口腔癌動(dòng)物模型研究進(jìn)展

續(xù)國(guó)強(qiáng)，衛(wèi)佳寧，宋國(guó)華

(山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人類疾病動(dòng)物模型山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原　030001)

口腔癌是頭頸部最常見的惡性腫瘤。有關(guān)研究報(bào)道，口腔癌中約有90%為鱗狀細(xì)胞癌[1]。由于存在預(yù)后較差、易轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率高[2]且口腔鱗狀細(xì)胞癌(OSCC)發(fā)生、發(fā)展的具體病理機(jī)制尚未充分明確等問題，使得臨床上OSCC的治療效果仍未有明顯改善。因此，建立一種較為完善的動(dòng)物模型對(duì)人類口腔癌的預(yù)防、發(fā)生、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的研究十分重要。目前，許多學(xué)者建立了化學(xué)誘導(dǎo)、移植腫瘤及基因修飾等口腔癌動(dòng)物模型，在抗腫瘤藥物的藥代動(dòng)力學(xué)、實(shí)驗(yàn)性治療方法的評(píng)價(jià)及部分原癌、抑癌基因的作用等方面進(jìn)行了研究。本文就口腔癌動(dòng)物模型研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1　自發(fā)性口腔癌動(dòng)物模型

該模型中動(dòng)物腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程與人類腫瘤的過程很相似，但由于自發(fā)性動(dòng)物模型存在飼養(yǎng)量大、周期長(zhǎng)、耗資大的缺點(diǎn)，目前還未有關(guān)自發(fā)性口腔癌動(dòng)物模型的報(bào)道。因此，在實(shí)際操作過程中我們常用誘發(fā)動(dòng)物模型來(lái)展開相應(yīng)研究。

目前，我國(guó)對(duì)北極的研究相對(duì)滯后，更多還關(guān)注在自然科學(xué)方面，我國(guó)1999年才啟動(dòng)北極考察，比南極考察晚了整整14年，隨著北極發(fā)生重大變化，中國(guó)對(duì)北極的研究短板凸顯。

2　誘發(fā)性口腔癌動(dòng)物模型

2.1　化學(xué)誘導(dǎo)口腔癌動(dòng)物模型

2.1.1利用二甲基苯并蒽(9, 10-dimethyl-1, 2-benzanthracene，DMBA)誘導(dǎo)

二甲基苯并蒽為黃色粉末，是一種直接致癌劑，會(huì)使黏膜上皮細(xì)胞的遺傳物質(zhì)突變，黏膜細(xì)胞異常增生進(jìn)而發(fā)生癌變。使用DMBA誘導(dǎo)建立口腔癌動(dòng)物模型時(shí)，有涂抹法、直接注射法及DMBA局部植入三種方法。皇甫冰等[3]將0.5% DMBA丙酮溶液以每周3次的頻率用小頭棉簽涂抹于中國(guó)地鼠雙側(cè)頰囊，第6周時(shí)發(fā)生非典型增生，第9周時(shí)有炎癥反應(yīng)并產(chǎn)生潰瘍，第12周誘發(fā)原位癌，第15周便產(chǎn)生了鱗狀細(xì)胞癌和浸潤(rùn)癌。Vijayalakshmi等[4]將0.5%的DMBA石蠟溶液涂抹于金黃色敘利亞地鼠頰囊，以每周三次的頻率持續(xù)涂抹14周。與對(duì)照組相比，涂抹DMBA的地鼠全部成瘤且具有高腫瘤體積，腫瘤負(fù)荷以及突變型p53，PCNA和細(xì)胞周期蛋白D1的過度表達(dá)等特點(diǎn)。全知怎等[5]將DMBA溶液涂抹于地鼠頰黏膜，持續(xù)14周后誘癌組30只地鼠全部產(chǎn)生了鱗狀細(xì)胞癌組織。李志革等[6]將DMBA丙酮溶液依次配置成0.1%～0.5% 5個(gè)濃度梯度后分別注射入五組金黃色地鼠的頰囊黏膜下，每周2次連續(xù)注射12周，最終0.3%組的誘瘤率最高。曹選平等[7]將DMBA含量為2%、體積為1 mm3的明膠海綿塊植入SD大鼠的頜下腺進(jìn)行口腔癌誘發(fā)實(shí)驗(yàn)，誘瘤率為42%。

