一株產(chǎn)氫光合細(xì)菌的篩選及培養(yǎng)條件的優(yōu)化*

張桂芝， 江 瀾， 景佳佳

(重慶工商大學(xué) 環(huán)境與資源學(xué)院，重慶 400067)

氫能是人類未來的新能源[1]，大規(guī)模的廉價(jià)的制氫技術(shù)開發(fā)已成為急需解決的問題[2]。微生物制氫是一條可行途徑[3]。其成本低廉，環(huán)境友好，能在生產(chǎn)氫氣的同時(shí)凈化環(huán)境，因而被認(rèn)為是目前最具發(fā)展?jié)摿Φ闹茪浞椒ㄖ籟4]。目前，對生物制氫的研究主要集中在厭氧發(fā)酵產(chǎn)氫[5]和光合生物產(chǎn)氫[6]。其中光合生物產(chǎn)氫是一類主要的研究方向[7]。光合細(xì)菌是一類具有原始光能合成體系的原核生物，光合細(xì)菌產(chǎn)氫是該類微生物利用太陽能分解有機(jī)物時(shí)維持質(zhì)子和電子平衡的代謝過程[8]。光合細(xì)菌自身的產(chǎn)氫能力是光合細(xì)菌生物產(chǎn)氫技術(shù)的基礎(chǔ)，為了得到高產(chǎn)氫效率的光合細(xì)菌，可以通過傳統(tǒng)的方法從自然菌種中篩選高產(chǎn)菌種，為高效生物產(chǎn)氫技術(shù)提供優(yōu)質(zhì)菌種資源[9-10]。從豬糞廢水中分離與純化得到一株光合細(xì)菌。研究不同培養(yǎng)基、不同環(huán)境條件等因素對該光合細(xì)菌生長的影響，為后續(xù)產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)與應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料1.1.1 菌種來源

以采集的重慶巴南區(qū)某養(yǎng)殖場豬糞廢水為菌源。

1.1.2 培養(yǎng)基

光合細(xì)菌富集培養(yǎng)基配方：酵母膏0.8 g，NH4Cl1.0 g，CH3COONa3.0 g，NaHCO31.0 g，NaCl1.0 g，KH2PO40.2 g，MgCl2-6H2O 0.2 g，T.M1 mL，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0。其中T.M儲液的成分[11]：H3BO3(0.70 g/L)，MnSO4-H2O(0.389 g/L)，NaMoO4-2H2O(0.188 g/L)，Cu(NO3)2-3H2O (0.01 g/L)。

固體平板培養(yǎng)基配方：瓊脂25 g，CH3COONa1.5 g，NaCl1.0 g，NH4Cl0.5 g，NaHCO31.0 g，酵母膏0.1 g，MgCl20.2 g，KH2PO40.2 g，T.M儲液1 mL，蒸餾水1 000 mL。

1.1.3 主要儀器

GYMJ-100高壓滅菌鍋，BH2000數(shù)碼顯微鏡，UV-3100PC紫外可見分光光度計(jì)，Spx-250恒溫光照培養(yǎng)箱，ZDS-10自動量程照度計(jì)，SP6890T氣相色譜儀，F(xiàn)E20酸度計(jì)，HI9143溶解氧測定儀。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 光合細(xì)菌的分離和純化

取2 mL豬糞廢水于試管中，加入8 mL光合細(xì)菌富集液體培養(yǎng)基。膠塞密封，放置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，溫度設(shè)為30 ℃，光照度設(shè)為3級，3 000 lux，培養(yǎng)5 d。再取培養(yǎng)液2 mL于試管中，加入8 mL光合細(xì)菌富集液體培養(yǎng)基。同樣條件下培養(yǎng)，重復(fù)5次。得到細(xì)菌母液。將母液采用簡單的平板劃線法結(jié)合顯微鏡檢測，分離得到光合厭氧產(chǎn)氫細(xì)菌。在培養(yǎng)后長出的單個微粉紅色菌落上，分別挑取少許細(xì)胞接種在相同的固體平板培養(yǎng)基上，重復(fù)以上實(shí)驗(yàn)，直到分離得到純化的菌落。最后將菌落接種至光合細(xì)菌富集液體培養(yǎng)基中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，氣相色譜檢測頂空氣體，得到產(chǎn)氫光合細(xì)菌(圖1)。

