辣椒素通過抑制自噬活性抑制實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎

周壽紅，薛瑞瑞，郭瀟瀟，盛思敏，杜 倩，夏嘉輝，肖 婷，林 芬

(南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，湖南 衡陽 421001)

實(shí)驗(yàn)性自身免疫性神經(jīng)炎(experimental autoimmune neuritis, EAN)是一種自身免疫性疾病，是人類吉蘭-巴雷綜合征(Guillain-Barre syndrome, GBS)經(jīng)典的動物模型[1]。EAN病變范圍主要波及周圍神經(jīng)系統(tǒng)的髓鞘和軸索，其主要的病理特征是周圍神經(jīng)和神經(jīng)根髓鞘脫失、軸索變性，神經(jīng)干內(nèi)及神經(jīng)纖維周圍巨噬細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等炎癥細(xì)胞浸潤，屬于神經(jīng)變性疾病[2]。EAN和GBS的發(fā)病機(jī)制還未完全闡明，也缺乏理想的治療手段。

辣椒素(capsaicin)是從茄科植物辣椒中提取的一種生物堿，其化學(xué)名稱為8-甲基-N-草香酸-6-壬烯酰胺。辣椒素是瞬時受體電位通道香草醛亞型-1(transient receptor potential vanilloid type-1, TRPV1)的高選擇性激動劑[3-4]。TRPVl在炎癥的發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，TRPV1激動后能影響P物質(zhì)、降鈣素基因相關(guān)肽、神經(jīng)激肽A等的釋放，發(fā)揮抗炎的作用[5-6]。但是辣椒素對EAN的作用目前還不清楚。自噬是真核生物細(xì)胞中降解和回收利用細(xì)胞內(nèi)的長壽蛋白質(zhì)、生物大分子和受損細(xì)胞器的過程。研究顯示，細(xì)胞自噬參與了多種神經(jīng)變性疾病的發(fā)病機(jī)制[7-8]。因此，本研究建立EAN大鼠模型，觀察辣椒素對EAN的影響，從細(xì)胞自噬的角度探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1藥品與試劑辣椒素由碧云天生物技術(shù)公司提供(批號：P0045)；周圍神經(jīng)髓鞘抗原(P257-81)多肽由上海吉爾生化有限公司提供(批號：2017040317)；完全弗氏佐劑(批號：089M01721C)和雷帕霉素(rapamycin, RAPA,批號：09101748)購自美國Sigma公司；勞克堅牢藍(lán)為上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司產(chǎn)品(批號：DJ548)；兔抗大鼠Beclin-1(批號：sc-58742-R)、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein light chain-3, LC3，批號：sc-47821)、p62(批號：sc-58241)、β-actin(批號：sc-58742-R)單克隆抗體和相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(批號：sc-58742-R)，均購自美國Santa Cruz公司；腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor alpha, TNF-α,批號：170305)、干擾素γ (interferon gamma, IFN-γ，批號：170226)、白介素-1β(interleukin 1β, IL-1β，批號：170308)和白介素-6(interleukin-6, IL-6，批號：170314)酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)檢測試劑盒，購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2儀器TECNAI 20 U-TWIN型透射電鏡為荷蘭飛利浦電子光學(xué)公司產(chǎn)品；F.A.M.E.16/20型全自動酶標(biāo)儀為瑞士哈美頓公司產(chǎn)品；UV-3600型紫外分光光度計為日本島津產(chǎn)品；SZ51/SZ61型光學(xué)顯微鏡為日本奧林巴斯公司產(chǎn)品。

1.3動物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組♂ Lewis大鼠，8～10周齡，體質(zhì)量(200±20)g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號：SCXK(京)2016-0006。將100 μg的P257-81多肽溶解于100 μL的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer, PBS)，再加入100 μL完全弗氏佐劑，混勻成抗原乳劑。通過在每只大鼠的后肢足底分別注射100 μL抗原乳劑，誘導(dǎo)EAN大鼠模型。實(shí)驗(yàn)分為對照組(Control)、EAN模型組(EAN)、辣椒素組(Capsaicin)、EAN+辣椒素組(EAN+Capsaicin)、雷帕霉素組(RAPA)、EAN+雷帕霉素組(EAN+RAPA)和EAN+辣椒素+雷帕霉素組(EAN+Capsaicin+RAPA)，每組10只。辣椒素組大鼠每天給予辣椒素(1 mg·kg-1)灌胃[6]，共15 d；EAN+辣椒素組大鼠每天在免疫后1 h給予辣椒素(1 mg·kg-1)灌胃，共15 d；雷帕霉素組大鼠在免疫后0.5 h通過腹腔注射給予雷帕霉素(2.5 mg·kg-1)，共15 d；EAN+雷帕霉素組大鼠每天在免疫后0.5 h通過腹腔注射給予雷帕霉素(2.5 mg·kg-1)，共15 d；EAN+辣椒素+雷帕霉素組大鼠每天在免疫后0.5 h通過腹腔注射給予雷帕霉素(2.5 mg·kg-1)，再在免疫后1 h給予辣椒素(1 mg·kg-1)灌胃，共15 d。