利用DMBA誘導(dǎo)的動(dòng)物模型腫瘤位置比較淺、重復(fù)性好、切取穩(wěn)定且易于觀察，與人類口腔腫瘤的生物學(xué)行為和生長(zhǎng)特性很相似，也與人類口腔黏膜上皮癌變的病理變化過程很相似。正因如此，諸多學(xué)者認(rèn)為DMBA誘導(dǎo)建立的口腔癌動(dòng)物模型是目前較為理想的口腔癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型之一。

2.1.2利用4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquino-line-1-oxide, 4NQO)誘導(dǎo)

與DMBA致癌模型相比，4NQO模型的誘癌過程避免了在用藥初期引起的黏膜壞死和炎癥，但局部涂抹4NQO溶液誘癌方式不自然，誘癌過程中會(huì)伴隨有涂抹所產(chǎn)生的機(jī)械刺激且勞動(dòng)強(qiáng)度相對(duì)較大。

2.2　移植性口腔癌動(dòng)物模型

建立移植性口腔癌動(dòng)物模型常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有裸鼠以及新西蘭大白兔等；常用的細(xì)胞株系有Tca8113人舌癌細(xì)胞系、CAL-27人舌鱗狀癌細(xì)胞系、SCC9細(xì)胞系和VX2細(xì)胞系等。Zhao等[12]將100 μL培養(yǎng)基中的Tca8113細(xì)胞(2×106)以1560 r/min常溫消化5 min，采用60只SPF級(jí)的BALB/cnu/nu雌性小鼠，皮下注射于小鼠足背，最終所有小鼠全部成瘤。Chen等[13]將200 μL生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的2×106個(gè)CAL-27細(xì)胞，皮下注射于6～8周齡時(shí)體重約20 g的雌性BALB/c-nude小鼠的背部皮膚中，結(jié)果顯示，所有BALB/c-nude小鼠背部均成功誘瘤。Wu等[14]將熒光標(biāo)記的SCC9細(xì)胞分為CD44+，CD44-和CD44±三組，并將它們分別注入隨機(jī)分成三組的NOD/SCID小鼠舌側(cè)緣；20 d后對(duì)所有小鼠進(jìn)行分析并處死，接種CD44+細(xì)胞的小鼠在注射部位的成瘤率為100%，而在CD44-組中則為80%。此外，CD44+組中80%的小鼠發(fā)生頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而CD44-組中只有30%的小鼠表現(xiàn)出頸部轉(zhuǎn)移。李方龍等[15]利用中國(guó)海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院提供的VX2細(xì)胞系和低溫凍存的VX2腫瘤組織塊成功建立VX2荷瘤兔模型；并將該荷瘤兔的腫瘤用改良的穿刺植入法植入實(shí)驗(yàn)兔的舌體左側(cè)建立兔VX2舌癌移植瘤模型。

與體型較小的嚙齒類動(dòng)物相比，用體型較大的新西蘭大白兔建立口腔癌動(dòng)物模型有明顯優(yōu)勢(shì)，對(duì)于研究口腔癌的浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移機(jī)制、影像學(xué)表現(xiàn)、發(fā)病機(jī)制、生物學(xué)特性以及評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)性治療方法的療效等方面具有重要價(jià)值。與其它細(xì)胞株系相比，VX2腫瘤細(xì)胞株具有誘導(dǎo)所需時(shí)間短、種植成功率高、生物學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、轉(zhuǎn)移與侵襲性強(qiáng)、在新西蘭大白兔體內(nèi)成瘤率高等優(yōu)點(diǎn)。因此，目前有許多學(xué)者嘗試采用這種細(xì)胞來(lái)研究口腔癌。