圖1 擴(kuò)大培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)裝置圖Fig.1 Experimental apparatus

1.2.2形態(tài)學(xué)觀察及生理生化實(shí)驗(yàn)

將分離得到的菌體作革蘭氏染色和顯微鏡觀察?；罴?xì)胞吸收光譜的測定：取純液體培養(yǎng)物5.0 mL，8 000 r/min離心5 min，用無菌生理鹽水洗滌沉淀物，再離心、洗滌，反復(fù)3次，懸浮于60 %蔗糖溶液中，采用紫外可見分光光度計(jì)掃描菌懸液，記錄吸光度值變化曲線。作細(xì)菌的糖發(fā)酵試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)。

1.2.3 培養(yǎng)基鹽配比正交實(shí)驗(yàn)

初步培養(yǎng)表明培養(yǎng)基中鹽配比顯著影響細(xì)菌的生長，通改變細(xì)菌富集培養(yǎng)基配方中4種鹽的濃度，設(shè)計(jì)四水平四因素正交試驗(yàn)。培養(yǎng)基鹽配比正交試驗(yàn)因素水平表(表1)。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 The level-factors table of orthogonal test

按照擴(kuò)大培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方及表1中水平將4種鹽成分配制到16組50 mL比色管中。每支比色管中接種菌液5 mL，放置于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 培養(yǎng)條件的優(yōu)化

考察溫度、pH、溶解氧、光照強(qiáng)度等因素對光合細(xì)菌生長影響，并進(jìn)行動態(tài)培養(yǎng)與靜態(tài)培養(yǎng)比較。

2 結(jié)果分析

2.1 光合細(xì)菌富集與染色觀察

富集培養(yǎng)階段，培養(yǎng)液呈深紅棕色。經(jīng)過純化后，將菌種接種至擴(kuò)大培養(yǎng)基中，在光照厭氧條件下，培養(yǎng)液開始時(shí)由透明變?yōu)槲啙?，繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)液將呈現(xiàn)淡紅色，對數(shù)生長期之后培養(yǎng)液變?yōu)轷r紅色，繼續(xù)再培養(yǎng)后，菌液變?yōu)樯罴t色，后期將出現(xiàn)團(tuán)聚現(xiàn)象，并在培養(yǎng)瓶底部聚集成絮狀或塊狀沉淀。在棉塞封口富氧情況下培養(yǎng)時(shí)，發(fā)現(xiàn)菌體也能生長，但生長緩慢，菌液顏色較淺，呈微紅色。將對數(shù)生長期的菌體進(jìn)行革蘭氏染色觀察，革蘭氏染色陰性(圖2)。

圖2 革蘭氏染色照片F(xiàn)ig 2 The photograph of Gram staining

2.2 光合細(xì)菌的生理生化試驗(yàn)及吸收光譜

菌體活細(xì)胞的特征吸收峰為370、494、525、580、793、852 nm。菌綠素A在803～890 nm有特征吸收峰，類胡蘿卜素在450～530 nm有特征吸收峰。從圖3可判斷菌株含有菌綠素a和類胡蘿卜素。糖發(fā)酵試驗(yàn)產(chǎn)氣產(chǎn)酸、甲基紅試驗(yàn)顯微紅色，呈弱陽性。結(jié)合其培養(yǎng)特征和吸收光譜特征，該菌與《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》所描述的光合細(xì)菌相吻合，初步鑒定該菌屬于紅螺菌科紅螺菌屬(Rhodospirillum)，將其命名為PSB-ZF1。光合細(xì)菌菌株的鑒定除了采用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征與生理生化特征結(jié)合細(xì)菌鑒定手冊鑒定外，還應(yīng)結(jié)合其他的分類鑒定依據(jù)，如16S rRNA序列分析等分子生物學(xué)手段，只有這樣才能鑒定到種[12]，這有待于下一步研究。

