一起核酸實驗室污染的調(diào)查與處理

李曉麗 董佳慧 吉鴻超 佟虎成 王 欣

（1.承德市動物疫病預防控制中心，河北承德 067000；2.承德市畜禽水產(chǎn)品質(zhì)量檢驗監(jiān)測中心，河北承德 067000）

PCR（聚合酶鏈式反應）技術是一種體外基因擴增技術，該技術通過重復高溫變性、低溫退火、中溫延伸等簡單的3個溫度循環(huán)，可在很短的時間內(nèi)將極微量的靶核酸擴增上百萬倍，得到大量特定目的基因片段，獲得極高的檢測敏感性[1]。其主要缺點為極易污染，極微量的污染即可造成假陽性的結(jié)果，且處理起來非常麻煩。本文結(jié)合本實驗室污染的發(fā)生及處理情況，分析核酸實驗室污染產(chǎn)生的途徑及控制措施。

1 材料

1.1 儀器

全自動核酸提取儀（西安天隆TGuide S32），熒光PCR儀（Roche LightCycler 96）。

1.2 試劑

磁珠法核酸提取試劑（貨號Q5308），中山大學達安基因股份有限公司熒光定量PCR試劑盒（批號：2017002）

2 方法

污染發(fā)生后，對實驗室進行污染監(jiān)測，查找污染源，針對污染源進行消毒處理，并通過反復試驗來驗證污染被清除。

3 結(jié)果

3.1 發(fā)現(xiàn)污染

2017年5月，在一次常規(guī)監(jiān)測中，我實驗室按照正常的操作規(guī)程檢測禽雙拭子樣品（檢測H7N9），同時設立了陰性對照和陽性對照（均為試劑盒配備），擴增結(jié)束分析時發(fā)現(xiàn)所有的樣品及陰性對照均為陽性，提示操作過程中某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)了污染。

3.2 追蹤污染源

出現(xiàn)污染后，首先考慮可能為試劑污染，使用新開封的試劑盒重新檢測，結(jié)果仍顯示所有的樣品及陰性對照均為陽性。將樣品送至省疫控中心實驗室進行檢測，結(jié)果顯示，在試驗成立的前提下，所有樣品為陰性，說明試劑及樣品均未被污染。由此推測，是實驗室環(huán)境或檢測儀器出現(xiàn)污染。

3.3 消毒處理

實驗結(jié)束后，收拾完畢，用84消毒液進行臺面擦拭消毒，核酸自動提取儀采用自帶紫外燈消毒15min，室內(nèi)采用歐爾琺過氧化氫消毒液機消毒1h。

3.4 消毒效果驗證

消毒處理后，分兩階段進行驗證。首先進行實驗室環(huán)境和PCR擴增儀的監(jiān)測，將5個裝有1ml超純水的離心管放置在實驗室的不同區(qū)域，分別為核酸提取室的地面、操作臺上、通風櫥內(nèi)和無菌室的地面和操作臺上，放置24h后，不經(jīng)提?。ㄔ噭┖嘘栃詫φ詹恍杞?jīng)過提取直接進行擴增檢測），直接加入擴增反應混合液進行擴增，顯示PCR儀和環(huán)境均未被污染。然后進行全自動核酸提取儀的監(jiān)測，將上述環(huán)境樣品及陰性對照（陽性對照不參與提?。┙?jīng)全自動核酸提取儀提取后，加入擴增反應混合液進行擴增，全部樣品及陰性對照呈現(xiàn)明顯的擴增曲線，因此可初步判斷為全自動核酸提取儀被污染，需要進一步進行消毒處理。

針對全自動核酸提取儀的消毒：內(nèi)部首先用75%酒精擦拭消毒，然后連續(xù)采用自帶紫外線進行消毒，消毒達到2h后，進行驗證。將上述5份樣品及陰性對照從核酸提取開始，按照程序分步檢測，擴增結(jié)果顯示所有水樣本和陰性對照均檢測為陰性，陽性對照出現(xiàn)明顯的擴增曲線，表明核酸實驗室可重新啟用。

3.5 形成滅菌程序

實驗結(jié)束后，清理耗材及廢棄物，能滅菌的都需進行一次滅菌。實驗臺面首先用84消毒液進行擦拭消毒，室內(nèi)首先用紫外燈照射30min，然后用過氧化氫消毒液機進行噴霧消毒1h，核酸自動提取儀適當延長紫外線消毒時間。

4 討論

發(fā)現(xiàn)核酸實驗室污染后應立即停用，尋找污染源及污染部位，采取有效措施進行消毒，清除污染源，反復驗證，直到能夠重新啟用核酸實驗室[2]。

核酸實驗室污染的主要可能原因為：樣本污染、試劑污染、環(huán)境污染、設備污染和其他污染。針對相應的污染需制定相應的解決措施。樣本和試劑污染排除較為簡單，可更換樣本和試劑或送其他實驗室進行驗證，環(huán)境污染和設備污染則需要對設備和環(huán)境進行徹底的消毒清潔。核酸實驗室一旦發(fā)生污染，尋找污染源分析原因耗時耗力，所以防止污染尤其重要。

防止污染主要是在實驗過程中要嚴格按照相關要求進行操作[3]。首先，核酸實驗室需進行嚴格的分區(qū)，每個步驟都在相應的實驗區(qū)進行，按照潔凈區(qū)-半污染區(qū)-污染區(qū)的單向工作流向，避免交叉污染；其次，各區(qū)的試劑、耗材、儀器等包括記號筆等應專區(qū)專用，不得交叉使用；再次，嚴格控制進入核酸實驗室的人員和次數(shù)，非相關人員不得進入，實驗人員在實驗過程中嚴格安全操作行為；最后，每次實驗結(jié)束后，應認真做好實驗室的清潔及消毒工作。

[1] 鐘旭琴，戴維.核酸實驗室污染監(jiān)測及處理方法[J].醫(yī)藥前沿，2015，5（21）：343.

[2] 畢承恩，瞿文全，鄭麗娟，等.核酸實驗室污染原因及處理[J].臨床血液學雜志，2017，30（2）：135-137.

[3] 郭利華.PCR實驗室的污染及控制措施[J].國際檢驗醫(yī)學雜志，2016，37（16）：2354-2355.