3　基因修飾動(dòng)物模型

基因修飾動(dòng)物模型是上世紀(jì)90年代新發(fā)展起來(lái)的將外源基因?qū)雽?shí)驗(yàn)動(dòng)物生殖細(xì)胞、胚胎干細(xì)胞或早期胚胎后，在受體細(xì)胞染色體基因組中穩(wěn)定地整合并表達(dá)和傳遞給后代的一類動(dòng)物模型。轉(zhuǎn)基因技術(shù)可通過在發(fā)育過程中精確激活、沉默等位基因，將基因表達(dá)控制在各個(gè)發(fā)育階段。盡管長(zhǎng)期以來(lái)大多數(shù)常見的腫瘤都出現(xiàn)了多種基因修飾動(dòng)物模型，但發(fā)生于頭頸部的腫瘤基因修飾動(dòng)物模型卻很罕見，而且是在最近才逐漸興起[16]。全球第一例口腔癌的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)動(dòng)物模型—小鼠口腔—食管癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型是由Oliver等[17]將啟動(dòng)子Epstein-Barr virus ED-L2與細(xì)胞周期素D1的cDNA 相結(jié)合并使用顯微注射法將外源基因?qū)胧芫训男墼?，隨后又利用回交純化基因來(lái)建立的。在K14-CreERtam/LSL-K-rasG12D轉(zhuǎn)基因鼠中將基因ras激活、基因p53失活后口腔黏膜上產(chǎn)生了不繼續(xù)惡化癌變的乳頭狀瘤；但當(dāng)該轉(zhuǎn)基因鼠與基因p53表達(dá)缺陷的轉(zhuǎn)基因鼠雜交后，產(chǎn)生的子代轉(zhuǎn)基因鼠被化學(xué)藥物他莫昔芬連續(xù)處理14 d后便會(huì)產(chǎn)生口腔癌[18]，從而成功建立他莫昔芬誘導(dǎo)的口腔癌變模型。Ocadiz-Delgado等[19]研究表明，牛角蛋白6介導(dǎo)形成的Tg轉(zhuǎn)基因鼠在27周齡左右時(shí)位于其舌中部的上皮發(fā)生增生；并預(yù)測(cè)在此基礎(chǔ)上輔以如化學(xué)致癌劑等其他外界致癌因素刺激會(huì)建立一種新型的口腔癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。近期，佘佐亞等[20]采用單獨(dú)4NQO誘導(dǎo)和4NQO聯(lián)合檳榔堿共同誘導(dǎo)的方式分別誘導(dǎo)Babl/c和C57BL/6綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠產(chǎn)生口腔癌，并比較這兩品系小鼠對(duì)4NQO的敏感性以及它們?cè)诓煌瑫r(shí)間段時(shí)的各項(xiàng)病理變化；這種綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠口腔癌模型成為了活體熒光影像系統(tǒng)的一種重要的動(dòng)物模型。

目前，新型的CRISPR/Cas9技術(shù)以一段RNA序列為導(dǎo)向來(lái)識(shí)別靶基因與傳統(tǒng)的編輯技術(shù)相比，該系統(tǒng)定位更加準(zhǔn)確、操作更加簡(jiǎn)潔、可控性更高，而且得到的突變可遺傳給下一代。2017年P(guān)ing等[21]用張峰教授開發(fā)的在線工具(http://crispr.mit.edu/)選擇合適的靶位點(diǎn)后，利用新型的CRISPR/Cas9技術(shù)在舌鱗狀癌細(xì)胞系SCC-9中產(chǎn)生p75神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子受體(p75NTR)基因組缺失的突變體，來(lái)研究p75NTR基因被敲除后對(duì)SCC-9細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，從而為人類口腔癌在基因?qū)用娴闹委熀头烙峁┝艘粋€(gè)新的潛在靶標(biāo)。Ping等雖然只是在細(xì)胞水平上利用CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建了口腔癌的細(xì)胞模型，但這也提示我們，可以將細(xì)胞水平的基因編輯模型和移植模型結(jié)合起來(lái)，通過CRISPR/Cas9 技術(shù)構(gòu)建口腔癌細(xì)胞，利用手術(shù)將其移植到符合要求的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，建立基因編輯的移植性口腔癌動(dòng)物模型。還可將該技術(shù)應(yīng)用于合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物受精卵中或直接在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)，利用該技術(shù)進(jìn)行基因編輯以建立更符合需要的基因修飾口腔癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。

轉(zhuǎn)基因口腔癌實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型不但可以在整體組織器官水平上對(duì)動(dòng)物進(jìn)行研究，而且可以深入研究腫瘤在分子水平和細(xì)胞水平上的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為口腔癌臨床治療研究、治療藥物篩選以及口腔癌發(fā)病機(jī)制研究提供了一個(gè)理想的實(shí)驗(yàn)體系。利用轉(zhuǎn)基因法建立的口腔癌動(dòng)物模型，可以準(zhǔn)確地增強(qiáng)或失活某些基因的表達(dá)，可在分子水平上研究口腔癌形成過程中的各種病變。但利用轉(zhuǎn)基因法建立實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型時(shí)，被導(dǎo)入的外源基因在宿主基因組中的行為難控制、表達(dá)混亂，甚至不表達(dá)、轉(zhuǎn)錄效率低、無(wú)法遺傳給后代、轉(zhuǎn)基因鼠不能形成多個(gè)突變以及成活率不高等缺點(diǎn)。新一代的 CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)雖然操作性更強(qiáng)、可控性更高，但在實(shí)際應(yīng)用的過程中也具有“脫靶”等問題亟待我們解決。

