臍血單個核細(xì)胞對缺血性腦卒中的臨床干預(yù)

滿勇 王飛 姬汴生 李建斌 張大煥 馬冀 周璐 李青 丁金萍 王曉鳴 單泓 李錦山 李新民 李金花

腦卒中高致殘率給家庭和社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)，是神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究和治療的重點、難點。由于低灌注及繼發(fā)內(nèi)源性毒物的產(chǎn)生，使神經(jīng)細(xì)胞在短時間內(nèi)死亡，目前對于缺血性腦卒中的內(nèi)科治療僅限于改善腦循環(huán)，營養(yǎng)腦細(xì)胞，清除氧自由基等對癥治療，甚至目前組織纖溶酶原激活劑作為惟一被美國食品和藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)治療急性缺血性腦卒中的藥物，也因為治療的時間窗窄及增加顱內(nèi)出血的風(fēng)險等原因，臨床應(yīng)用受到很大限制。卒中多數(shù)患者經(jīng)短期治療病情好轉(zhuǎn)出院后仍留下不同程度的偏癱、感覺障礙偏者、言語障礙、認(rèn)知障礙、行為異常、精神癥狀、性格改變及吞咽困難等后遺癥，使腦卒中后3個月康復(fù)過程變得緩慢、復(fù)雜而困難。目前，臍血細(xì)胞已廣泛用于治療血液系統(tǒng)疾病，而用于缺血性腦卒中治療的報道較為少見。由于臍血具有污染率低，易收集和保存、抗原性弱等特點，臍血單個核細(xì)胞用于中樞退行性疾病的治療已成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點[1]。本研究將人臍血單個核細(xì)胞（human cord blood mononuclear cell，HCMNC）經(jīng)手背淺靜脈輸注缺血性腦卒中患者，觀察對神經(jīng)功能、運動功能及日常生活能力（ADL）的作用及安全性的影響，為其用于臨床缺血性腦卒中的治療提供依據(jù)。

資料與方法

一、資料

選取2008年4月至2015年5月在鄭州市第二人民醫(yī)院、鄭州大橋醫(yī)院門診和住院的符合入選標(biāo)準(zhǔn)病例76例。急性期患者12例，分為臍血MNC組和對照組各6例，臍血MNC組中男3例，女3例，年齡65 ～ 81歲，平均73.5歲，病程14 ～ 18 d，平均15.3 d，其中高血壓病2例，糖尿病2例，高血壓合并糖尿病2例；主要梗死部位：中腦1例，基底節(jié)區(qū)5例，合并多發(fā)腔隙性腦梗塞3例。對照組：男2例，女4例；年齡60 ～ 79歲，平均68.5歲；病程14 d，伴有高血壓3例，糖尿病2例；主要梗死部位：基底節(jié)區(qū)6例，合并多發(fā)腔隙性腦梗塞2例。以上2組一般資料差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；慢性期患者64例隨機分為臍血MNC組和對照組各32例。臍血MNC組中男13例，女19例；年齡60 ～ 84歲，平均72.7歲；病程3 ～ 6個月，平均4.8個月；伴有高血壓25例，糖尿病15例；主要梗死部位：頂葉2例，顳葉3例，中腦2例，橋腦3例，基底節(jié)區(qū)22例，合并多發(fā)腔隙性腦梗塞23例。對照組：男15例，女17例；年齡60 ～ 83歲，平均71.5歲；病程3 ～ 6個月，平均4.5個月；合并糖尿病13例，高血壓病27例；主要發(fā)病部位：基底節(jié)區(qū)梗死22例，完全前循環(huán)梗死（TACI）2例，頂葉區(qū)3例，顳葉區(qū)5例，32例患者伴有多發(fā)腔隙性腦梗塞者25例。上述2組一般資料差異無統(tǒng)計學(xué)意義。腦梗死的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)，參照中華神經(jīng)科學(xué)會于1996年制定的《各類腦血管疾病診斷要點》[2]，全部經(jīng)影像學(xué)檢查證實確診。

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合中華醫(yī)學(xué)會神經(jīng)病學(xué)分會編寫的《中國急性腦缺血性腦卒中診治指南2010》中的腦梗死的診斷標(biāo)準(zhǔn)；臨床診斷為腦梗死，并經(jīng)影像學(xué)檢查確診，排除蛛網(wǎng)膜下腔出血和腦出血；（2）意識清楚，不影響神經(jīng)功能評分者；（3）60 ～ 84歲住院患者，性別不限；（4）病程：急性期20 d以內(nèi)，慢性期3 ～ 6個月以內(nèi)；（5）未采取溶栓治療者；（6）研究方案通過醫(yī)院倫理委員會審核，并經(jīng)相關(guān)患者及親屬同意。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）不符合急性期患者納入標(biāo)準(zhǔn)者；（2）合并嚴(yán)重心、肺、肝腎功能障礙者；（3）排除腦腫瘤、腦積水、癲癇、植物生存病例及其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)器質(zhì)性病變；（4）嚴(yán)重精神疾病；（5）過敏體質(zhì)。

