缺血缺氧性腦損傷后細(xì)胞凋亡通路及針康法干預(yù)作用的研究進(jìn)展*

劉 波，劉 穎，陳明星，景 偉，楊圓圓，唐 強

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150001； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

缺血缺氧性腦損傷(HIBD)是由新生兒在圍產(chǎn)期發(fā)生缺血缺氧導(dǎo)致的疾病。是引起中樞神經(jīng)損傷和新生兒死亡的主要原因。HIBD的發(fā)病率約為每1 000例新生兒有1至3例，在中國每年受該病影響的嬰兒多達(dá)4萬～5萬名[1]。臨床上表現(xiàn)為運動障礙或各種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，如腦癱、癲癇或嚴(yán)重的智力缺陷等[2]。目前認(rèn)為，細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致缺血缺氧性腦損傷后神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生損傷及缺血半暗區(qū)正常神經(jīng)細(xì)胞死亡的重要機(jī)制[3]。因此，阻止缺血缺氧性腦損傷后相關(guān)神經(jīng)元的細(xì)胞凋亡對降低HIBD的致殘率和死亡率尤其重要[4]。有眾多文獻(xiàn)報道稱針康法可以通過減少和抑制細(xì)胞凋亡來促進(jìn)缺血缺氧性腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)。本研究就對缺血缺氧性腦損傷后細(xì)胞凋亡通路及針康法干預(yù)作用的相關(guān)研究做出如下概述。

1 細(xì)胞凋亡內(nèi)源性通路

在腦組織發(fā)生缺血缺氧性損傷后，細(xì)胞可因內(nèi)部凋亡因子的刺激，激活細(xì)胞內(nèi)源性的凋亡途徑，造成細(xì)胞凋亡[5]。線粒體作為細(xì)胞內(nèi)重要物質(zhì)，其在細(xì)胞凋亡過程中擔(dān)任重要角色，細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性途徑依賴于線粒體外膜透化(MOMP)，其對細(xì)胞凋亡起調(diào)控作用。當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受損時，改變了線粒體的通透性，激活了細(xì)胞內(nèi)的Cyt C、Bcl-2、第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑(Smac/DIABLO)、凋亡誘導(dǎo)因子(AIF)和核酸內(nèi)切酶G(EndoG)等許多促細(xì)胞凋亡蛋白，使其在胞漿中釋放[6]。并借Caspase依賴性凋亡通路和非Caspase依賴性凋亡通路調(diào)控細(xì)胞凋亡。

1.1 Caspase依賴性凋亡通路

在細(xì)胞凋亡的途徑中，胞漿中釋放的全細(xì)胞色素C在細(xì)胞凋亡過程中起重要的作用。全細(xì)胞色素C作為參與機(jī)體氧化過程的電子傳遞體，構(gòu)成呼吸鏈并可提高細(xì)胞呼吸中氧的利用率。當(dāng)機(jī)體發(fā)生缺血缺氧性損傷時，全細(xì)胞色素C被釋放。凋亡小體和下游執(zhí)行者半胱天冬酶，特別是Caspase-3，在缺氧缺血性損傷后被激活，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。在擁有能量來源(三磷酸腺苷)的情況下，一方面，全細(xì)胞色素C借助三磷酸腺苷(ATP)發(fā)揮的作用與接頭蛋白Apaf-1結(jié)合。使活化的接頭蛋白Apaf-1與釋放的全細(xì)胞色素C及起始凋亡蛋白酶caspase-9(一種促凋亡蛋白酶)三者形成凋亡小體[7]。凋亡小體發(fā)揮作用，使被激活的caspase-7及與之相關(guān)的蛋白裂解，并激活其他caspase，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。另一方面，半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶激活劑(Smac/DIABLO)阻止已被激活的caspase-9與IAP結(jié)合，促進(jìn)caspase的活性，進(jìn)一步加快了細(xì)胞凋亡的發(fā)生[8]。

