桃仁-紅花藥對(duì)對(duì)動(dòng)靜力失衡性大鼠椎間盤(pán)軟骨終板退變的影響

王藝儒，唐德志，梁倩倩，徐 浩，趙永見(jiàn)，鄭為超

(1. 安徽理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院，安徽 淮南 232001；2. 筋骨理論與治法教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200032；3. 上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所，上海 200032)

頸椎病發(fā)病率逐年上升，發(fā)病趨于年輕化，已成為威脅成年人健康的主要疾病之一，給患者的工作生活帶來(lái)了嚴(yán)重不便。頸椎病的主要病理基礎(chǔ)是椎間盤(pán)退變(intervertebral disc degeneration，IVDD)，中醫(yī)認(rèn)為，“氣虛血瘀”是椎間盤(pán)退變的病機(jī)[1]。迄今為止，IVDD的病理機(jī)制仍不十分清楚。前期體外實(shí)驗(yàn)已證明，桃仁、紅花中主要單體苦杏仁苷及羥基紅花黃色素A可以抑制IL-1β誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞退變[2-5]。王擁軍等[6]首次建立的動(dòng)靜力失衡性椎間盤(pán)退變大鼠模型是研究IVDD常用的動(dòng)物模型。本文主要探討中藥經(jīng)典活血化瘀藥對(duì)桃仁-紅花，對(duì)動(dòng)靜力失衡性椎間盤(pán)退變大鼠軟骨胞外基質(zhì)的影響及對(duì)IVDD的治療作用，為頸椎病的防治提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物Wistar ♂大鼠50只，清潔級(jí)，8周齡，平均體質(zhì)量210 g左右 ，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證：SYXK(滬)2015-0008，飼養(yǎng)于上海市公共衛(wèi)生臨床中心，自由飲水?dāng)z食。

1.2藥物與試劑中藥桃仁、紅花，購(gòu)自龍華醫(yī)院中藥房；鹽酸氯胺酮注射液(福建古田藥業(yè))；II型膠原(type II collagen，Col II )兔抗鼠多克隆抗體(BA0533)、X型膠原(type X collagen，Col X )兔抗鼠多克隆抗體(BA2023)、即用型山羊抗兔SABC免疫組化染色試劑盒，均購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；TRIzol(美國(guó)Invitrogen)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Premix Ex Taq(RR420A)購(gòu)自TaKaRa公司；Col II、Col X、β-actin引物均由北京華大基因公司合成；阿爾新藍(lán)(Alcian blue)、蘇木精(Hematoxylin)、伊紅(Eosin Y)、Orange G、Phloxin B，均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司。

1.3儀器TP1020全自動(dòng)組織脫水機(jī)、EG1160石蠟包埋機(jī)、RM2235石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica)；BX50激光共聚焦顯微鏡(日本Olympus)；C1000 Thermal Cycler實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)Bio-Rad)；Centrifuge 5417R高速離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf)。

1.4方法

1.4.1動(dòng)物的分組及模型的建立 將大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，編為1～50號(hào)，采用隨機(jī)數(shù)字表法分組，每組10只。分為對(duì)照組、模型組、假手術(shù)組、美洛昔康組、桃仁-紅花藥對(duì)組，編號(hào)后分籠飼養(yǎng)。動(dòng)靜力失衡性大鼠椎間盤(pán)退變模型參考王擁軍等[6]的方法造模：將大鼠(模型組、美洛昔康組、桃仁-紅花藥對(duì)組)進(jìn)行鹽酸氯胺酮腹腔注射麻醉，麻醉用量0.1 g·kg-1，剪除大鼠頸后部毛，碘伏消毒后，由頸后正中做2～2.5 cm長(zhǎng)縱向切口，切開(kāi)皮膚，各層肌肉充分游離，橫向切斷頭、頸、寰最長(zhǎng)肌以及深層頸夾肌，將頸髂肋肌和頭半棘肌完全切除，依次剪斷C2～C7椎間盤(pán)的棘上和棘間韌帶。徹底止血，慶大霉素沖洗后縫合皮膚，紅霉素軟膏外涂切口，防止感染。假手術(shù)組切開(kāi)皮膚后不做任何處理，慶大霉素沖洗后直接縫合，切口處涂紅霉素軟膏。

