誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化的研究進(jìn)展

熊蓉 馮剛 李戰(zhàn)梅,2

角膜疾病是我國(guó)主要致盲眼病之一，也是眼球摘除的第一致病因素。據(jù)國(guó)家衛(wèi)計(jì)委數(shù)據(jù)顯示，我國(guó)有200多萬的眼角膜盲癥患者。角膜是非角質(zhì)化的多層透明無血管組織，由上皮細(xì)胞層、前彈力層、基質(zhì)層、后彈力層和內(nèi)皮細(xì)胞層組成，位于眼球最外層，極易受到化學(xué)、物理和生物等因素的傷害。角膜的表面即上皮細(xì)胞層由一種獨(dú)特的非角化上皮細(xì)胞構(gòu)成，稱為角膜上皮細(xì)胞（cornea epithelial cells，CECs）。角膜緣深部的角膜緣干細(xì)胞（limbal stem cells，LSCs）不斷分化，并且遷移至角膜中央維持著CECs的數(shù)量穩(wěn)定，從而維持著角膜的正常視覺功能。急性創(chuàng)傷、慢性疾病甚至佩戴接觸鏡[1]等都容易導(dǎo)致LSCs缺乏，產(chǎn)生角膜緣干細(xì)胞缺乏癥（limbal stem cell defi ciency，LSCD）。LSCs缺乏會(huì)使CECs更新和修復(fù)功能受阻，角膜上皮反復(fù)缺損、糜爛、潰瘍；角膜結(jié)膜化；新生血管長(zhǎng)入及假性胬肉形成等，最終造成視力損害。LSCD是導(dǎo)致眼盲病的第二大因素[2-3]。

目前，LSCD的治療方式有自體或異體角膜緣移植、體外培養(yǎng)的LSCs移植、體外培養(yǎng)的口腔黏膜細(xì)胞移植、自體或異體結(jié)膜移植等[3]?？偟膩碚f，雖然這些治療具有一定療效，但是慢性炎癥和免疫排斥反應(yīng)常常影響手術(shù)的成功率。并且對(duì)于雙側(cè)LSCs缺失的患者來說，不能自體組織或細(xì)胞移植，若進(jìn)行體外培養(yǎng)的口腔黏膜細(xì)胞移植，移植體又存在新生血管的風(fēng)險(xiǎn)[4]。利用多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為CECs，再進(jìn)行移植來治療雙眼LSCD患者以規(guī)避免疫排斥反應(yīng)和新生血管生成的治療方案得到大家認(rèn)可。目前已有大量研究探索了將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)為CECs的方法及其相關(guān)的信號(hào)通路和關(guān)健信號(hào)分子，為重建眼表提供了新的種子細(xì)胞和臨床治療提供了新方向。

一 、多能干細(xì)胞

多能干細(xì)胞，具有分化出多種細(xì)胞組織的潛能，包括胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cell，ESCs）和誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs），是目前細(xì)胞領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。ESCs是從早期胚胎（原腸胚期之前）內(nèi)細(xì)胞團(tuán)中分離出來的一類細(xì)胞，它具有體外培養(yǎng)無限增殖、自我更新和多向分化的特性。研究表明，ESCs可誘導(dǎo)分化為機(jī)體大部分細(xì)胞類型[5]，包括角膜上皮樣細(xì)胞。雖然ESCs具有強(qiáng)大的分化潛能，是一種良好的種子細(xì)胞，但ESCs的獲得存在倫理學(xué)爭(zhēng)議，而且由ESCs分化得到的CECs在臨床應(yīng)用中還會(huì)存在免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)，倫理學(xué)及免疫排斥問題，限制了其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用。