二、方法

1.設(shè)計、實施及評估者：實驗設(shè)計、干預(yù)實施及結(jié)果評估人員均經(jīng)過系統(tǒng)培訓(xùn)，未使用盲法評估。

2.人臍血單個核細(xì)胞的采集與分離：新生兒臍血由鄭州大橋醫(yī)院提供，產(chǎn)婦及家屬均簽署知情同意書。臍血單個核細(xì)胞溶液由河南省紅十字血液中心成分室提供，具體方法參考文獻[3]。

3.治療方法：急性期患者：對照組給予常規(guī)治療，主要包括控制血糖，降低血壓，抑制血小板聚積，保護腦神經(jīng)細(xì)胞，對癥支持治療等，治療組在常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用臍血MNC,通過手背淺靜脈將血型相同臍血MNC輸注入腦卒中患者體內(nèi)，每例輸入6次，每次細(xì)胞數(shù)大于或等于1×108個，每次間隔1 ～ 7 d；慢性期患者：臍血MNC組在康復(fù)治療基礎(chǔ)上加用臍血MNC（方案同上），對照組采用康復(fù)治療。

4.評定方法：患者在治療前后3至6個月，通過康復(fù)科醫(yī)師評價。評價標(biāo)準(zhǔn)：（1）腦卒中患者臨床神經(jīng)功能缺損程度評分標(biāo)準(zhǔn)（neural function defi ciency，NFD）：包括意識、水平凝視、面癱、言語、上肢肌力、手肌力、下肢肌力、步行能力，總分45分。（2）患側(cè)肢體運動功能評價標(biāo)準(zhǔn)Fugl-Meyer（Fugl-Meyer assessment，F(xiàn)MA）：含上下肢運動功能、平衡能力、感覺功能、關(guān)節(jié)活動度等，總分226分。（3）日常生活評價（ADL）的Barthel指數(shù)（Barthelindex，BI）：含進餐、洗澡、修飾、穿衣、平衡行走、上下樓梯等，總分100分。評價標(biāo)準(zhǔn)參考文獻[4-6]。

表1 臍血MNC靜脈輸注對急性缺血性腦卒中患者的影響（n = 6，±s）

表1 臍血MNC靜脈輸注對急性缺血性腦卒中患者的影響（n = 6，±s）

NFD評分Fugel-MeyerBarthel指數(shù)分組治療前治療后治療前治療后治療前治療后上肢下肢上肢下肢對照組28.00±4.4224.33±5.1611.66±2.5011.83±2.4815.00±3.6316.83±4.9128.33±6.0542.50±5.20臍血MNC組26.83±5.5511.50±2.5811.66±2.9412.66±3.0122.16±2.6332.00±5.3221.66±5.5765.83±7.35 t 值0.6495.4420.000-0.523-3.871-5.0482.033-6.387 P值0.4050.0001.000 0.612 0.003 0.0010.069 0.000

表2 臍血MNC靜脈輸注對缺血性腦卒中慢性期患者的影響（n = 32，±s）

表2 臍血MNC靜脈輸注對缺血性腦卒中慢性期患者的影響（n = 32，±s）

NFD評分Fugel-MeyerBarthel指數(shù)分組治療前治療后治療前治療后治療前治療后上肢下肢上肢下肢對照組24.40±4.7723.09±3.949.25±2.949.69±2.98 9.16±2.60 9.69±2.9827.6±4.4729.9±5.36臍血MNC組23.10±4.5412.41±3.838.81±2.198.84±2.3015.10±2.0815.03±1.8625.2±3.8163.4±9.19 t 值1.12711.0120.6751.880-10.069-11.4412.28620.361 P值0.264 0.0000.5020.065 0.000 0.0000.026 0.000

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行分析。NFD、FMA及BI等數(shù)據(jù)評分以±s表示。組間比較采用獨立t檢驗，治療前后比較采用配對t檢驗，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、臍血MNC靜脈輸注對急性缺血性腦卒中患者各項指標(biāo)的影響

兩組療效比較臍血MNC組總有效率高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t= 5.442，P＜ 0.05）。

