，開發(fā)潛力巨大，具有廣闊的市場前景。目前瓜蔞的繁殖方式分為有性繁殖和無性繁殖2種，種植區(qū)多采用無性分根繁殖[3]，然而無性繁殖方式的繁殖系數(shù)低，且種質(zhì)易退化[4]，導致所產(chǎn)的瓜蔞、瓜蔞皮、天花粉等藥材質(zhì)量難以保障，以種子作為栽培材料的有性繁殖方式則無此缺點。因此，開展瓜蔞種子質(zhì)量標準研究不僅有利于生產(chǎn)，對天花粉、瓜蔞子等藥材的質(zhì)量控制也具有重要意義。

目前瓜蔞在全國均有分布，尤以河北安國一帶種植歷史悠久，種植面積廣泛，故本研究以河北安國所產(chǎn)瓜蔞種子為重點，同時包括四川、江蘇、河南等地所產(chǎn)瓜蔞種子。目前關于瓜蔞種子的研究主要集中在萌發(fā)特性[5]及成分分析[6]2個方面，尚未發(fā)現(xiàn)有關瓜蔞種子質(zhì)量標準研究的報道。本研究先采用DNA條形碼技術(shù)首先對收集的種子進行真實性鑒定，然后對12批種子凈度、水分、生活力、發(fā)芽率等指標進行測定并分析，初步制定了瓜蔞種子質(zhì)量標準，為進一步制定瓜蔞種子檢驗及質(zhì)量分級地方標準或國家標準提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本實驗包括19份實驗樣品，其中瓜蔞種子樣品12份，雙邊栝樓(TrichosanthesrosthorniiHarms)的基原植物3份，栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)的基原植物2份，栝樓屬近緣種湖北栝樓(Trichosant

表1 實驗樣品信息表

樣品名稱樣品編號GenBank號來 源瓜蔞種子GLZ01KY987477河北安國藥材市場瓜蔞種子GLZ02KY987478河北安國藥材市場瓜蔞種子GLZ03KY987479河北安國藥材市場瓜蔞種子GLZ04KY987480河北安國藥材市場瓜蔞種子GLZ05KY987481河北安國藥材市場瓜蔞種子GLZ06KY987482河北安國藥材市場瓜蔞種子GLZ07KY987483河北安國藥材市場瓜蔞種子GLZ08KY987484河北安國市祁州鎮(zhèn)西河村瓜蔞種子GLZ09KY987485江蘇宿遷瓜蔞種子GLZ10KY987486江蘇宿遷瓜蔞種子GLZ11KY987487河南沐陽瓜蔞種子GLZ12KY987488四川成都栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)TX01KY987489河南南陽桐柏縣栝樓(TrichosantheskirilowiiMaxim.)TX02KY987490四川成都雙邊栝樓(TrichosanthesrosthorniiHarms)SSN182-1KY987492湖北神農(nóng)架雙邊栝樓(TrichosanthesrosthorniiHarms)SSN182-2KY987493湖北神農(nóng)架雙邊栝樓(TrichosanthesrosthorniiHarms)SSN182-3KY987494湖北神農(nóng)架湖北栝樓(TrichosantheshupehensisC.Y.chengetYueh)HBGL01KY987491湖北武漢王瓜(Trichosanthescucumeroides(Ser.)Maxim.)WG01KY987476江西贛州

heshupehensisC.Y.cheng et Yueh)和王瓜(Trichosanthescucumeroides(Ser.)Maxim.)的種子樣品各1份。用于質(zhì)量標準建立的樣品編號為GLZ 01-12 ，共12批，所有樣本均進行真實性鑒定，樣品信息見表1。

1.2 種子取樣

按照《GB/T3543.2—1995 農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程》中的四分法進行操作，直至獲得測定各項指標所需的種子樣品。

1.3 試驗方法

1.3.1 瓜蔞種子真實性測定

采用DNA條形碼技術(shù)對瓜蔞種子與同屬的近緣種的種子進行真實性鑒別[7-8]。方法如下：

使用天根植物DNA提取試劑盒(DP 305)提取總DNA，再用通用引物ITS 2 2 F-3 R擴增其ITS 2序列，PCR反應體系為25μL，其中2×TaqPCR MasterMix 12.5μL，正反向引物(2.5μmol/L)各1μL，DNA模板約100 ng，其余用滅菌雙蒸水補足25μL。擴增條件見《中華人民共和國藥典2015年版四部(9107通則)》[1]。采用軟件CodonCode Aligner V 4.2.4拼接正反向峰圖，獲得ITS 2間隔區(qū)序列，并將序列提交至GenBank。