在全細(xì)胞色素C進(jìn)入胞漿的過程的同時,原癌基因Bcl-2家族也在為轉(zhuǎn)換線粒體的通透性產(chǎn)生重要影響[9]。Bcl-2家族包含促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白，其中，促凋亡蛋白包括Bax、Bak、Bid等，抑凋亡蛋白包括Bcl-2、Bcl-xl、Bcl-w等。其中促凋亡蛋白Bax和抑凋亡蛋白Bcl-2在Bcl-2基因家族中對調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡起最主要作用[10]。Bax對線粒體的通透性轉(zhuǎn)換起促進(jìn)作用，Bcl-2對線粒體的通透性轉(zhuǎn)換起抑制作用。線粒體可通過Bax/BAK1依賴性孔或線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔(MPT-孔)的開放進(jìn)行透化[11]。而Bax/BAK1依賴性孔的開放受抗凋亡Bcl-2家族中的Bcl-2蛋白、Bcl-xl蛋白、MCL1蛋白及促凋亡蛋白PUMA所控制，BAX/BAK1孔道開放與否決定了細(xì)胞是否凋亡[12]。并有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)腦組織發(fā)生缺血缺氧損傷時，Bcl-2的身份及作用都發(fā)生轉(zhuǎn)變，從caspase-3的抑制劑變?yōu)閏aspase-3的底物，其功能也從抑凋亡轉(zhuǎn)變成促凋亡，由此構(gòu)成了細(xì)胞凋亡的反饋回路[13]。

Smac/DIABLO是位于線粒體內(nèi)的蛋白質(zhì)，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的作用。IAP為調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的重要因子，位于細(xì)胞內(nèi)。Smac/DIABLO可以與IAP結(jié)合，通過改變IAP，尤其是逆轉(zhuǎn)X連鎖凋亡抑制蛋白(xIAP)來發(fā)揮促凋亡作用。當(dāng)?shù)蛲龃碳こ霈F(xiàn)時，線粒體通透性改變，將位于線粒體內(nèi)的Smac/DIABLO蛋白釋放至胞質(zhì)中并與xIAP結(jié)合，改變了IAP的特性，阻止了IAP與caspase-3和caspase-9的結(jié)合，使IAP喪失了對caspase活性的抑制作用，恢復(fù)了caspase-3和caspase-9的活性，從而造成了細(xì)胞凋亡[14-15]。最初，認(rèn)為細(xì)胞凋亡內(nèi)源性途徑只是由Caspase依賴性凋亡通路所介導(dǎo)，即全細(xì)胞色素C、原癌基因Bcl-2和第二線粒體衍生的半胱天冬酶激活劑在參與細(xì)胞凋亡的過程中，全都有半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶家族參與。近年來發(fā)現(xiàn)凋亡誘導(dǎo)因子和核酸內(nèi)切酶G都是通過非Caspase依賴性凋亡通路對細(xì)胞凋亡進(jìn)行調(diào)控[16]。

1.2 非Caspase依賴性凋亡通路

AIF作為細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)因子，位于線粒體內(nèi)膜。在凋亡刺激出現(xiàn)時，細(xì)胞核內(nèi)的DNA受損，DNA修復(fù)酶(PARP)被激活，AIF轉(zhuǎn)位至線粒體膜間隙或離開線粒體至細(xì)胞質(zhì)中以響應(yīng)氧化應(yīng)激，并隨PARP一起進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)[17]。PARP作為caspase的切割底物在進(jìn)入細(xì)胞核后，PARP被活化的caspase 3剪切，使得PARP失去活性，喪失了其修復(fù)損傷DNA的功能，與此同時，隨PARP一起進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)的AIF則將核內(nèi)的DNA聚集并斷裂為片段，導(dǎo)致凋亡發(fā)生，這也是AIF與其他凋亡相關(guān)蛋白的區(qū)別之處[18]。另外，當(dāng)AIF到達(dá)細(xì)胞質(zhì)時它還可以改變其他線粒體的通透性，誘導(dǎo)更多的AIF脫離線粒體，造成細(xì)胞凋亡的惡性循環(huán)[19-20]。