圖3 菌體的光譜吸收曲線Fig 3 The spectrum absorption curve of bacteria

2.3 PSB-ZF1培養(yǎng)基配方的優(yōu)化

實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置為溫度30 ℃，光照3 000 lux，pH 7.0，酵母膏含量0.2 g/L，接種量為5 mL，50 mL比色管培養(yǎng)，其他營養(yǎng)條件參照下列正交表。觀測得到不同實(shí)驗(yàn)組菌液OD600值及極差分析如表2所示：

表2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 2 The result of orthogonal experiment

從表2極差R值可以看出，因素影響光合細(xì)菌PSB-ZF1生長OD600值的主次順序是：B>A>D>C，乙酸鈉濃度對光合細(xì)菌生長的影響十分明顯，碳酸氫鈉濃度對生長的影響最小。培養(yǎng)基中的鹽配比組成會影響細(xì)菌的生長，合適的培養(yǎng)基組成有益于微生物的生長，反之則抑制PSB-ZF1生長。根據(jù)表2均值大小，最佳培養(yǎng)基中鹽的配方組合為A2、B3、C1、D2。

2.4 環(huán)境因素對PSB-ZF1生長的影響

2.4.1 溫度對PSB-ZF1生長的影響

圖4 不同溫度下菌液吸光度值變化曲線Fig.4 The changing curve of OD600 versus culturetemperature

2.4.2 溶解氧含量的影響

采用通氧和通氮可控制培養(yǎng)基溶解氧濃度，通過不同溶氧量下PSB-ZF1培養(yǎng)物吸光度的測定以及對培養(yǎng)物狀態(tài)及顏色的觀察發(fā)現(xiàn)：光合細(xì)菌并不是嚴(yán)格厭氧細(xì)菌，在有氧條件下該微生物液可以生長。微氧或無氧環(huán)境更適合該微生物的生長，其中微氧環(huán)境又比完全無氧環(huán)境生長情況更好，說明PSB-ZF1生長還是需要微量氧氣。通常厭氧細(xì)菌在低氧分壓的條件下生長良好，而不能在空氣或10%二氧化碳濃度下的固體培養(yǎng)基表面生長。PSB-ZF1不是專性厭氧菌，屬于兼性厭氧細(xì)菌，即在較低氧分壓條件下仍可以利用有機(jī)質(zhì)進(jìn)行氧化代謝和進(jìn)行光合作用，比幾乎完全厭氧條件下的代謝活動旺盛，同時(shí)，高氮?dú)鉂舛认乱膊焕诩?xì)菌的代謝生長，但相比富氧環(huán)境，PSB-ZF1生長要好。圖5表明最佳溶解氧量為2.02 mg/L。

圖5 不同溶解氧含量下培養(yǎng)72 h菌液吸光度值柱狀圖Fig 5 Bar chart of OD600 versus dissolved oxygenconcentration

2.4.3 pH值對PSB-ZF1生長的影響

當(dāng)培養(yǎng)基初始pH為7時(shí)，PSB-ZF1的生長是最快的，偏堿性條件下的生長情況不如偏酸性條件好，而過酸或過堿環(huán)境都不利甚至抑制微生物的生長，如pH6.0和pH8.5時(shí)的OD值曲線所示。后期生長曲線都趨于平緩，表明PSB-ZF1生長速度減緩(圖6)。由于氫離子濃度影響酶的活性，因此也影響PSB-ZF1的生長速率。pH對PSB-ZF1的生命活動的影響的可能原因?yàn)椋阂皇菑?qiáng)酸和強(qiáng)堿性條件會使蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子變性，影響其生物活性；二是pH的變化會引起PSB-ZF1細(xì)胞膜電荷變化，導(dǎo)致PSB-ZF1細(xì)胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)的能力改變；其三是pH的變化可能改變環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)的可給性。因此，可在PSB-ZF1培養(yǎng)過程應(yīng)中加入pH緩沖系統(tǒng)，不斷調(diào)整pH值，如磷酸氫鉀/磷酸二氫鉀系統(tǒng)。

圖6 不同培養(yǎng)基pH值條件下菌液吸光度值變化曲線Fig 6 OD600 change under different pH value of culture medium