登陸GenBank的Nucleotide數(shù)據(jù)庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore)下載栝樓及其近緣種長萼栝樓(TrichosantheslaceribracteaHayata)的ITS 2序列(HE 661336、38)；紅花栝樓(TrichosanthesrubriflosThorel ex Cayla)的ITS 2序列(HE 661372-73、HQ 829639-42)。將所有序列導入軟件MEGA 6分析比對，基于K 2 P模型和自舉檢驗法(1 000次)，構(gòu)建NJ系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.2 瓜蔞種子凈度測定

根據(jù)瓜蔞種子的形態(tài)、色澤、大小特征，參考《國際種子檢驗規(guī)程》中對葫蘆科凈種子的相關規(guī)定[9]，除去雜質(zhì)和其他植物種子，測定凈種子的比例。

1.3.3 瓜蔞種子千粒重測定

采用五百粒法進行測定：從分好的樣品中數(shù)出500粒作為1個重復，每批重復2次，稱重，測得其平均值后乘以2即為瓜蔞種子的千粒重[4]。

1.3.4 瓜蔞種子水分測定

采用高溫烘干法。每批樣品2次重復，樣品量2 g左右(精確至0.001 g)。溫度設定為140～145 ℃，烘干時間為1 h，減少重量的百分率即為瓜蔞種子水分含量。

1.3.5 瓜蔞種子生活力測定

使用TTC法測定瓜蔞種子生活力。將分好的栝樓樣品每份300～500粒，置于30 ℃的蒸餾水中預濕4 h。隨機抽取200粒，分成2組，每組100粒。對種子進行縱切，選留其中較為完整的1/2，浸入0.5%的紅四氮唑溶液中染色8 h[4]。

1.3.6 瓜蔞種子發(fā)芽率測定

采用砂床作為種子萌發(fā)基質(zhì)。選擇大小均勻，直徑為0.05～0.80 mm砂粒，使用前先用蒸餾水沖洗并在140 ℃下干熱滅菌2 h。種子先在室溫浸泡24 h，然后使用40 ℃溫水浸泡4 h。之后使用剪刀或刀片小心去除瓜蔞種子尖端的種皮(劃傷的種子棄去不用)，使胚充分暴露。將處理好的種子置于砂質(zhì)培養(yǎng)基中，上層覆蓋約5 mm的沙粒，并用噴壺澆水，使其含水量在砂床飽和含水量的80%。將3 d內(nèi)無新的種子萌發(fā)的時間作為實驗終點[5]。

圖1 瓜蔞種子及其近緣種的系統(tǒng)聚類樹

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行整理和分析。方差分析采用Duncan法。

2 結(jié)果與分析

2.1 瓜蔞種子真實性測定

基于建樹分析的系統(tǒng)聚類分析是DNA 條形碼鑒別方法中較為直觀地反映物種水平分辨效果的方法，能有效地為不同類群物種鑒定提供依據(jù)。如圖1所示，(T.kirilowii)與雙邊栝樓(T.rosthornii)的序列聚為一支，說明二者的親緣關系較近；栝樓(T.kirilowii)與雙邊栝樓(T.rosthornii)能與其同屬的混偽品聚為不同的分支，說明栝樓(T.kirilowii)與雙邊栝樓(T.rosthornii)能與同屬近緣種王瓜等明顯的區(qū)分開，表明基于ITS 2序列的DNA條形碼技術(shù)能夠準確鑒定瓜蔞種子與其近緣種。

2.2 瓜蔞種子凈度測定

凈度是描述正常種子的重量占供試種子重量的參數(shù)，凈度的高低主要影響機播過程中的種子出苗率，凈度低時會造成田間缺苗斷條，從而影響產(chǎn)量[10]。結(jié)果表明，種子重量增失不足初始重量的5%，凈度分析有效。12批瓜蔞種子凈度很高，均在96%以上，平均值為97.31，95%的置信區(qū)間的上下限分別為97.67%和96.96%，見表2和表5。