4　幾種模型的比較

口腔癌動(dòng)物模型主要有自發(fā)性口腔癌動(dòng)物模型、誘發(fā)性口腔癌動(dòng)物模型、基因修飾口腔癌動(dòng)物模型。其中自發(fā)性口腔癌動(dòng)物模型由于其耗資巨大、費(fèi)時(shí)且過程繁瑣，故而現(xiàn)今還未有該模型的相關(guān)報(bào)道。

目前，較為成熟且使用較多的是誘發(fā)性口腔癌動(dòng)物模型?；瘜W(xué)誘導(dǎo)口腔癌動(dòng)物模型具有可嚴(yán)格控制各種條件，在較短的時(shí)間能復(fù)制出大量的口腔癌動(dòng)物模型，能夠較好地模擬人類口腔癌的發(fā)生過程等優(yōu)點(diǎn)。但同時(shí)也具有動(dòng)物意外死亡率較高，進(jìn)行局部治療性實(shí)驗(yàn)比較困難，與人類口腔癌的某些特征有較大差異，不適合在進(jìn)展研究及腫瘤治療等領(lǐng)域應(yīng)用的缺點(diǎn)。其中DMBA涂抹法誘瘤率接近100%，DMBA直接注射法由于注射濃度的不同其誘瘤結(jié)果也不同，最高為87%，最低為25%。移植性口腔癌動(dòng)物模型適用于短時(shí)間內(nèi)需要得到大量相同腫瘤模型的實(shí)驗(yàn)，這種模型所產(chǎn)生的腫瘤具有個(gè)體差異較小、移植部位選擇靈活、生長(zhǎng)速率較一致、可觀察到腫瘤浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移過程、保留人類口腔癌部分病理學(xué)、生物學(xué)特性以及高接種成活率等優(yōu)點(diǎn)。但該方法也存在每次接種耗時(shí)較長(zhǎng)、需無(wú)菌條件、對(duì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物創(chuàng)傷較大、術(shù)后感染率較高以及無(wú)法研究組織由正常狀態(tài)逐漸發(fā)展為癌癥的完整過程等不足。該法的誘瘤率也接近于100%，其中VX2腫瘤細(xì)胞株與其它口腔癌細(xì)胞株系相比在誘導(dǎo)時(shí)間，成功率，穩(wěn)定性等方面有著獨(dú)到優(yōu)勢(shì)。

基因修飾口腔癌動(dòng)物模型既可在整體組織器官水平對(duì)動(dòng)物進(jìn)行研究，又可在分子和細(xì)胞水平深入研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制；可較為完整的觀測(cè)腫瘤的浸潤(rùn)、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程，是目前構(gòu)建口腔癌動(dòng)物模型的發(fā)展趨勢(shì)。但在基因敲除的所有細(xì)胞中以及在轉(zhuǎn)基因的許多細(xì)胞中都存在突變，而在人腫瘤發(fā)展期間，突變僅在由正常細(xì)胞包圍的少數(shù)腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)，并且早期遺傳改變可能影響胚胎發(fā)育，從而混淆腫瘤的發(fā)生。轉(zhuǎn)基因小鼠和敲除小鼠通常不具有多重突變，也不發(fā)展轉(zhuǎn)移，而這正是人類腫瘤發(fā)生的標(biāo)志。此外，該模型也存在轉(zhuǎn)錄效率低或外源基因表達(dá)效率低、基因?qū)胛恢貌环€(wěn)定、脫靶問題較為嚴(yán)重等問題。

5　展望

動(dòng)物模型不僅是研究疾病的發(fā)生發(fā)展、預(yù)防以及治療的重要材料，而且是測(cè)試臨床新技術(shù)的重要平臺(tái)。目前，化學(xué)誘導(dǎo)口腔癌動(dòng)物模型的研究已步入相對(duì)成熟的階段，特別是4NQO模型和DMBA模型已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于癌變以及癌前病變等研究中。近年來(lái)因CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)潔高效、使用方便快捷以及適用范圍廣等優(yōu)勢(shì)被快速地應(yīng)用于各種基因修飾動(dòng)物模型的建立中[22]。在未來(lái)的研究中，將高通量測(cè)序技術(shù)與新型的CRISPR基因編輯技術(shù)相結(jié)合，可以更加高效的利用所構(gòu)建的動(dòng)物模型來(lái)深入研究口腔癌的發(fā)病機(jī)制、探索新的治療方案，有利于將實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果快速轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用中，具有廣闊的發(fā)展前景。

參考文獻(xiàn)：