2006年，Yamanaka等[6]將反轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的Oct-3/4、Sox2、Klf4及c-Myc四個(gè)基因轉(zhuǎn)入小鼠成纖維母細(xì)胞，將成體細(xì)胞重編程為具有多向分化潛能的干細(xì)胞，并將該類干細(xì)胞命名為iPSCs。iPSCs的成功突破為組織再生提供了一種新的多能干細(xì)胞，它具有與ESCs同樣的多能性。iPSCs細(xì)胞在體內(nèi)可分化為3個(gè)胚層來源的所有細(xì)胞，進(jìn)而參與形成機(jī)體所有組織和器官。在體外，iPSCs細(xì)胞可定向誘導(dǎo)分化出多種成熟細(xì)胞[7]，包括CECs。將自身來源的iPSCs誘導(dǎo)為角膜上皮樣細(xì)胞，既消除了免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)，也避免了社會(huì)倫理的問題，可為臨床治療和重建眼表提供來源充足的細(xì)胞。

二、iPSCs分化為CECs的方法

目前，將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為CECs主要是通過轉(zhuǎn)染導(dǎo)入外源基因、小分子誘導(dǎo)或模擬CECs的微環(huán)境與其他細(xì)胞共培養(yǎng)等方法（表1），達(dá)到下調(diào)iPSCs或ESCs的干性基因表達(dá)量、激活CECs的標(biāo)記基因表達(dá)的效果，從而將iPSCs或ESCs誘導(dǎo)分化為角膜上皮樣細(xì)胞，角膜上皮樣細(xì)胞的鑒定則通過檢測(cè)分化細(xì)胞的角蛋白K3/12（keratin 3/12）、轉(zhuǎn)錄因子p63（tumourprotein63）等的表達(dá)情況來判斷。

（一）轉(zhuǎn)基因iPSCs分化為CECs

人類Pax6基因（Paired box 6，Pax6）是眼部發(fā)育過程中重要的轉(zhuǎn)錄因子，維持著CECs正常的表型，并且可以調(diào)節(jié)角膜細(xì)胞數(shù)量[8]。Ueno等[9]將Pax6基因轉(zhuǎn)染入小鼠ESCs，可將ESCs誘導(dǎo)分化形成單層角膜上皮樣細(xì)胞，檢測(cè)結(jié)果顯示，該細(xì)胞可表達(dá)角蛋白CK12、E-cadherin和CD44，進(jìn)一步將誘導(dǎo)分化后的角膜上皮樣細(xì)胞移植到小鼠的受損角膜模型上，結(jié)果表角膜上皮樣細(xì)胞能夠成活并向角膜損傷區(qū)遷移，恢復(fù)受損視力。近年研究揭示[10]，WNT7A通過Pax6控制CECs分化，沉默WNT7A或Pax6都將導(dǎo)致LSCs向皮膚上皮樣細(xì)胞分化，將Pax6基因轉(zhuǎn)染入皮膚上皮干細(xì)胞重編程為L(zhǎng)SCs樣細(xì)胞，移植到兔受傷眼表，這些重編程細(xì)胞添補(bǔ)了CECs，修復(fù)了受傷眼表。但又有研究表明，小鼠Pax6過表達(dá)導(dǎo)致CECs形態(tài)學(xué)改變、新生血管、免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和屏障破壞，指出Pax6的直接功能是維持CECs表型正常[11]。此外，Pax6基因在胚胎發(fā)育過程中也起著重要作用，Pax6基因突變有可能導(dǎo)致先天性無虹膜、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、黃斑發(fā)育不良、Peters異常等眼病。因此，Pax6不僅在早期眼部發(fā)育過程中起關(guān)鍵作用，也是LSCs分化的關(guān)鍵信號(hào)分子，其表達(dá)的正常與否對(duì)角膜發(fā)育和維持CECs的數(shù)量至關(guān)重要，調(diào)控Pax6或和其他信號(hào)分子的表達(dá)可能實(shí)現(xiàn)其他類型細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為角膜上皮樣細(xì)胞，激活Pax6基因可能有助于治療眼表上皮細(xì)胞的鱗狀化病變[12]。