Endo G為細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，存在于線粒體內(nèi)，正常情況下其在線粒體內(nèi)參與DNA的修復(fù)，并與熱休克蛋白70(Hsp70)和相關(guān)蛋白(CHIP)結(jié)合發(fā)揮抗氧化應(yīng)激保護(hù)的作用，在經(jīng)歷氧化應(yīng)激后，處于氧化應(yīng)激狀態(tài)的Endo G與Hsc-70和CHIP解離從線粒體釋放并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，在核內(nèi)它降解DNA以實現(xiàn)凋亡[21-22]。AIF與Endo G在眾多凋亡相關(guān)蛋白中較特殊，因為它們參與細(xì)胞凋亡的過程是通過非Caspase依賴性凋亡通路[23]。

2 細(xì)胞凋亡外源性通路

死亡受體(DR)屬于腫瘤壞死因子(TNF)受體家族的一個亞家族，是一類跨膜蛋白。死亡受體的細(xì)胞外含有一段富含半胱氨酸的結(jié)構(gòu)域(CRD)，細(xì)胞質(zhì)含有由一同型半胱氨酸組成的同源結(jié)構(gòu)域，有水解蛋白的功能，即與細(xì)胞相關(guān)的死亡結(jié)構(gòu)域(DD)[24]。當(dāng)腦組織發(fā)生缺血缺氧性損傷時，死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合并激活胞漿內(nèi)介導(dǎo)凋亡信號銜接蛋白造成Caspase活化，引發(fā)細(xì)胞凋亡。目前，最典型并且研究最多的死亡受體為死亡基因受體(Fas)和腫瘤壞死因子受體(TNFR)，其對應(yīng)的死亡配體分別為FasL和TNF。

Fas為細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)膜蛋白，廣泛分布在皮質(zhì)區(qū)和海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，與凋亡信號的傳導(dǎo)密切相關(guān)[25]。FasL為Fas的配體,兩者結(jié)合后發(fā)生多聚化改變，致使Fas被激活，激活后的Fas又與Fas相關(guān)死亡域蛋白(FADD)結(jié)合。此時的FADD與caspase-8兩者可通過其自身的死亡結(jié)構(gòu)域(DED)以DED-DED方式結(jié)合形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合體(DISC)，并借此激活caspase-8，形成由Fas L、Fas、FADD和caspase-8共同組成的蛋白復(fù)合物，該蛋白復(fù)合物的作用類似于內(nèi)源性途徑的凋亡小體，可引發(fā)下游的caspases活化(如caspase-3)并激活細(xì)胞凋亡過程的級聯(lián)反應(yīng)，最終引發(fā)細(xì)胞凋亡[26]。

TNFR受體位于大腦神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)，其配體為TNF，TNF活性是通過激活低親和力的腫瘤壞死因子受體1(TNFR1)和高親和力的腫瘤壞死因子受體2(TNFR2)這兩種受體介導(dǎo)的。當(dāng)?shù)蛲龃碳こ霈F(xiàn)后，TNFR與其配體TNF結(jié)合使TNFR1被激活。TNFR1通過自身的死亡結(jié)構(gòu)域與銜接蛋白腫瘤壞死因子受體-1結(jié)合蛋白(TRADD)的死亡結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成由TNF、TNFR1、TRADD組成的蛋白復(fù)合物[27]。一方面，該蛋白復(fù)合物可通過與FADD結(jié)合，激活FADD與caspase-8發(fā)生同源性活化，進(jìn)一步引發(fā)下游的caspases活化(如caspase-2)，造成細(xì)胞凋亡過程的級聯(lián)反應(yīng)[28];另一方面，TNFR2與相互作用受體蛋白(RIP)可以激活核因子κB(NF-κB)誘導(dǎo)激酶(NIK)并使其活化，從而活化了NF-κB信號途徑，誘導(dǎo)一系列基因表達(dá)，造成細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[29]。