臍血MNC組治療后NFD評分明顯低于治療前和對照組（治療前t= 6.186，對照組t= 5.442，P＜0.05），說明臍血MNC能夠促進急性缺血性腦卒中患者神經(jīng)功能的恢復(fù)。臍血MNC組治療后Fugl-Meyer和BI評分明顯高于治療前和對照組（Fugl-Meyer治療前上肢t= -6.505，下肢t= -7.5386，對照組上肢t= -7.5386，下肢t= -5.048，BI治療前t= -11.916,對照組t= -6.387，P＜ 0.05），說明臍血MNC能夠促進卒中患者癱瘓肢體肌力恢復(fù)，提高患者整體生活質(zhì)量。臍血MNC組和對照組治療前差異無統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

二、臍血MNC靜脈輸注對缺血性腦卒中慢性期患者各項指標(biāo)的影響

兩組療效的比較臍血MNC組總有效率高于對照組，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=11.012，P＜0.05）。臍血MNC組治療后NFD評分明顯低于治療前和對照組（治療前t= 10.184，對照組t= 11.012，P＜ 0.05），說明臍血MNC能夠促進缺血性腦卒中慢性期患者神經(jīng)功能的恢復(fù)。臍血MNC組治療后Fugl-Meyer和BI評分明顯高于治療前和對照組（Fugl-Meyer治療前上肢t= -11.748，下肢t =-12.619，對照組上肢t= -10.069，下肢t= -11.441，BI 治療前t= -21.733,對照組t =20.361，P＜ 0.05），說明臍血MNC能夠促進卒中患者癱瘓肢體肌力恢復(fù)，提高患者整體生活質(zhì)量。臍血MNC組和對照組治療前無差異（表2）。

討 論

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells, MSC）是一類來源于中胚層的多潛能干細(xì)胞，廣泛存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中。目前用于腦梗死治療研究的MSC主要包括骨髓MSC和臍血MSC。骨髓源性MSC取材不方便、易污染，并隨供體年齡增加細(xì)胞增殖和分化力降低，很難應(yīng)用于臨床，因此干細(xì)胞研究專家正致力于探尋可取代骨髓MSC的干細(xì)胞源。

人臍血MNC主要包含造血干細(xì)胞和MSC。造血干細(xì)胞作為臍血干細(xì)胞的主要成員，具有分化為各種血細(xì)胞前體細(xì)胞的能力。雖然臍血中的CD34陽性細(xì)胞僅占有核細(xì)胞的1%，骨髓中CD34陽性細(xì)胞占有核細(xì)胞的1% ～ 3%。但最原始造血干細(xì)胞卻不表達(dá)HLA-DR和CD38，CD34+HLADR-和CD34+CD38-細(xì)胞在臍血中的比例高于骨髓。所以，固然臍血中CD34陽性細(xì)胞數(shù)少于骨髓，但臍血中的造血干細(xì)胞更原始、增殖能力更強。臍血MSC是臍血中的非造血組織多能干細(xì)胞，不僅可分化為中胚層來源的多種細(xì)胞如脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞及肌細(xì)胞等，還可分化為內(nèi)胚層來源的肝細(xì)胞和外胚層來源的神經(jīng)細(xì)胞。目前的研究結(jié)果證明，臍血間充質(zhì)干細(xì)胞不僅具有多向分化潛能，還可聯(lián)合造血干細(xì)胞，提高造血重建能力和發(fā)揮部分免疫調(diào)節(jié)作用[7]。

人臍血MNC由外周血入腦主要與黏附分子介導(dǎo)的特異性轉(zhuǎn)移、血腦屏障固有簿弱環(huán)節(jié)、血腦屏障通透性的改變及病變組織的趨化作用等有關(guān)[8]。人臍血內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell, EPC）能促進血管內(nèi)皮形成管腔結(jié)構(gòu)、加速缺血組織血管化，促進損傷部位的血管重建和血流改善[9-11]；多項實驗研究發(fā)現(xiàn)體循環(huán)移植人臍血來源干細(xì)胞能提高缺血腦組織VEGF水平、抑制缺血后神經(jīng)細(xì)胞凋亡、促進神經(jīng)祖細(xì)胞增殖，最終促進神經(jīng)組織的修復(fù)[12-16]。

