羧甲基殼聚糖逆轉骨肉瘤MG—63/ADM細胞耐藥性的研究

丁萬軍 曾濤 郭衛(wèi)春

[摘要] 目的 觀察羧甲基殼聚糖（CMC）逆轉人骨肉瘤耐藥細胞株MG-63/ADM的耐藥作用并初步探討其機制。方法 體外培養(yǎng)建立人骨肉瘤耐藥MG-63/ADM細胞株，MTT檢測其耐藥性；用不同濃度（50、100、200 μmol/L）CMC+阿霉素2.0 μg/mL作用于骨肉瘤MG-63/ADM細胞24、48、72 h后，采用MTT法測各組細胞生長抑制率；采用Western blot方法檢測不同濃度CMC處理后MG-63/ADM細胞P糖原蛋白（P-gp）及胞核中核轉錄因子-κB P65（NF-κB P65）的表達水平。 結果 MTT結果顯示MG-63/ADM細胞株對阿霉素（ADM）明顯耐藥，IC50為（1.97±0.56）μg/mL，耐藥指數(shù)為11.35；CMC聯(lián)合ADM 2.0 μg/mL能明顯抑制MG-63/ADM細胞的增殖，且其抑制作用與CMC呈時間和劑量依賴性（P < 0.01）。Western blot檢測結果顯示，MG-63/ADM細胞組較MG-63細胞組P-gp的表達水平明顯升高（P < 0.05），且用不同濃度CMC處理的MG-63/ADM細胞組P-gp表達均明顯低于MG-63/ADM細胞組（不加藥物）（P < 0.05）；MG-63/ADM細胞組較MG-63細胞組NF-κB P65的表達水平明顯升高（P < 0.05），且不同濃度CMC處理的MG-63/ADM細胞組胞核NF-κB P65表達明顯低于MG-63/ADM細胞組（不加藥物）（P < 0.05）。 結論 CMC可部分逆轉MG-63/ADM細胞的耐藥現(xiàn)象的作用，其機制可能與通過抑制NF-κB信號通路激活而抑制P-gp表達相關。

[關鍵詞] 羧甲基殼聚糖；骨肉瘤；耐藥；MG-63細胞株

[中圖分類號] R738 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）09（c）-0004-05

[Abstract] Objective To observe the effect of reversing drug resistance of carboxymethyl chitosan （CMC） on human osteosarcoma resistant cell line MG-63/ADM and preliminary explore its mechanism. Methods Human osteosarcoma drug resistant MG-63/ADM cell line was cultured in vitro. The drug resistance was detected by MTT； after 24， 48 and 72 h of osteosarcoma MG-63 /ADM cells were treated with CMC + adriamycin 2.0 μg/mL， and the inhibition rate of cell proliferation in each group was measured by MTT method. The expression of P-gp in MG-63/ADM cells and the expression of NF-κB P65 protein in nucleus of MG-63/ADM cells after treated with the different concentrations of CMC were detected by Western blot. Results MTT results showed that MG-63/ADM cells were resistant to adriamycin， IC50 was （1.97±0.56） g/mL， the resistance index was 11.35； CMC could significantly inhibit MG-63/ADM cells proliferation， and the inhibitory effect was time and dose dependent （P < 0.01）. Western blot test results showed that the expression of P-gp in MG-63/ADM group was significantly higher than that in MG-63 group （P < 0.05）， and the expression of P-gp in MG-63/ADM treated with different concentrations of CMC was significantly lower than that in MG-63/ADM group （without drugs） （P < 0.05）. The expression level of NF-κB/P65 in MG-63/ADM group was significantly higher than that in MG-63 cell group （P < 0.05）. The expression of NF-κB P65 in the nucleus of CMC + ADM group was significantly lower than that of the control group （MG-63/ADM） （P < 0.05）. Conclusion Carboxymethyl can partly reverse the multidrug resistance in MG-63/ADM cells， and its mechanism may be related to the inhibition of NF-κB signaling pathway and the inhibition of P-gp expression.

[Key words] Carboxymethyl chitosan； Osteosarcoma； Drug resistance； MG-63 cell line