3 針康法對細(xì)胞凋亡通路的干預(yù)作用

隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展，涌現(xiàn)出許多治療缺血缺氧性腦損傷的方法，其中以針康法的療效最為確切。針康法是將傳統(tǒng)針灸中的頭穴叢刺技術(shù)與現(xiàn)代康復(fù)理療技術(shù)結(jié)合運用的臨床新方法[30]。在臨床中，針康法可以對腦組織缺血缺氧損傷后所造成的運動功能障礙、感覺功能障礙、言語功能障礙、認(rèn)知功能障礙及一些常見并發(fā)癥發(fā)揮治療作用，并提高患者的生存質(zhì)量和日常生活活動能力，以助其重返社會。在微觀角度，眾多臨床試驗和動物實驗研究結(jié)果表明，針康法可以對缺血缺氧的腦組織發(fā)揮保護(hù)與調(diào)節(jié)作用，增強突觸的可塑性、保護(hù)受損神經(jīng)元、抑制神經(jīng)元的凋亡、促進(jìn)新血管的形成、增加缺血缺氧腦組織半暗帶的成活率、加快受損腦組織側(cè)支循環(huán)的建立、改善腦部血流量、加速對內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖與分化、促進(jìn)缺血缺氧區(qū)神經(jīng)細(xì)胞的修復(fù)并抑制細(xì)胞凋亡[31]。由此可以看出，針康法對細(xì)胞凋亡內(nèi)源性通路和外源性通路的調(diào)控為缺血缺氧性腦損傷的治療發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

3.1 針康法對細(xì)胞凋亡內(nèi)源性通路的干預(yù)作用

針刺頭穴可以使Bcl-2的表達(dá)水平提高并降低Bax的表達(dá)水平。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，BAX/BAK1孔道開放，誘導(dǎo)全細(xì)胞色素C在胞漿中釋放，抑凋亡蛋白Bcl-2在針康法的刺激下發(fā)揮作用，通過阻止BAX/BAK1孔道的開放來間接抑制全細(xì)胞色素C的釋放，從而抑制凋亡小體的合成及caspase-3的激活，由此途徑抑制細(xì)胞凋亡。王洪[32]針刺百會、曲鬢、風(fēng)池等穴并采用免疫組化法對HIBD大鼠大腦皮層中的Bcl-2和Bax陽性細(xì)胞密度進(jìn)行觀測，發(fā)現(xiàn)針刺組的Bcl-2表達(dá)水平上升，Bax表達(dá)水平下降，Bcl-2/Bax比值也有所上調(diào)，阻止了細(xì)胞凋亡的發(fā)生。還有動物實驗表明，康復(fù)訓(xùn)練可以通過對Cyt C的調(diào)控，加強HIBD大鼠對缺血缺氧等病理改變的耐受性，從而改善大鼠的運動功能，促進(jìn)其神經(jīng)功能的恢復(fù)，并減少細(xì)胞凋亡[33]。當(dāng)腦組織受損后，運用針康法還可以促進(jìn)IAP與caspase家族的相關(guān)蛋白結(jié)合，抑制相關(guān)蛋白(caspase-3和caspase-9)的活性并抑制全細(xì)胞色素C，從而阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生。唐強等[34]運用免疫印跡法(Western blotting)檢測頭穴叢刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練的針康組半暗區(qū)內(nèi)xIAP和caspase-9的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)針康法可以有效降低xIAP和caspase-9的表達(dá)，抑制神經(jīng)細(xì)胞的凋亡，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。

因此，針康法可以通過促進(jìn)Bcl-2的表達(dá)、抑制Bax、caspase-3mRNA、caspase-9的表達(dá)以及減少Cyt C的釋放以對細(xì)胞凋亡的內(nèi)源性途徑進(jìn)行調(diào)控，保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞，減少凋亡數(shù)量。