本研究采用無菌塑料采血袋密閉式采血方法采集臍血，并用無菌塑料袋分離人臍血MNC，分離后每袋MNC的平均細(xì)胞數(shù)≥1×108個，紅細(xì)胞殘余量僅為（0.70±0.27）×109個。通過手背淺靜脈將血型相同臍血MNC輸注入卒中患者體內(nèi)，每例患者平均輸注6份，每份間隔時間1 ～ 7 d，結(jié)果顯示：起效時間長短不一，大部分在治療半個月內(nèi)出現(xiàn)治療效果，如能提高患者的視力、聽力，提高癱瘓肢體肌力，恢復(fù)其站立、運動行走能力，緩解肢體痙攣、改善睡眠障礙、減輕肢體和面部麻木，改善語言障礙，恢復(fù)患者遠(yuǎn)期記憶力，提高及恢復(fù)患者的認(rèn)知功能及情感反應(yīng)等。由于卒中的病理基礎(chǔ)是腦動脈硬化，它是全身性動脈硬化閉塞性疾病在腦部的局部表現(xiàn)，因此這類患者處于動脈硬化閉塞性疾病所造成的機體多系統(tǒng)、多器官和組織長期慢性缺血缺氧的病理狀態(tài)下，推測與臍血MNC經(jīng)手背淺靜脈進入機體循環(huán)系統(tǒng)，改善了患者血液系統(tǒng)、心肌功能、肝功能和免疫功能，從而改善了機體內(nèi)環(huán)境，對機體各個系統(tǒng)及組織細(xì)胞的潛在性病變進行修復(fù)、替代，促進新生組織再生，從而改善和提高了患者全身整體的修復(fù)機能，并在病變?nèi)毖獏^(qū)、組織損傷部位形成新生血管，改善腦灌注，促進血流恢復(fù)和損傷修復(fù)，減輕了機體內(nèi)皮細(xì)胞機能不全引起的微血管病變和局部炎癥反應(yīng)。

以往研究表明[15]，大腦中動脈阻塞大鼠24 h后輸入人臍血來源干細(xì)胞能明顯降低腦梗死體積，改善神經(jīng)功能缺損評分，術(shù)后1周植入人臍血來源干細(xì)胞僅體現(xiàn)于神經(jīng)功能缺損評分變化，前者缺血區(qū)腦組織臍血細(xì)胞數(shù)目高于后者。Darsalia等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在腦卒中48 h內(nèi)移植的細(xì)胞較6周后（恢復(fù)期）移植的細(xì)胞存活率高，但延遲移植并沒有影響細(xì)胞遷移、增殖和神經(jīng)元分化，并且過多的干細(xì)胞移植并不能增加細(xì)胞存活率和神經(jīng)元分化。所以在腦卒中早期，尤其是炎癥反應(yīng)之前，移植細(xì)胞和選擇適宜的細(xì)胞移植量直接影響移植的成功率，這對臨床治療具有很大的指導(dǎo)意義。對6例腦卒中患者進行早期治療，入院后半個月病情穩(wěn)定即用臍血MNC靜脈輸注，短期內(nèi)可明顯提高癱瘓肢體肌力，及早恢復(fù)其站立、運動行走功能，減輕肢體和面部麻木，改善語言障礙，因此早期移植或更有利于病情及早恢復(fù)，大樣本臨床資料的研究有待進一步完成。

目前對于移植臍血MNC后神經(jīng)功能改善的具體機制還不清楚。大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，臍血干細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)功能的機制可能與血管再生、神經(jīng)重塑、分泌營養(yǎng)因子和減輕炎癥反應(yīng)有關(guān)。對于“橫向分化”是否存在，作者認(rèn)為臍帶血盡管來源于中胚層，而神經(jīng)干細(xì)胞來源于外胚層，但3個胚層的區(qū)分是人為的，各個胚層之間存在著相互聯(lián)系，即臍帶血中也含有來源于外胚層的神經(jīng)干細(xì)胞，因此臍帶血MNC能夠分化為神經(jīng)干細(xì)胞，并非由中胚層中的細(xì)胞橫向分化而來，而是其固有的、有關(guān)聯(lián)的外胚層細(xì)胞縱向分化而來。動物實驗也證實臍血中含有更原始的細(xì)胞如CD133+細(xì)胞，而CD133+細(xì)胞能夠分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞樣的表型細(xì)胞，同時移植臍血MNC/MSCs能夠透過血腦屏障在宿主中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)存活、分化為神經(jīng)細(xì)胞，并遷移到病變部位與宿主神經(jīng)細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上形成整合而改善感覺、運動和認(rèn)知等神經(jīng)功能的缺損。基于上述論點，神經(jīng)功能的改善可能是由臍血MNC分化而來的神經(jīng)細(xì)胞與宿主腦組織整合并參與神經(jīng)環(huán)路的重建，或者臍血干細(xì)胞含有大量的造血集落形成細(xì)胞、血小板生成素和白細(xì)胞介素11，造血集落形成細(xì)胞可產(chǎn)生造血因子集落刺激因子1，這些營養(yǎng)因子是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的生長因子，促進了腦卒中患者損傷的局部神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖以及分化，抑制細(xì)胞凋亡，降低神經(jīng)損傷，促進了功能恢復(fù)。也可能是由這些細(xì)胞分泌的營養(yǎng)因子在起作用，因為生長因子是機體調(diào)節(jié)細(xì)胞生存、增生、分化的分子機制，在梗死后應(yīng)用外源性神經(jīng)營養(yǎng)因子能限制急性神經(jīng)缺血損傷的擴展及有助于功能的恢復(fù)。Seaberg等[18]認(rèn)為：成體中樞雖保留了一些有分化潛能的干細(xì)胞，但它們通常處于“靜止”狀態(tài)，只有在某些因素作用下或者受到損傷刺激時才被激活，重新進入細(xì)胞增殖周期，并進一步分化為特定功能的神經(jīng)細(xì)胞。因此臍血MNC很可能通過自身的合成與分泌功能使靜止的神經(jīng)干細(xì)胞激活并促進神經(jīng)組織的自我修復(fù)，從而改善了中樞神經(jīng)和周圍神經(jīng)系統(tǒng)功能[19]。