（二）模擬微環(huán)境iPSCs分化為CECs

干細(xì)胞的微環(huán)境維持著其未分化狀態(tài)，微環(huán)境中各因素也共同決定著干細(xì)胞的分化方向。LSCs的微環(huán)境是由角膜基底膜和胞外基質(zhì)組成，包含膠原、非膠原蛋白和蛋白多糖，還有多種自分泌和旁分泌細(xì)胞因子及其受體[13]。在膠原成分中，最重要的是Ⅳ型膠原，維持LSCs的正常分化、增殖和未分化狀態(tài)。根據(jù)角膜緣微環(huán)境能夠調(diào)控干細(xì)胞生理特性的原理，將小鼠iPSCs培養(yǎng)于Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)板中，通過Transwell共培養(yǎng)系統(tǒng)與分離的角膜緣成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)，第12天出現(xiàn)大量圓形扁平上皮樣細(xì)胞，并且RT-PCR結(jié)果顯示CECs特異性標(biāo)記物角蛋白K12和LSCs標(biāo)記物Pax6均有所表達(dá)，干性標(biāo)記基因Nanog表達(dá)降低，表明iPSCs經(jīng)共培養(yǎng)定向誘導(dǎo)為角膜上皮樣細(xì)胞是可行的[14]。

為了促進(jìn)誘導(dǎo)的角膜上皮樣細(xì)胞的臨床應(yīng)用，研究者們?cè)囅肽MLSCs的微環(huán)境，將來源于人的多能干細(xì)胞分化為角膜上皮樣細(xì)胞。Ahmad等[15]將人ESCs與3T3細(xì)胞分別在Ⅳ型膠原、層粘連蛋白、纖維蛋白原共培養(yǎng)，6 d后發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞變?yōu)楸馄綐?，在分化過程中，RT-PCR結(jié)果顯示K3/12、p63以及皮膚上皮細(xì)胞標(biāo)志物CK10均有表達(dá)，表明實(shí)現(xiàn)了人ESCs向角膜上皮樣細(xì)胞的分化。雖然終末分化結(jié)果顯示不僅有角膜上皮樣細(xì)胞還有皮膚上皮樣細(xì)胞，但是此方法為探索早期角膜上皮發(fā)育過程中的變化提供了分化模型。Kawasaki等[16]通過基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)方法（stromal cellderived inducing activity，SDIA），將人成纖維細(xì)胞和角膜緣上皮干細(xì)胞來源的iPSCs分別和小鼠骨髓來源的基質(zhì)細(xì)胞PA-6細(xì)胞單層（MMC-treated PA6 feeder layer）共培養(yǎng)，首次實(shí)現(xiàn)人源iPSCs分化為CECs，表達(dá)角蛋白CK3/12，但培養(yǎng)時(shí)間為12 ～ 16周，周期太長(zhǎng)，不適宜臨床應(yīng)用。

表1 誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化為角膜上皮樣細(xì)胞典型方法的比較

此外，研究者不斷探索通過改進(jìn)細(xì)胞培養(yǎng)條件，嘗試應(yīng)用不加血清和飼養(yǎng)層細(xì)胞的條件培養(yǎng)基iPSCs定向分化，既能避免由于動(dòng)物血清加入而帶來的培養(yǎng)條件復(fù)雜性和不確定性，同時(shí)也能保證細(xì)胞的正常增殖和分化。研究者用人成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基（LFCM）和無血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基（mTeSR-1），將人ESCs誘導(dǎo)分化為CEC樣細(xì)胞，21 d時(shí)就達(dá)到了99%CK3陽(yáng)性率，該方法既無飼養(yǎng)層細(xì)胞又無血清，操作簡(jiǎn)便，為改進(jìn)后續(xù)誘導(dǎo)方法提供了一種新思路[17]。也有研究者僅用角膜緣成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)基（limbal fi broblast conditioned medium，LFCM）培養(yǎng)人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞，轉(zhuǎn)分化為角膜上皮樣細(xì)胞，這項(xiàng)研究為使用自體細(xì)胞重編程為角膜上皮樣細(xì)胞治療LSCD提供了新方法[18]。