1.4.2動(dòng)物給藥 術(shù)后12周，各給藥組開(kāi)始灌胃30 d，用藥劑量根據(jù)《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物藥理學(xué)》中動(dòng)物表面積比率換算計(jì)量法計(jì)算。按照成年人每日用藥劑量標(biāo)準(zhǔn)換算(成年人按標(biāo)準(zhǔn)體質(zhì)量60 kg計(jì)算，大鼠平均體質(zhì)量按370 g計(jì)算)，得出大鼠給藥劑量。桃仁-紅花煎劑以及雙蒸水溶解的美洛昔康懸濁液按劑量每日1次灌胃給藥，連續(xù)給藥30 d。模型組于造模后與對(duì)照組及假手術(shù)組按照同等劑量生理鹽水灌胃30 d。

1.4.3標(biāo)本處理 大鼠于給藥30 d后全部處死，取C4/5、C6/7椎間盤(pán)標(biāo)本， C6/7椎間盤(pán)置于-80℃冰箱保存。C4/5椎間盤(pán)置于質(zhì)量濃度為40 g·L-1多聚甲醛中固定24 h，清水沖洗30 min，質(zhì)量濃度為140 g·L-1的EDTA溶液脫鈣4周，每2 d換1次脫鈣液，脫水處理后石蠟包埋，5 μm正中矢狀位連續(xù)切片。

1.4.4ABOG染色 每個(gè)標(biāo)本抽取2張切片脫蠟至水，Alclan Blue /Hematoxylin混合染液30 min，鹽酸乙醇分化3 s，氨水返藍(lán)15 s， Eosin Y/Orange G/Phloxin B混合染液1.5 min，乙醇梯度脫水后二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察椎間盤(pán)組織形態(tài)學(xué)改變。

1.4.5免疫組化染色 每個(gè)標(biāo)本隨機(jī)抽取2張進(jìn)行脫蠟至水，體積分?jǐn)?shù)為0.03的H2O2滅活過(guò)氧化物酶15 min，BSA封閉10 min，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，SABC 10 min后DAB顯色，蘇木精1 min染核，鹽酸乙醇分化5 s后氨水返藍(lán)，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察Col II、Col X的表達(dá)。

1.4.6實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè) 提取總mRNA：分離C6/7椎間盤(pán)軟骨終板，置于研缽中加液氮研磨至粉末，加入1 mL TRIzol混勻，冰上靜置5 min，加氯仿200 μL后震蕩，冰上靜置20 min，14 000 r·min-1、4℃離心15 min，吸上清，加入500 μL預(yù)冷異丙醇，冰上靜置10 min，14 000 r·min-1、4℃離心15 min，棄上清，加體積分?jǐn)?shù)為0.75的乙醇500 μL洗滌，9 200 r·min-1、4℃離心5 min，室溫靜置10 min，空氣干燥RNA沉淀后溶解于30 μL DEPC水，測(cè)RNA濃度；逆轉(zhuǎn)錄cDNA：配20 μL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系，于30℃孵育15 min，85℃ 5 s，終止反應(yīng)；實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)：SYBR Premix Ex Taq 10 μL，RNase-free 水7 μL，上、下游引物(引物序列見(jiàn)Tab 1)各1 μL，模板cDNA 1 μL，配制20 μL的反應(yīng)體系。95 ℃預(yù)變性3 min，進(jìn)入循環(huán)，95℃變性10 s，58℃退火10 s，72℃延伸30 s的條件下循環(huán)擴(kuò)增，循環(huán)次數(shù)均為40次。同一樣本同時(shí)做β-actin內(nèi)參PCR反應(yīng)，設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。待反應(yīng)結(jié)束后，以每個(gè)樣本所含檢測(cè)的基因mRNA的拷貝數(shù)和其對(duì)應(yīng)的β-actin內(nèi)參基因的拷貝數(shù)的比值進(jìn)行比較 。