1.4大鼠神經(jīng)系統(tǒng)體征臨床評分抗原乳劑注射后，每天對大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)體征進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)如下：大鼠沒有表現(xiàn)出明顯的異常評為0分；肌張力明顯降低，鼠尾松弛無力評為1分；大鼠的翻正反射部分消失，鼠尾出現(xiàn)癱瘓評為2分；大鼠的翻正反射全部消失評為3分；大鼠出現(xiàn)姿態(tài)異常，并存在共濟(jì)失調(diào)現(xiàn)象評為4分；大鼠的后肢出現(xiàn)輕度癱瘓評為5分；大鼠的后肢出現(xiàn)中度癱瘓評為6分；大鼠的后肢出現(xiàn)嚴(yán)重癱瘓評為7分；大鼠四肢均出現(xiàn)癱瘓評為8分；大鼠處在瀕臨死亡的狀態(tài)評為9分；大鼠死亡評為10分[9]。

1.5坐骨神經(jīng)病理形態(tài)學(xué)觀察辣椒素處理15 d后處死動物，取出大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)，取靠近中樞的部分神經(jīng)組織用于病理切片，余下的神經(jīng)組織用于透射電鏡檢查。采用HE染色觀察神經(jīng)組織中炎癥細(xì)胞浸潤，勞克堅牢藍(lán)染色觀察神經(jīng)纖維脫髓鞘現(xiàn)象。在顯微鏡下觀察切片，每張切片隨機(jī)取5個視野，計數(shù)大鼠坐骨神經(jīng)橫斷面浸潤的炎癥細(xì)胞數(shù)量，結(jié)果以炎癥細(xì)胞數(shù)/mm2組織切片表示。

1.6ELISA法檢測大鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6的水平辣椒素處理15 d后，尾靜脈采血，1 500 r·min-1離心5 min，收集上清液。在酶標(biāo)板的每個檢測孔中加待測樣本50 μL，每孔加入酶結(jié)合物50 μL，空白對照孔不加，37℃孵育2 h。棄去孔內(nèi)液體，每孔先加入顯色劑100 μL，混勻，37℃孵育15 min?？瞻讓φ湛渍{(diào)零，設(shè)定波長為450 nm，用酶標(biāo)儀測定各孔的OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算血清標(biāo)本中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6的水平。

1.7坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)觀察辣椒素處理15 d后處死動物，取余下的右側(cè)坐骨神經(jīng)，0.2 mol·L-1戊二醛在4℃固定2 h。經(jīng)常規(guī)脫水、包埋、超薄切片和重金屬染色后，采用透射電鏡觀察神經(jīng)纖維的超微結(jié)構(gòu)及細(xì)胞中的自噬體情況，并拍照記錄，計算每個視野軸突橫截面中自噬體數(shù)量。