筆者曾對18例卒中患者治療半年前后CT、MRI影像部分參數(shù)進行測量：（1）哈氏值（前角間最大與最小距離之和）；（2）腦室指數(shù)（側(cè)腦室脈絡(luò)叢間距離與前角最大距離之商）；（3）三腦室寬度（三腦室最大橫徑）；（4）腦溝寬度（最上方3個層面中4條最寬腦溝寬度之和）；（5）病灶體積測定：病灶體積=長×寬×層數(shù)/2。多發(fā)病灶總體積等于各病灶體積之和。對比結(jié)果發(fā)現(xiàn)，臍血MNC靜脈移植治療能緩解大面積腦梗死、脫髓鞘情況，從而提高生活質(zhì)量，腦萎縮不能緩解，但能延緩病情發(fā)展[20]。目前腦損傷動物模型都是新鮮損傷，而應(yīng)用臍血MNC多次治療陳舊性腦損傷模型的動物實驗有待進一步研究。

在細(xì)胞移植中，重建的免疫系統(tǒng)將受體的組織器官視為“外來物質(zhì)”而對其產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng)，即移植物對宿主的排斥，是在細(xì)胞移植中對生命最具威脅的影響因素之一，而臍血MNC移植由于其免疫細(xì)胞尚未發(fā)育成熟，免疫原性較弱，較少發(fā)生嚴(yán)重的免疫排斥反應(yīng)，從而使移植的成功率大大提高。發(fā)生免疫排斥反應(yīng)的必要條件是宿主免疫狀態(tài)被強力（化療）所充分抑制。本實驗治療過程中未使用任何免疫抑制劑，即患者免疫系統(tǒng)是正常的，臍血MSC中免疫細(xì)胞未發(fā)育成熟，抗原性弱，分離后的臍血MNC不擴增、不培養(yǎng)及分化，況且相同血型單次輸注細(xì)胞數(shù)量較少，宿主產(chǎn)生明顯的排異反應(yīng)和過敏反應(yīng)的概率極低。

本實驗治療過程中應(yīng)用多次臍血MNC靜脈輸注，隨訪至今未發(fā)現(xiàn)不良反應(yīng)，表明了臍血細(xì)胞確實具有“免疫逃逸”作用以及“局部專一誘導(dǎo)性分化”（site-specifi c differentiation）現(xiàn)象[21]。

綜上所述，人臍血MNC是一種極具潛力的替代細(xì)胞來源，分離后的臍血MNC不擴增、不培養(yǎng)及分化，安全性好，血型相同直接由淺靜脈輸注療法為缺血性腦卒中等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病開拓了寬闊的應(yīng)用前景。由于本組急性期治療病例較少，評定間隔時間尚短，臨床療效持續(xù)性及其副作用尚需大量樣本進行長期隨訪及統(tǒng)計學(xué)分析，植入的人臍血來源干細(xì)胞如何長期存活并與宿主腦組織整合，最佳的移植細(xì)胞數(shù)、治療時間窗，移植細(xì)胞和體內(nèi)存活細(xì)胞的比例是多少，機體又如何發(fā)揮調(diào)控作用，確切的作用機制以及是否能夠預(yù)防腦卒中等還有待進一步探索。

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