Tab 1 Primer sequence of qPCR

2 結(jié)果

2.1桃仁-紅花藥對(duì)對(duì)椎間盤(pán)組織形態(tài)學(xué)的影響對(duì)照組C4/5椎間盤(pán)ABOG染色展現(xiàn)清晰的椎間盤(pán)界限，椎間盤(pán)中央?yún)^(qū)髓核可見(jiàn)清晰的基質(zhì)。模型組染色呈現(xiàn)出椎間盤(pán)退變的表現(xiàn)，椎間盤(pán)高度降低(Fig 1)，髓核基質(zhì)減少，纖維環(huán)出現(xiàn)環(huán)形裂隙，軟骨界限模糊、基質(zhì)丟失，并出現(xiàn)軟骨終板骨化，其中含骨髓樣組織。而假手術(shù)組、美洛昔康組及桃仁-紅花藥對(duì)組椎間盤(pán)髓核及軟骨與對(duì)照組相近(Fig 2)。

2.2桃仁-紅花藥對(duì)對(duì)軟骨終板細(xì)胞ColII、ColX蛋白表達(dá)的影響Col II主要表達(dá)于軟骨細(xì)胞基質(zhì)中，模型組Col II染色強(qiáng)度明顯低于對(duì)照組，而桃仁-紅花藥對(duì)組Col II表達(dá)高于模型組。Col X于軟骨細(xì)胞基質(zhì)中表達(dá)，模型組可見(jiàn)Col X陽(yáng)性染色，對(duì)照組及桃仁-紅花藥對(duì)組Col X表達(dá)明顯少于模型組(Fig 3)。

Fig 1 Height of intervertebral disc

**P<0.01vsmodel

Fig2ThemorphologicalchangesofratintervertebraldiscbyABOGstaining(×200)

A: Control group; B: Model group; C: Sham group; D: Meloxicam group; E: Taoren-Honghua group

2.3桃仁-紅花藥對(duì)對(duì)軟骨終板細(xì)胞ColII、ColXmRNA表達(dá)的影響如Fig 4所示，與對(duì)照組相比，模型組椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞中Col II表達(dá)降低，Col X表達(dá)升高。與模型組比較，桃仁-紅花藥對(duì)組椎間盤(pán)軟骨細(xì)胞中Col II表達(dá)上調(diào)，Col X表達(dá)下調(diào)。

Fig 3 Col II and Col X expression levels in rat degeneratedintervertebral discs by immunohistochemistry

A: The positive cells were measured by DAB and observed by microscopy(×200). a: Control group; b: Model group; c: Sham group; d: Meloxicam group; e: Taoren-Honghua group; B: Positive cell counts of Col II and Col X in per sight.**P<0.01vsmodel.

Fig 4 The relative expression of Col II (A) and Col X (B) mRNA

**P<0.01vsmodel

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為椎間盤(pán)退變的根本原因是“氣虛血瘀，本虛標(biāo)實(shí)”，益氣化瘀的方劑及拆方對(duì)椎間盤(pán)退變有一定的治療效果。中國(guó)藥典提示，桃仁具有活血祛瘀、止咳平喘、潤(rùn)腸通便之功效，紅花兼散瘀止痛、活血通經(jīng)之功效[7]。桃仁-紅花藥對(duì)最早出自清·吳謙《醫(yī)宗金鑒·四十四卷》中的方劑桃紅四物湯，是中藥治療活血化瘀類(lèi)疾病的經(jīng)典配伍。通過(guò)對(duì)桃仁-紅花藥對(duì)在中藥方劑中應(yīng)用規(guī)律的總結(jié)，發(fā)現(xiàn)兩味藥比例1 ∶1出現(xiàn)的頻次最多，對(duì)臨床用藥有重要指導(dǎo)意義[8]。