2.3 瓜蔞種子千粒重測定

千粒重是以克為單位表示每千粒種子重量的指標。它體現(xiàn)著種子大小和飽滿程度，是檢驗種子質(zhì)量和作物考種的重要內(nèi)容，同時對預測田間產(chǎn)量具有重要意義[11]。本研究測定12批瓜蔞種子中，以四川成都千粒重最大，為223.85 g，與其他處理相比均達到極顯著差異；河南沐陽的最小，為123.75 g，僅占前者的55.28%；河北安國瓜蔞種子千粒重在兩者之間，且各批次間變化幅度較大。12批瓜蔞種子千粒重平均值為181.60，95%的置信區(qū)間的上下限分別為166.44 g和195.37 g，與方差分析中B水平的結(jié)果(179.33～193.60 g)較為接近，詳見表3和表5。因此，瓜蔞種子千粒重的質(zhì)量指標可定為≥180 g，在此標準下，12批瓜蔞種子千粒重的合格率為75%。

表2 瓜蔞種子凈度

編號初始重量(g)凈種子(g)雜質(zhì)(g)破損粒(g)增失重(g)凈度(%)GLZ01249.63243.542.833.150.1197.60GLZ02234.54227.203.064.130.1596.87GLZ03252.47243.105.983.320.0796.93GLZ04251.99245.275.411.260.0597.35GLZ05252.72247.431.763.500.0397.92GLZ06254.37248.363.262.550.2097.71GLZ07248.28244.422.531.300.0398.46GLZ08255.23247.974.172.780.3197.27GLZ09245.35235.924.564.720.1596.22GLZ10260.84254.464.561.720.1097.59GLZ11258.87251.815.241.750.0797.30GLZ12246.33237.663.425.110.1496.54

2.4 瓜蔞種子水分含量測定

水分是用于表達種子干燥程度的指標。水分高低主要受環(huán)境和人為因素影響，可以通過調(diào)整加工方式來改變。在不損害種子活力的前提下，水分含量越低，種子的儲藏性能和壽命越長，因此種子質(zhì)量標準中往往限制最高值[12]。結(jié)果顯示，編號為GLZ 06的瓜蔞種子含水量最低，為5.38%，而編號為GLZ 08的瓜蔞種子水分含量最高，為8.62%，不同批次樣品間水分差異顯著。12批瓜蔞種子水分平均值為6.64%，95%的置信區(qū)間的上下限分別為6.21%、7.09%，與方差分析中B水平的結(jié)果(6.77%～6.97%)較為接近，詳見表4和表5。因此，瓜蔞種子水分的質(zhì)量指標可定為不超過7.0%。在此標準下，12批瓜蔞種子水分的合格率為83%。

表3 瓜蔞種子千粒重

編號千粒重(g)2次重復差數(shù)差數(shù)與平均數(shù)之比(%)GLZ01193.60Bb2.782.87GLZ02179.33Bc2.292.55GLZ03144.58Cd3.524.87GLZ04186.84Bbc4.364.67GLZ05181.98Bbc3.323.65GLZ06191.10Bbc3.303.45GLZ07183.73Bbc3.553.86GLZ08187.59Bbc3.814.06GLZ09185.57Bbc2.632.83GLZ10180.15Bc4.494.98GLZ11124.20De2.123.41GLZ12228.05Aa2.352.06

注：同列大寫字母表示p<0.01水平下的差異顯著性，同列小寫字母表示p<0.05水平下的差異顯著性。下同。

表4 瓜蔞種子水分、生活力、發(fā)芽率檢測

編號水分(%)生活力(%)發(fā)芽率(%)GLZ016.77CDd88Bb41BbGLZ026.38FGf89Bb31BCcGLZ036.98Cc87Bb33BCbcGLZ045.99Hg88Bb35BbcGLZ056.15GHg95Aa65AaGLZ065.38Ih89Bb34BbcGLZ076.97Cc57Cc17DdGLZ088.62Aa95Aa60AaGLZ096.09Hg60Cc21CDdGLZ106.64DEde39Dd16DdGLZ116.47Fef59Cc21CDdGLZ127.31Bb87Bb38Bbc

2.5 瓜蔞種子生活力測定

生活力是表示種子發(fā)芽潛在能力和種胚所具有的生命力的重要指標，尤其對于重度休眠的種子，生活力數(shù)據(jù)可以代替發(fā)芽率使用[13]，研究發(fā)現(xiàn)不同來源瓜蔞種子生活力差異達到極顯著水平，其中編號為GLZ 05的瓜蔞種子生活力最高，達到95.3%，編號為GLZ 10的江蘇宿遷種子生活力最低，僅為48.3%，各批次的瓜蔞種子生活力差異顯著。12批瓜蔞種子生活力平均值為77.67%，95%的置信區(qū)間的上下限分別為67.72%、87.28%，與方差分析中B水平的結(jié)果(68%～87%)較為接近，詳見表4和表5。因此，瓜蔞種子生活力的質(zhì)量指標可定為不低于85%。在此標準下，12批瓜蔞種子生活力的合格率為66.7%。