1.8Westernblot檢測辣椒素處理15 d后處死動物，取大鼠左側(cè)坐骨神經(jīng)，用預(yù)冷的PBS沖洗2遍，加入蛋白裂解液，冰上碾磨裂解30 min，提取總蛋白。2,2-聯(lián)喹啉-4,4-二甲酸二鈉法定量樣本的蛋白濃度?？偟鞍讟颖炯尤肷蠘泳彌_液，充分煮沸變性蛋白。SDS-PAGE電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)移到PVDF膜。牛血清白蛋白溶液室溫下孵育2 h封閉非特異性抗原。加入Beclin-1(1 ∶150)、LC-3(1 ∶200)、p62(1 ∶200)、β-actin(1 ∶400)的一抗，4℃過夜。洗膜后加入相應(yīng)的二抗，室溫下脫色搖床上緩慢搖晃繼續(xù)孵育2 h。洗膜后用ECL試劑盒顯色，清洗終止反應(yīng)。Chemi DocMP多色熒光凝膠成像分析系統(tǒng)觀察并記錄結(jié)果，采用Image J軟件進(jìn)行灰度分析，分析目的蛋白的相對表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1辣椒素對EAN大鼠神經(jīng)系統(tǒng)體征臨床評分和體質(zhì)量的影響如Fig 1所示，EAN組大鼠在免疫后d 6出現(xiàn)首發(fā)癥狀，臨床評分為(1.53±0.24)，此后神經(jīng)系統(tǒng)體征臨床評分逐漸升高，在免疫后d 15達(dá)到最高，臨床評分為(7.54±0.56)。與對照組比較，EAN組大鼠從免疫后d 6～16神經(jīng)系統(tǒng)體征臨床評分均明顯升高(P<0.05)。EAN組大鼠在免疫后d 2開始出現(xiàn)體質(zhì)量的減輕，從免疫后d 3～16體質(zhì)量均明顯低于對照組(P<0.05)。對照組和辣椒素組大鼠沒有觀察到神經(jīng)功能的缺損，兩組大鼠體質(zhì)量也沒有明顯差異(P>0.05)。與EAN組比較，EAN+辣椒素組大鼠從免疫后d 7～16神經(jīng)系統(tǒng)體征臨床評分均明顯降低(P<0.05)，從免疫后d 3～16體質(zhì)量均明顯增加(P<0.05)。

2.2辣椒素對EAN大鼠坐骨神經(jīng)的髓鞘脫失和炎性細(xì)胞浸潤的影響如Fig 2所示，與對照組比較，EAN組大鼠坐骨神經(jīng)中可觀察到明顯的髓鞘脫失現(xiàn)象，炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)明顯增加(P<0.05)。與EAN組比較，EAN+辣椒素組大鼠坐骨神經(jīng)中髓鞘脫失現(xiàn)象明顯減少，炎癥細(xì)胞浸潤數(shù)明顯減少(P<0.05)。

2.3辣椒素對EAN大鼠血清TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6水平的影響如Tab 1所示，與對照組比較，EAN組大鼠血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6水平明顯增加(P<0.05)。與EAN組比較，EAN+辣椒素組大鼠血清中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6水平明顯降低(P<0.05)。

Fig 1 Effect of capsaicin on clinical scores of neurological signs (A) and body weight (B) in rats with EAN*P<0.05 vs control group; #P<0.05 vs EAN group

Fig2EffectofcapsaicinondemyelinationandinflammatorycellinfiltrationofsciaticnerveinratswithEAN(×200)

Arrows indicates nerve fiber with demyelination.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEAN group

Fig 3 Effect of capsaicin on ultrastructure ofsciatic nerve in rats with EAN

Arrows indicates the autophagosome.*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEAN group

Tab 1 Effect of capsaicin on levels of serum TNF-α, IFN-γ, IL-1β and IL-6 in rats with EAN(±s, n=10)

*P<0.05vscontrol;#P<0.05vsEAN

2.4辣椒素對EAN大鼠坐骨神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)的影響如Fig 3所示，與對照組比較，EAN組大鼠坐骨神經(jīng)軸突中自噬體數(shù)量明顯增加(P<0.05)。與EAN組比較，EAN+辣椒素組大鼠坐骨神經(jīng)軸突中自噬體數(shù)量明顯減少(P<0.05)。

2.5辣椒素對EAN大鼠坐骨神經(jīng)組織中自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響如Fig 4所示，與對照組比較，EAN組大鼠坐骨神經(jīng)中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高，p62的表達(dá)明顯降低(P<0.05)。與EAN組比較，EAN+辣椒素組大鼠坐骨神經(jīng)中Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯降低，p62的表達(dá)明顯升高(P<0.05)。

Fig 4 Effect of capsaicin on expressions of autophagy relatedprotein Beclin-1, p62 and LC3-Ⅱ(A) and ratio of LC3-Ⅱ andLC3-Ⅰ (B) of sciatic nerve in rats with EAN