椎間盤(pán)是人體中最大的無(wú)血管組織，主要靠纖維環(huán)外周通路以及軟骨終板通路進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)的供給和廢物的代謝，軟骨終板胞外基質(zhì)的生成與維持直接影響椎間盤(pán)的生物化學(xué)及生物力學(xué)功能。Col II是組成固體基質(zhì)的最主要部分，其含量直接影響胞外基質(zhì)的生物學(xué)功能[9]，而Col X特異表達(dá)于肥大軟骨細(xì)胞中，與基質(zhì)降解相關(guān)[10]。胞外基質(zhì)合成減少及降解加速是導(dǎo)致軟骨細(xì)胞退變的重要原因之一，軟骨細(xì)胞的退變?cè)谧甸g盤(pán)退變進(jìn)程中發(fā)揮重要作用[11-12]。

本研究通過(guò)建立動(dòng)靜力失衡性椎間盤(pán)退變大鼠模型，運(yùn)用 ABOG染色分析桃仁-紅花藥對(duì)煎劑對(duì)椎間盤(pán)退變中軟骨終板細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生的影響，發(fā)現(xiàn)與模型組相比，桃仁-紅花藥對(duì)組軟骨終板基質(zhì)染色較深，表明其胞外基質(zhì)含量較高，證明桃仁-紅花藥對(duì)可有效抑制退變椎間盤(pán)中軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解。免疫組化檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，模型組能夠明顯上調(diào)Col X的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)Col II的表達(dá)，桃仁-紅花藥對(duì)組能抑制Col X的表達(dá)，同時(shí)上調(diào)Col II的表達(dá)。因此，進(jìn)一步采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)各組Col II、Col X mRNA表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組Col X mRNA表達(dá)明顯增加，Col II mRNA表達(dá)明顯減少，桃仁-紅花藥對(duì)組能夠明顯下調(diào)Col X mRNA表達(dá)，上調(diào)Col II mRNA表達(dá)。我們可以得出，桃仁-紅花藥對(duì)可以減少動(dòng)靜力失衡性椎間盤(pán)退變大鼠椎間盤(pán)軟骨基質(zhì)的降解，抑制軟骨細(xì)胞退變，進(jìn)而延緩椎間盤(pán)退變，起到了椎間盤(pán)保護(hù)作用。

頸椎病的預(yù)防及早期干預(yù)越來(lái)越受到重視，活血化瘀類(lèi)中藥用于臨床延緩頸椎病早期椎間盤(pán)退變的療效亟待探索，而該藥對(duì)能否有效防治腰椎疾病、骨關(guān)節(jié)炎等其他慢性骨關(guān)節(jié)病也是值得我們未來(lái)深入研究的課題。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在上海中醫(yī)藥大學(xué)脊柱病研究所筋骨理論與治法教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成，感謝實(shí)驗(yàn)室老師給予的技術(shù)指導(dǎo)以及實(shí)驗(yàn)室同學(xué)給予的大力幫助。)

[1] 黃曉濤, 呂存賢, 馬鎮(zhèn)川, 等. 益氣活血法在治療腰椎間盤(pán)相關(guān)疾病中的作用[J]. 中國(guó)中醫(yī)骨傷科雜志, 2010,18(12):66-8.

[1] Huang X T, Lyu C X, Ma Z C, et al. The effect of Qi benefiting and blood activating method on the treatment of lumbar intervertebral disc related diseases[J].ChinJTraditMedTraumatolOrthop, 2010,18(12):66-8.

[2] 牛 凱, 趙永見(jiàn), 姚長(zhǎng)風(fēng), 等. 苦杏仁苷對(duì)IL-1β誘導(dǎo)后大鼠椎間盤(pán)軟骨終板細(xì)胞的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2013,29(12):1725-30.