表5 瓜蔞子各質(zhì)量指標均值統(tǒng)計結(jié)果

質(zhì)量指標均值自助法偏差標準誤差95%置信區(qū)間下限上限凈度97.310.00530.173596.9697.67千粒重181.60-0.21057.2822166.44195.37水分6.64-0.00340.22546.217.09生活力77.670.49674.941967.7287.28發(fā)芽率34.33-0.00514.255126.5943.33除非特別注明,自助法結(jié)果基于1000個樣本量

2.6 瓜蔞種子發(fā)芽率測定

發(fā)芽率是衡量種子是否具有生活力的直接指標，并直接影響種子田間出苗率，對確定種子價格，種子等級劃分具有重要意義。研究結(jié)果顯示，不同批次間種子發(fā)芽率差異達到極顯著水平，同時由于瓜蔞種子的休眠特性[14]，整體發(fā)芽率較低，最高的也僅為65%，最低不足25%。12批瓜蔞種子發(fā)芽率平均值為34.33%，95%的置信區(qū)間的上下限分別為26.59%、43.33%，與方差分析中B水平的結(jié)果(31%～41%)相近，詳見表4和表5。因此，瓜蔞種子發(fā)芽率的質(zhì)量指標可定為不低于30%。在此標準下，12批瓜蔞種子發(fā)芽率的合格率為66.7%。

3 討論與結(jié)論

種子作為中藥材生產(chǎn)的物質(zhì)基礎，其質(zhì)量好壞直接影響到藥材的安全性、穩(wěn)定性和有效性，進而影響整個中醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)的持續(xù)健康發(fā)展[15]，因此建立及推廣藥材種子標準，能有效抑制藥材種子市場亂象，促進中藥材產(chǎn)業(yè)規(guī)范化和標準化[16]。與農(nóng)作物相比，中藥材種子質(zhì)量的研究嚴重滯后，僅人參具有國家標準，黃芪、板藍根、丹參等少數(shù)品種建立了地方標準，但大部分中藥材種子既沒有強制性的國家標準，也缺乏針對性的地方、行業(yè)標準，導致中藥材種子市場種源混亂，新舊種摻雜等亂象[17]。其中，瓜蔞種子質(zhì)量在種植領域尚未發(fā)現(xiàn)國家或地方標準，也未發(fā)現(xiàn)相關文獻報道。

瓜蔞種子常見混偽品有湖北栝樓的種子、王瓜的種子等，其中湖北栝樓廣泛分布于湖北、湖南、四川、山東等地，其種子外觀與正品瓜蔞種子相似難以區(qū)分，但其根部入藥會引起患者嘔吐、惡心等不良反應，因此準確區(qū)分瓜蔞種子及其混偽品對臨床用藥安全具有重要意義[20]。本研究通過DNA條形碼技術(shù)和系統(tǒng)聚類樹的結(jié)合，可將瓜蔞種子、湖北栝樓種子、王瓜種子準確區(qū)分開來，且該技術(shù)要求低、通用性高，同時又能夠避免經(jīng)驗鑒別主觀因素的影響，因此建議采用DNA條形碼技術(shù)對中藥材種子的真實性進行鑒定，確保中藥材種源真實可靠，保障用藥安全[8]。

常規(guī)的種子質(zhì)量檢測包括種子凈度、千粒重、水分、生活力、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢等指標，因本實驗采用了砂質(zhì)培養(yǎng)基未能對發(fā)芽指數(shù)和發(fā)芽勢指標進行檢測。該培養(yǎng)基可以在一定程度上減緩霉菌傳播速度，降低發(fā)霉對種子發(fā)芽率的影響[18-19]，提高種子的發(fā)芽率。

千粒重反映種子貯藏物質(zhì)的多少，種子成熟度和幼苗長勢，對種子質(zhì)量評價具有重要意義[21]；水分主要受人為及客觀因素影響而非種子生物學特性決定，但水分的高低影響種子貯藏和壽命，應作為質(zhì)量評價指標；生活力體現(xiàn)種子萌發(fā)潛力，并可以作為種子發(fā)芽水平的間接評價指標，尤其對于具有休眠特性的種子，通過測定生活力可以快速預知種子的價值[22]；發(fā)芽率可以較為直接的反映種子在田間的出苗狀況，是評價種子質(zhì)量最為重要的指標。因此，參考種子常規(guī)檢測項目選擇千粒重、水分、生活力、發(fā)芽率4項指標對瓜蔞種子質(zhì)量進行評價。