3.2 針康法對細(xì)胞凋亡外源性通路的干預(yù)作用

頭穴叢刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練可降低caspase-8等細(xì)胞凋亡相關(guān)因子的表達(dá)水平。徐慶鑫等[35]采用蘇木精-伊紅染色法(HE)法對針刺組的caspase-8mRNA和caspase-3mRNA的表達(dá)進(jìn)行觀測，結(jié)果顯示針刺可以抑制凋亡相關(guān)因子caspase-8mRNA和caspase-3mRNA的表達(dá)，以減少細(xì)胞凋亡的數(shù)量。葉濤等[36]運用免疫印跡法檢測針康組大鼠半暗區(qū)內(nèi)caspase-8、caspase-3與細(xì)胞凋亡抑制蛋白的數(shù)量變化，結(jié)果表明針康組大鼠半暗區(qū)內(nèi)caspase-8和caspase-3水平均有下調(diào)，細(xì)胞凋亡抑制蛋白的表達(dá)水平上調(diào)，發(fā)揮了抑制細(xì)胞凋亡的作用。王瓊等[37]針刺頭部穴位并利用免疫印跡法觀察NF-κB的蛋白表達(dá)水平，可知頭針可抑制NF-κB蛋白水平的過度表達(dá)，發(fā)揮對細(xì)胞凋亡的良性調(diào)節(jié)作用。孫妲男[38]運用酶聯(lián)免疫吸附法檢測缺血皮質(zhì)區(qū)的TNF和NF-κB的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)頭穴叢刺結(jié)合康復(fù)訓(xùn)練的針康組TNF水平和NF-κB轉(zhuǎn)錄活性都有所減少。由此可得出結(jié)論，針康法對減少缺血皮質(zhì)區(qū)的細(xì)胞凋亡發(fā)揮促進(jìn)作用。

以上的動物實驗結(jié)果表明，針康法對細(xì)胞凋亡外源性干預(yù)作用是通過抑制caspase-8、caspase-8mRNA、caspase-3mRNA的表達(dá)水平影響Fas所介導(dǎo)的凋亡通路，及抑制TNF的表達(dá)減少NF-κB的活化實現(xiàn)的，最終阻止或減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生[39]。

4 小結(jié)

眾多的臨床試驗和動物實驗結(jié)果表明，在腦組織缺血缺氧發(fā)生后運用針康法進(jìn)行介入治療可以促進(jìn)大腦受損區(qū)神經(jīng)組織的修復(fù)、加速大腦微循環(huán)的建立、調(diào)節(jié)細(xì)胞信號的傳導(dǎo)通路、阻止細(xì)胞凋亡的發(fā)生，保護(hù)受損的腦組織[40-41]。針康法通過對細(xì)胞內(nèi)源性和外源性通路的調(diào)控，影響caspase、Cyt C、Bcl-2、Smac/DIABLO、AIF及Endo G等內(nèi)源性凋亡蛋白和Fas、TNFR等外源性凋亡蛋白的表達(dá)來促進(jìn)減少細(xì)胞凋亡的發(fā)生。目前，針康法對由線粒體Caspase依賴性凋亡通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和由細(xì)胞凋亡外源性途徑即死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡研究較多且取得了滿意的結(jié)果。但也只是局限于對Cyt C、Bcl-2、Bax、IAP和NF-κB等幾個蛋白的研究上，且其詳細(xì)的機(jī)制仍然不是十分清楚。另外，針康法對于線粒體非Caspase 依賴性凋亡通路的凋亡蛋白AIF、Endo G及其他具有明確結(jié)構(gòu)和功能的非典型死亡受體對調(diào)往發(fā)揮的的調(diào)控作用仍處于研究空白階段，所以針康法能否通過對非Caspase依賴性凋亡通路的凋亡蛋白AIF、Endo G及其他細(xì)胞凋亡外源性途徑發(fā)揮干預(yù)作用以抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生，促進(jìn)缺血缺氧腦組織的恢復(fù)值得期待。