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsEAN group

2.6自噬誘導(dǎo)劑RAPA對辣椒素抑制大鼠EAN作用的影響如Fig 5所示，與EAN+辣椒素組比較，EAN+辣椒素+雷帕霉素組大鼠從免疫后d 8～16神經(jīng)系統(tǒng)體征臨床評分均明顯升高(P<0.05)，從免疫后d 6～16體質(zhì)量均明顯增加(P<0.05)，表明雷帕霉素部分逆轉(zhuǎn)了辣椒素的作用。

Fig 5 Effect of autophagy inducer RAPA on inhibitoryaction of capsaicin in rats with EAN

A: Clinical scores of neurological signs; B: Body weight.#P<0.05vsEAN+capsaicin group

3 討論

GBS是一種周圍神經(jīng)和神經(jīng)根的急性自身免疫性炎癥性疾病，主要表現(xiàn)為四肢麻木、肢體無力、四肢對稱性遲緩性癱瘓、面神經(jīng)麻痹、眼外肌麻痹、共濟(jì)失調(diào)、腱反射消失等癥狀。周圍神經(jīng)的脫髓鞘以及炎癥細(xì)胞的浸潤是本病的主要病理特點(diǎn)。EAN與人類的GBS具有相似的臨床、組織病理學(xué)和電生理學(xué)特征及免疫學(xué)改變，是研究GBS的經(jīng)典動物模型[10]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，辣椒素能明顯降低EAN大鼠的神經(jīng)系統(tǒng)體征臨床評分，明顯增加EAN大鼠的體質(zhì)量，減少EAN大鼠的坐骨神經(jīng)髓鞘脫失現(xiàn)象，減少EAN大鼠的坐骨神經(jīng)中炎癥細(xì)胞浸潤，降低大鼠血清中炎性細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β和IL-6的水平。這些結(jié)果表明辣椒素具有抗EAN的作用。

辣椒素是辣椒中最主要的有效成分，辣椒素通過與辣椒素受體結(jié)合后，開放陽離子通道，導(dǎo)致細(xì)胞外的鈣離子內(nèi)流，調(diào)節(jié)多種炎癥介質(zhì)包括組胺激肽、P物質(zhì)和前列腺素的釋放[11]。研究顯示，辣椒素對炎癥有抑制作用。周琦等[6]研究發(fā)現(xiàn)，辣椒素對慢性萎縮性胃炎具有良好的治療作用。符濤等[12]的研究結(jié)果表明，辣椒素對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的炎癥反應(yīng)具有抑制作用。本研究的結(jié)果也證實(shí)辣椒素具有抗炎作用，對EAN具有抑制作用，但其機(jī)制不明。

研究顯示，自噬與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切，而EAN是一種以髓鞘脫失、軸索變性和炎癥細(xì)胞浸潤為特征的神經(jīng)退行性疾病[13-14]。因此，進(jìn)一步檢測了EAN大鼠中自噬的水平。結(jié)果顯示，EAN大鼠坐骨神經(jīng)軸突中自噬體數(shù)量明顯增加，Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均明顯升高，p62的表達(dá)明顯降低，表明在EAN中自噬活性水平的增加，因而EAN的神經(jīng)軸突中自噬水平的增加可能是導(dǎo)致軸索變性的原因。但是神經(jīng)軸突中自噬活性水平的增加是否參與髓鞘脫失的發(fā)生呢？有研究表明，小鼠視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞軸突內(nèi)自噬體可以釋放到細(xì)胞周圍，被周圍的細(xì)胞吞噬處理[15]。構(gòu)成髓鞘的施旺細(xì)胞同樣具有吞噬能力，施旺細(xì)胞吞噬大量由軸突轉(zhuǎn)移出來的自噬體后，可能損傷施旺細(xì)胞，導(dǎo)致髓鞘溶解和髓鞘脫失，但是這種可能還需進(jìn)一步的研究證實(shí)。本研究的結(jié)果顯示，辣椒素明顯降低了EAN模型大鼠坐骨神經(jīng)軸突中自噬體數(shù)量，降低Beclin-1、LC3-Ⅱ蛋白的表達(dá)及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值，增加p62的表達(dá)，而自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素部分地逆轉(zhuǎn)辣椒素的作用。這表明辣椒素抑制了EAN中自噬活性，這可能是辣椒素抑制EAN的機(jī)制之一。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在南華大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)室完成，對本實(shí)驗(yàn)的參與人員表示感謝。)

[1] Zhang H L, Zheng X Y, Zhu J. Th1/Th2/Th17/Treg cytokines in Guillain-Barré syndrome and experimental autoimmune neuritis[J].CytokineGrowthFactorRev, 2013,24(5): 443-53.