本研究參考其他種子質(zhì)量標準，統(tǒng)計不同產(chǎn)地和來源瓜蔞種子千粒重、水分、生活力，發(fā)芽率4項指標，結(jié)合均值置信區(qū)間和方差分析結(jié)果并以該方差水平下最小值所接近的整數(shù)為依據(jù)，提出瓜蔞種子質(zhì)量標準：千粒重≥180 g，含水量≤7.0%，生活力≥85%，發(fā)芽率≥30%。該標準能有效排除不合格種子，保證用于生產(chǎn)的種子質(zhì)量。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(2015版四部)[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015.

[2]宋振巧,王洪剛,王建華.栝樓的研究進展[J].山東農(nóng)業(yè)科學,2005(5):78-81.

[3]何旦,孫婷,劉鵬.藥用植物栝樓繁殖技術(shù)的研究進展[J].貴州農(nóng)業(yè)科學,2008(4):67-69.

[4]單成鋼,張教洪,朱連先,等.瓜蔞種子質(zhì)量檢驗方法的研究[J].種子,2011,30(5):115-118.

[5]孫婷.瓜蔞種子的休眠特性及促萌措施研究[D].浙江師范大學,2010.

[6]周賜琴.可食用栝樓籽營養(yǎng)成分分析與栝樓籽油O/W微乳液的制備[D].浙江大學,2010.

[7]張該霞.幾種傳統(tǒng)大宗中藥材種子DNA條形碼鑒定[D].山東中醫(yī)藥大學,2016.

[8]張娜娜.藥用植物種子種苗DNA條形碼鑒定與應用[D].北京協(xié)和醫(yī)學院,2016.

[9]國際種子檢驗協(xié)會.1996年國際種子檢驗章程[S].北京:中國農(nóng)業(yè)出版社,1999.

[10]魏良柱.陜西地區(qū)丹參種子質(zhì)量標準研究[D].西北農(nóng)林科技大學,2016.

[11]潘苗,左菲菲,盛繼露,等.南方紅豆杉不同種源種子千粒重、生活力、營養(yǎng)化學成分含量的比較及其與生態(tài)因子的關系[J].植物研究,2016(3):360-367.

[12]賀宇,丁國棟,汪曉峰,等.水分和沙埋對4種沙生植物種子萌發(fā)和出苗的影響[J].中國沙漠,2013(6):1 711-1 716.

[13]周艷玲.防風種子休眠生理與栽培技術(shù)研究[D].東北林業(yè)大學,2009.

[14]孫婷,劉鵬,徐根娣.瓜蔞種子休眠特性分析[J].中國農(nóng)業(yè)科學,2008(12):4 273-4 280.

[15]趙文吉,李敏,黃博,等.中藥材種子種苗市場現(xiàn)狀及對策探討[J].中國現(xiàn)代中藥,2012(3):5-8.

[16]陳千良,石張燕,高揚,等.陜西產(chǎn)杜仲子藥材質(zhì)量標準研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2014(2):289-293.

[17]王進,羅光宏,張文輝,等.鎖陽種子質(zhì)量評價與分級標準研究[J].中草藥,2013(20):2 923-2 928.

[18]韓翠敏,胡庚,武濤,等.不同水體條件和基質(zhì)類型對苦草(VallisneriaspiralisL.)種子萌發(fā)的影響[J].生態(tài)學雜志,2014(6):1 515-1 519.

[19]曹玲玲,甘小洪,何松.不同種源及基質(zhì)對水青樹種子萌發(fā)及幼苗初期生長的影響[J].廣西植物,2012(5):656-662.

[20]郗硯彬,巢志茂,王金.湖北栝樓種子中不皂化物質(zhì)的化學成分研究[J].中國中藥雜志,2007(21):2 262-2 265.

[21]敬勇.大黃種子質(zhì)量與藥材質(zhì)量評價研究[D].成都中醫(yī)藥大學,2013.

[22]丁友芳.紫蘇種子質(zhì)量標準及其醇提物的生物活性研究[D].北京林業(yè)大學,2012.