幾種糯玉米單倍體化學加倍方法的研究

(秦皇島市海港區(qū)農(nóng)業(yè)局， 河北 秦皇島 066000)

糯玉米，即粘玉米，發(fā)源地為中國，是由普通玉米第9號染色體Wx顯性基因突變?yōu)閣x隱性基因而形成的一類特殊玉米類型[1]。糯玉米籽粒中含有糖分、蛋白質(zhì)、多種氨基酸及礦質(zhì)元素，粘滯性和適口性較好，深受人們的關(guān)注和喜愛[2]。我國具有得天獨厚的糯玉米種質(zhì)資源優(yōu)勢，各科研院所、企事業(yè)單位也十分重視糯玉米新品種的選育工作，但是由于缺乏快速的育種技術(shù)手段、異地鑒定方法，造成常規(guī)育種進程止步不前，難以有較大的突破[3-4]。一般而言，我國糯玉米育種家多采用系譜法、回交轉(zhuǎn)育法進行糯玉米新品種的選育，也育成了如京科糯2000等廣泛推崇的新品種[5]，但常規(guī)育種法存在育種周期長、流程繁瑣、育種成本高等諸多問題，不易滿足當前實際商業(yè)化育種的需求。雜交誘導玉米單倍體技術(shù)可大大縮短自交系的選育時間，僅需2代即可獲得純系?，F(xiàn)如今，在普通玉米育種中，單倍體技術(shù)已經(jīng)逐步取代常規(guī)育種技術(shù)而成為主流育種技術(shù)，然而應用于糯玉米育種尚缺乏有效實踐。

單倍體加倍DH(Doubled Haploid)是玉米育種的關(guān)鍵步驟之一[6-8]。一般而言，各育種單位多采用以秋水仙素為主的化學加倍方法進行玉米單倍體的加倍。本試驗基于秋水仙素這一有效的加倍藥劑，通過比較不同加倍方法、秋水仙素濃度、加倍溫度和加倍時間下的糯玉米單倍體加倍效果，為糯玉米DH育種提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 材 料

2015年冬，在海南南繁基地，以糯玉米雜交種西星糯1號、萊農(nóng)糯6號、萬糯2000、豐糯1號、鄭黃糯2號作為誘導基礎(chǔ)材料，以外引系RH 20為父本，進行雜交誘導，收獲籽粒晾干后在雜交當代果穗上根據(jù)籽粒R-nj標記法挑選出糯玉米單倍體籽粒為供試材料。

1.2 方 法

1.2.1 同一秋水仙素濃度不同化學加倍方法的比較

用0.8 mg/mL的秋水仙素+2%DMSO助滲劑對基于5份糯玉米雜交種誘導出來的糯玉米單倍體進行化學加倍處理，加倍方式分別為：浸芽法、浸種法、浸根法，環(huán)境溫度為25 ℃，處理時間為10 h。種植單倍體，授粉后調(diào)查加倍結(jié)果，統(tǒng)計試驗數(shù)據(jù)。

1.2.2 不同濃度和時間處理下的浸根法加倍比較

以源于糯玉米雜交種西星糯1號獲得的糯玉米單倍體為供試材料，當環(huán)境溫度為22 ℃時，采用浸根法處理誘導的單倍體，設(shè)置不同秋水仙素濃度，分別為0.3，0.5，0.7，0.9，1.1 mg/mL，設(shè)置6，10，12 h等3種加倍時間，種植鑒定方法同上。

1.3 統(tǒng)計分析

采用軟件Excel 2013、DPS 7.05進行試驗數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析[10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 同一秋水仙素濃度不同化學加倍方法的比較

將5種化學加倍方法加倍處理5種糯玉米單倍體的統(tǒng)計結(jié)果列于表1。由表1可知，滴心葉法加倍率均值最高，達11.14%；植株注射法加倍率最低，僅為1.62%。利用無重復雙因素方差分析法進行加倍效果的差異性比較，結(jié)果列于表2。由表2可知，加倍方法間達到極顯著水平，品種間未達到顯著水平，這說明加倍方法是影響糯玉米單倍體加倍的重要因素。由表3可知，滴心葉法、浸根、浸種、浸芽的加倍效果明顯，加倍率均高于3%，而植株注射法加倍率較低，低于2%。通過差異顯著性比較可知，上述4種加倍方法極顯著高于植株滴心葉法。5種加倍方法中以滴心葉法最好，加倍效率高于10%，說明此方法較適合糯玉米單倍體的加倍，值得通過擴大種質(zhì)群體進一步實踐。