[2] Tran G T, Hodgkinson S J, Carter N M, et al. Membrane attack complex of complement is not essential for immune mediated demyelination in experimental autoimmune neuritis [J].JNeuroimmunol, 2010,229(1-2): 98-106.

[3] 方 東, 張宏偉, 任鵬飛. 辣椒素受體與神經(jīng)痛[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2009,25(11): 1538-40.

[3] Fang D, Zhang H W, Ren P F. VR1 and neuropathic pain [J].ChinPharmacolBull, 2009,25(11): 1538-40.

[4] 馬紅雨, 任 曲, 魏利召, 等. 辣椒素受體參與骶髓后聯(lián)合核神經(jīng)元突觸傳遞[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2011,27(10): 1413-7.

[4] Ma H Y, Ren Q, Wei L Z, et al. Involvement of capsaicin receptors in synaptic transmission in sacral dorsal commissural nucleus neurons [J].ChinPharmacolBull, 2011,27(10): 1413-7.

[5] 王 燦, 陳 素, 劉向明. 龍血素B抑制大鼠背根神經(jīng)節(jié)細(xì)胞辣椒素誘發(fā)的電流反應(yīng)[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2007,23(2): 211-4.

[5] Wang C, Chen S, Liu X M. Loureirin B inhibits capsaicin-induced currents in rat dorsal root ganglion neurons [J].ChinPharmacolBull, 2007,23(2): 211-4.

[6] 周 琦, 張其勝. 辣椒素對慢性萎縮性胃炎的作用[J]. 胃腸病學(xué), 2015,20(5): 278-82.

[6] Zhou Q, Zhang Q S. Effect of capsaicin on chronic atrophic gastritis [J].ChinJGastroenterol, 2015,20(5): 278-82.

[7] Cosin-Roger J, Simmen S, Melhem H, et al. Hypoxia ameliorates intestinal inflammation through NLRP3/mTOR downregulation and autophagy activation [J].NatCommun, 2017,8(1): 98.

[8] 楊根夢, 陳 遜, 曾曉鋒. 甲基苯丙胺誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞自噬的研究進(jìn)展[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2016,32(10): 1341-4.

[8] Yang G M, Chen X, Zeng X F. Research progress of methamphetamine inducing nerve cell’s autophagy [J].ChinPharmacolBull, 2016,32(10): 1341-4.

[9] Cavaletti G, Mata S, Fasano A, et al. Lipid-free versus lipid-bound P2 protein-induced experimental allergic neuritis: clinicopathological, neurophysiological, and immunological study [J].JNeurosciRes, 2000,62(5): 709-16.

[10] Ding Y, Han R, Jiang W, et al. Programmed death ligand 1 plays a neuroprotective role in experimental autoimmune neuritis by controlling peripheral nervous system inflammation of rats [J].JImmunol, 2016,197(10): 3831-40.

[11] Sun N N, Wong S S, Keith I, et al. Tachykinin substance P depletion by capsaicin exacerbates inflammatory response to sidestream cigarette smoke in rats [J].Toxicology, 2004 ,201(1-3): 39-50.

[12] 符 濤, 付玉梅, 江慶萍, 等. 辣椒素對大鼠痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的作用[J]. 中藥材, 2014,37(3): 491-3.

[12] Fu T, Fu Y M, Jiang Q P, et al. Effect of capsaicin on the gouty arthritis in rats [J].JChinMedMater, 2014,37(3): 491-3.

[13] 劉立亞, 王慧曄, 黃秀蘭. 基于細(xì)胞自噬的葒草苷抗心肌缺血/再灌注損傷的機(jī)制研究[J]. 中國藥理學(xué)通報, 2016,32(4): 542-7.

[13] Liu L Y, Wang H Y, Huang X L. Cardioprotection of orientin against myocardial ischemia/reperfusion injury through induction of autophagy [J].ChinPharmacolBull, 2016,32(4): 542-7.

[14] Tan C C, Yu J T, Tan M S, et al. Autophagy in aging and neurodegenerative diseases: implications for pathogenesis and therapy [J].NeurobiolAging, 2014,35(5): 941-57.

[15] Burdett T C, Freeman M R. Astrocytes eyeball axonal mitochondria [J].Science, 2014,345(6195): 385-6.