（三）小分子iPSCs分化為CECs

外源性小分子化合物，因其調(diào)節(jié)作用單一和操作簡(jiǎn)單的優(yōu)點(diǎn)，作為干細(xì)胞調(diào)節(jié)藥物的潛力越發(fā)受到人們重視[19]。Arkell等[20]研究表明，在胚胎發(fā)育過程中，角膜上皮來源于頭（眼）表面外胚層的分化，并且此過程的完成必須阻斷TGF-β/節(jié)點(diǎn)和Wnt/β-catenin通路，Mikhailova等[21]使用小分子抑制劑（TGF-β抑制劑：SB-505124，Wnt抑制劑：IWP-2）和bFGF，阻斷人iPSCs的TGF-β/節(jié)點(diǎn)和Wnt/β-catenin通路，并且激活FGF信號(hào)，將hiPSCs分化為CEC樣細(xì)胞，誘導(dǎo)5周后有95%的p63陽(yáng)性細(xì)胞，蛋白質(zhì)組學(xué)分析結(jié)果表明，誘導(dǎo)的角膜上皮樣細(xì)胞和CECs蛋白質(zhì)表達(dá)水平極為相似，證實(shí)使用小分子將iPSCs誘導(dǎo)為CECs是可行的，該方法既沒有添加血清也沒有飼養(yǎng)層細(xì)胞，并且具有很高的重復(fù)性，具有很好的臨床醫(yī)用價(jià)值。

此外，還有一些生長(zhǎng)因子也對(duì)角膜細(xì)胞的增殖和分化起重要作用。在早期胚胎發(fā)育過程中，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（FGFR2）是CECs增殖和分化所必需的，且通過ERK單獨(dú)信號(hào)通路維持Pax6表達(dá)水平[22]。胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGF）與LSCs的增殖、分化和遷移相關(guān)，并且IGF-2可誘導(dǎo)LSCs分化為K12陽(yáng)性的細(xì)胞[23]。另外表皮生長(zhǎng)因子（EGF）信號(hào)通路是刺激細(xì)胞增殖、遷移和促進(jìn)CECs愈合的主要信號(hào)通路，并且表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）信號(hào)激活NF-κB通路，激活轉(zhuǎn)錄阻遏因子CTCF，下調(diào)Pax6表達(dá)，引起CECs增殖和遷移[24]。

利用小分子化合物誘導(dǎo)患者自身來源的iPSCs分化為角膜上皮樣細(xì)胞，能減少外源基因和病毒的使用，并且以促進(jìn)CECs增殖和遷移的細(xì)胞因子和蛋白建立可替代血清的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，不添加血清和飼養(yǎng)層細(xì)胞，提高了安全性，必將成為iPSCs在角膜盲病治療中未來研究的主要方向。

三、角膜上皮樣細(xì)胞應(yīng)用前景分析

綜上所述，將多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為角膜上皮樣細(xì)胞，應(yīng)用于臨床上受傷眼表恢復(fù)視力是具有前景的。但目前的分化方法得到角膜上皮樣細(xì)胞，不能達(dá)到100%陽(yáng)性率，存在未分化細(xì)胞和其他類型的細(xì)胞，分化時(shí)間較長(zhǎng)，限制了角膜上皮樣細(xì)胞的臨床應(yīng)用。

誘導(dǎo)獲得的角膜上皮樣細(xì)胞是否具有人體內(nèi)CECs的生物學(xué)功能，其安全性、致瘤性以及移植到體內(nèi)模型中的存活率、免疫排斥反應(yīng)、抗血管生成作用等都是進(jìn)入臨床應(yīng)用前必須考慮和解決的問題。研究者還需要進(jìn)一步探索更加高效、快速的誘導(dǎo)分化方案和純化方法，并移植到動(dòng)物模型進(jìn)行可行性應(yīng)用研究，為CECs移植治療最終進(jìn)入臨床醫(yī)用奠定基礎(chǔ)。

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