表1 5種糯玉米單倍體用不同方法處理的加倍率

方法品種名稱西星糯1號萊農(nóng)糯6號萬糯2000豐糯1號鄭黃糯2號浸種4.325.723.322.127.62滴心葉11.728.6212.0212.5210.82浸根5.926.427.226.825.62浸芽3.422.924.625.423.32植株注射1.322.321.420.622.42

表2 方差分析

變異來源平方和自由度均方F值區(qū)組間1.3240.470.26處理間330.36466.2236.11**誤差37.54161.78總變異369.2224

注：“**”表示差異達到極顯著水平。下同。

表3 5種糯玉米單倍體用不同方法處理的加倍率差異顯著性比較

方法平均加倍率(%)5%顯著水平1%極顯著水平滴心葉法11.14aA浸根法6.40bB浸種法4.62bcBC浸芽法3.94cCD植株注射法1.62dD

2.2 西星糯1號在不同濃度、不同時間下的加倍效果

當環(huán)境溫度為22 ℃時，將源于糯玉米雜交種西星糯1號的單倍體在秋水仙素不同濃度、不同加倍時間處理下的滴心葉法加倍效果列于表4。由表4可知，同一處理時間下，在0.3～0.7 mg/mL濃度范圍內(nèi)，均表現(xiàn)出隨著秋水仙素濃度的增加，加倍效果越來越明顯的規(guī)律，但高于0.7 mg/mL濃度后，加倍率反而降低，出現(xiàn)加倍抑制現(xiàn)象。這可能是由于隨著秋水仙素濃度的增加導致單倍體種子內(nèi)酶活性下降，進而出現(xiàn)加倍率降低。由方差分析結(jié)果(表5)可知，不同秋水仙素濃度間、加倍時間之間均達到極顯著差異，說明秋水仙素濃度、加倍時間是影響糯玉米單倍體加倍效果的關(guān)鍵因素。由表6可知，當秋水仙素濃度為0.7 mg/mL時，糯玉米單倍體加倍率均值高達11.00%，極顯著高于其它濃度。當秋水仙素濃度為0.5 mg/mL和0.9 mg/mL時，加倍率均值差異不顯著，加倍率分別為8.60%和6.27%。當秋水仙素濃度為0.3 mg/mL和1.1 mg/mL時，單倍體加倍率均值均表現(xiàn)最低，僅為5.30%和3.27%。由表7可知，加倍時間為10 h時，糯玉米單倍體加倍率均值為7.70%，極顯著高于6 h和12 h的糯玉米單倍體加倍效果，說明加倍時間10 h是糯玉米單倍體加倍的最佳處理時間。

表4 西星糯1號在不同濃度不同時間下的加倍率

濃度(mg/mL)6h10h12h0.33.75.86.40.56.58.510.80.79.712.610.70.94.67.56.71.14.72.62.5

表5 方差分析

變異來源平方和自由度均方F值濃度120.88430.2232.36**時間18.3129.179.77**誤差7.2780.87總變異146.4614

表6 西星糯1號在不同濃度下的加倍率差異顯著性比較

濃度(mg/mL)平均加倍率(%)5%顯著水平1%極顯著水平0.711.00aA0.58.60bB0.96.27cC0.35.30cCD1.13.27dD

表7 西星糯1號在不同處理時間下的加倍率差異顯著性比較

時間(h)平均加倍率(%)5%顯著水平1%極顯著水平107.70aA125.60bB65.16bB

3 結(jié)論與討論

目前，生產(chǎn)上推廣的糯玉米雜交種類型較為單一，抗逆性差，迫切需要通過新技術(shù)、新手段、新方法選育出優(yōu)質(zhì)、粒色佳、果穗均勻、口感更加香甜的糯玉米新品種來滿足多元化的市場需求?；谄胀ㄓ衩着嘤缕贩N的DH育種技術(shù)正逐步應用于糯玉米育種中，日益受到各科研單位、企業(yè)公司的重視[11]。

有效的糯玉米單倍體加倍技術(shù)體系的建立是解決糯玉米單倍體加倍率低的直接措施。才卓等研究表明，不同秋水仙素濃度、處理時間、加倍方法均是影響單倍體加倍效果的重要因素[8]。本研究結(jié)果表明，糯玉米單倍體加倍方法間存在極顯著差異，說明加倍方式是影響糯玉米單倍體加倍的重要因素，這與前人的