2.4.4 光照強(qiáng)度對PSB-ZF1生長的影響

光能是光合細(xì)菌生長的必要條件，當(dāng)光強(qiáng)過低或者無光照時(shí)，其生長將可能停止。固定其他培養(yǎng)條件，在不同的光照強(qiáng)度下，PSB-ZF1生長的快慢不同。不同光照強(qiáng)度下PSB-ZF1菌液OD值隨時(shí)間變化曲線如圖7所示：

圖7 不同光照強(qiáng)度下菌液吸光度值變化曲線Fig 7 OD600 change under different illumination intensities

由圖7可發(fā)現(xiàn)，相比低的光照強(qiáng)度，高的光照強(qiáng)度有利于PSB-ZF1的生長，在低于3 000 lux光照強(qiáng)度條件下，由于供給細(xì)菌生長的光能不足，PSB-ZF1生長緩慢；但是在過高的光照強(qiáng)度下，由于入射光能超過了PSB-ZF1生長所需的最大吸收量，且對細(xì)菌生長的抑制作用也會影響PSB-ZF1的生長速率。在實(shí)驗(yàn)條件下，光照度控制在3 000 lux左右為宜。

2.4.5 動態(tài)培養(yǎng)與靜態(tài)培養(yǎng)比較

動態(tài)培養(yǎng)PSB-ZF1的生長狀況明顯要好于靜態(tài)組(圖8)。靜置培養(yǎng)時(shí)，由于重力沉降作用，PSB-ZF1及營養(yǎng)物都會出現(xiàn)分層現(xiàn)象，即大部分的PSB-ZF1都會集中在培養(yǎng)容器靠近底部的位置，就會造成局部的微生物過于集中，而營養(yǎng)物質(zhì)供給不足，影響整個PSB-ZF1群落的生長。而攪拌就能消除這一現(xiàn)象，通過水利擾動，使?fàn)I養(yǎng)物質(zhì)均勻地分散在整個培養(yǎng)容器中，從而減小傳質(zhì)的擴(kuò)散阻力，持續(xù)的供應(yīng)PSB-ZF1生長。因而動態(tài)培養(yǎng)較靜態(tài)培養(yǎng)更有利于PSB-ZF1的生長。

圖8 靜態(tài)培養(yǎng)與動態(tài)培養(yǎng)下菌液吸光度隨時(shí)間變化曲線Fig.8 OD600 change under static and dynamic conditions

以最佳培養(yǎng)條件培養(yǎng)72 h，經(jīng)測得PSB-ZF1培養(yǎng)液OD值，培養(yǎng)前為OD600為0.167，培養(yǎng)后OD600為1.998，顏色呈鮮紅色，生物量充足，可以用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)(圖9)。

圖9 培養(yǎng)前后菌液對比照片(A：0 h；B：72 h)Fig.9 Pictures of culture suspension for pre-culture andpost-culture(A：0 h；B：72 h)

3 結(jié) 論

從養(yǎng)殖場豬糞廢水中通過富集、平板劃線分離純化得到一株光合細(xì)菌PSB-ZF1，初步鑒定該菌屬于紅螺菌科紅螺菌屬(Rhodospirillum)光合細(xì)菌。

光合細(xì)菌PSB-ZF1培養(yǎng)基優(yōu)化配方為：氯化銨1.0 g，乙酸鈉2.0 g，碳酸氫鈉0.5 g，氯化鈉1.0 g，磷酸二氫鉀0.2 g，六水氯化鎂0.2 g，T.M液1 mL，蒸餾水1 000 mL，酵母膏0.8 g時(shí)，能最大限度提供該P(yáng)SB-ZF1生長的營養(yǎng)底物。

PSB-ZF1在攪拌狀態(tài)下，接種量為10%，光強(qiáng)為3 000 lux，培養(yǎng)基溶解氧含量為2.0 mg/L、初始pH7.0時(shí)生長情況最佳。在此培養(yǎng)條件下培養(yǎng)72 h，可獲得高濃度PSB-ZF1光合細(xì)菌菌液，利于后續(xù)產(chǎn)氫實(shí)驗(yàn)研究。

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