[2] Niu K, Zhao Y J, Yao C F, et al. Effects of amygdalin on the endplate chondrocytes induced by IL-1β derived from rats’intervertebral discs[J].ChinPharmacolBull, 2013,29(12):1725-30.

[3] 鄭為超, 牛 凱, 趙永見(jiàn), 等. 苦杏仁苷對(duì)IL-1β誘導(dǎo)后大鼠椎間盤(pán)軟骨終板細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中國(guó)藥理學(xué)通報(bào), 2014,30(12):1734-9.

[3] Zheng W C, Niu K, Zhao Y J, et al. Effect of amygdalin on end-plate chondrocytes apoptosis induced by IL-1β derived from rat intervertebral discs[J].ChinPharmacolBull, 2014,30(12):1734-9.

[4] 牛 凱, 趙永見(jiàn), 張 雷, 等. 苦杏仁苷聯(lián)合羥基紅花黃色素A對(duì)IL-1β誘導(dǎo)的大鼠椎間盤(pán)軟骨終板細(xì)胞的影響[J]. 藥學(xué)學(xué)報(bào), 2014,49(8):1136-42.

[4] Niu K, Zhao Y J, Zhang L, et al. The synergistic effect of amygdalin and HSYA on the IL-1β induced endplate chondrocytes of rat intervertebral discs[J].ActaPharmSin, 2014,49(8):1136-42.

[5] 牛 凱, 李晨光, 袁 松, 等. 桃仁-紅花藥對(duì)抑制IL-1β誘導(dǎo)椎間盤(pán)軟骨終板細(xì)胞發(fā)生退變的體外實(shí)驗(yàn)研究 [J]. 中國(guó)藥學(xué), 2016,25(8):590-7.

[5] Niu K, Li C G, Yuan S, et al. TRHH-herb pair prevents IL-1β-induced degeneration of endplate chondrocytesinvitro[J].JChinPharmSci, 2016,25(8):590-7.

[6] 王擁軍, 施 杞, 沈培芝, 等. 動(dòng)靜力失衡性大鼠頸椎間盤(pán)退變模型的動(dòng)態(tài)觀察[J]. 中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志, 2001,21(3):199-202.

[6] Wang Y J, Shi Q, Shen P Z，et al. Dynamic observation on imbalance of dynamic and static forces and degenerated cervical intervertebral disc in rats[J].ChinJIntegrTraditWestMed, 2001,21(3):199-202.

[7] 國(guó)家藥典委員會(huì). 中華人民共和國(guó)藥典[S]. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社, 2015版，一部.

[7] Chinese Pharmacopoeia Commission. Pharmacopoeia of People’s Republic of China[S]. Beijing: China Medical Science Press，2015.

[8] 黃 潔, 馬榮華, 聞曉東, 等. 桃仁-紅花藥對(duì)不同配比的應(yīng)用數(shù)據(jù)分析[J]. 中國(guó)新藥雜志, 2012,21(4):407-11.

[8] Huang J, Ma R H, Wen X D, et al. Data analysis for different proportions of persicae semen and carthami flos in Chinese medicinal formulae[J].ChinJNewDrugs, 2012,21(4):407-11.

[9] Mahmoudifar N, Doran P M. Chondrogenesis and cartilage tissue engineering: the longer road to technology development[J].TrendsBiotechnol, 2012,30(3):166-76.

[10] Aigner T, McKenna L. Molecular pathology and pathobiology of osteoarthritic cartilage[J].CellMolLifeSci, 2002,59(1):5-18.

[11] Shirazi-Adl A, Taheri M, Urban J P. Analysis of cell viability in intervertebral disc: effect of endplate permeability on cell population[J].JBiomech, 2010,43(7):1330-6.

[12] Lee J M, Song J Y, Baek M, et al. Interleukin-1β induces angiogenesis and innervation in human intervertebral disc degeneration[J].JOrthopRes, 2011,29(2):265-9.