骨肉瘤是發(fā)病率最高的原發(fā)性骨惡性腫瘤，多見于10～20歲青少年，惡性程度高，易復發(fā)和轉移，且預后差[1]。骨肉瘤好發(fā)于四肢骨，上肢多發(fā)生于肱骨近端，下肢多發(fā)生于脛骨近端以及股骨遠端。骨肉瘤傳統(tǒng)的治療方法是截肢術[2]。20世紀80年代以來，逐步形成了新輔助化療聯(lián)合保肢手術及術后輔助化療的新的骨肉瘤治療策略，使患者5年生存率較之前提高近50%[3]。雖然保肢手術已經(jīng)很成熟，然而仍有部分患者因腫瘤復發(fā)轉移使得保肢治療失敗，導致治療效果不佳。其主要原因之一是這部分患者對骨肉瘤的化療藥物產(chǎn)生了多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）[4]。因此，進一步明確骨肉瘤耐藥的機制并尋找能預防或逆轉耐藥的方法既是目前骨肉瘤治療研究的熱點之一，也是臨床迫切需要解決的問題。甲殼素是自然界中存在的唯一帶陽離子的天然多糖，廣泛存在于蝦、蟹等甲殼動物及各類昆蟲的表皮；甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物稱為殼聚糖[5]（chitosan，CTS）。羧甲基殼聚糖（carboxymethyl chitosan，CMC）為殼聚糖羧甲基基團修飾后的衍生物。有研究表明，CTS及CMC具有一定的抗腫瘤、抗炎、調(diào)節(jié)免疫等活性[6-7]。CMC是否對耐藥細胞有逆轉耐藥作用，目前臨床鮮有報道。本研究采用阿霉素（ADM）濃度遞增培養(yǎng)法沖擊誘導建立人骨肉瘤阿霉素耐藥株（MG-63/ADM），觀察CMC對體外培養(yǎng)的MG-63/ADM細胞對ADM的耐藥逆轉作用，并初步探討其可能機制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

人骨肉瘤MG-63細胞株（購自武漢大學典型培養(yǎng)物保藏中心）；RPMI 1640培養(yǎng)基（美國，Hyclone）；胎牛血清（FBS）（美國，Gibco）；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（碧云天生物科技有限公司）；青霉素、鏈霉素溶液（雙抗）（美國，HyClone）；Trizol（美國，Invitrogen）；阿霉素（Doxorubicin，ADM）由Sigma公司提供；MTT試劑盒（武漢科昊佳生物科技有限公司）；羧甲基殼聚糖（武漢大學資環(huán)學院惠贈）；蛋白抽提-亞細胞結構胞漿和胞核蛋白提取試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），Western blot單克隆抗體均購自Santa Cruz公司；細胞培養(yǎng)瓶及96孔培養(yǎng)板由Coring公司生產(chǎn)，細胞培養(yǎng)箱（美國，Thermo）；Olympus IX70倒置熒光顯微鏡（日本，Olympus）；自動細胞計數(shù)器（美國，Thermo）；紫外凝膠成像系統(tǒng)（美國，Bio-Rad）；DYCz-24D型雙垂直電泳槽（北京六一儀器廠）；JY-ECP3000型高壓多用電泳儀（北京君意儀器有限公司）；UV-1000紫外透射分析儀（上海鄂禾儀器有限公司）；Lambda Bio 20型紫外-可見分光光度計（美國，PerkinElmer）。

1.2 觀察指標及檢測方法

1.2.1 MG-63細胞ADM耐藥株的建立 按文獻方法[8-9]，先用低濃度的ADM誘導作用MG-63細胞，然后ADM濃度逐步遞增，通過間歇作用的方法誘導細胞耐藥。首先，取對數(shù)生長期MG-63細胞接種至含ADM的DMEM培養(yǎng)液中，ADM從0.05 mg/L的低濃度開始，作用48 h后即棄去含ADM的培養(yǎng)液，重新加入不含ADM的培養(yǎng)液培養(yǎng)，使其恢復正常生長，待MG-63細胞生長至培養(yǎng)瓶底80%～90%時進行胰酶消化傳代，隨后用濃度為0.1 mg/L的ADM處理傳代腫瘤細胞48 h。按以上方法，重復ADM處理、換液培養(yǎng)、傳代的培養(yǎng)過程，在此過程中按照0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 μg/mL逐步遞增ADM藥物濃度。將MG-63細胞在2 μg/mL的ADM中可以穩(wěn)定生長時所獲得的耐藥細胞株命名為MG-63/ADM，整個耐藥誘導歷時70 d。整個試驗過程中每4周重復檢測1次該細胞的耐藥性。

1.2.2 MG-63/ADM細胞的耐藥性檢測（MTT法） 將MG-63、MG-63/ADM用DMEM培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中37℃，5%CO2條件下培養(yǎng)，待兩種細胞均生長至培養(yǎng)瓶底80%～90%時行0.25%胰酶消化，然后800 r/min離心10 min，去除上清，分別收集兩種細胞并接種于96孔板（1×104/孔），繼續(xù)DMEM培養(yǎng)24 h后分組培養(yǎng)。處理組：加入含2 μg/mL濃度ADM的DMEM培養(yǎng)液；陰性對照組：加不含藥物的培養(yǎng)基；空白調(diào)零組：無細胞，只加培養(yǎng)基，每組設6個復孔。將各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)，各組均取24、48、72 h時間點去除培養(yǎng)基行MTT檢測。按MTT試劑盒方法，每孔加入100 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h去除上清（不能移走結晶），每孔加入150 μL的二甲基亞砜，搖床低速震蕩10 min待結晶溶解，全自動酶標儀測定OD值（490 nm吸光度）。細胞抑制率（inhibition rate，IR）計算公式：IR（%）=1-[（實驗組OD值-調(diào)零組OD值）/（對照組OD值-調(diào)零組OD值）]×100%。

根據(jù)文獻方法[10]，采用SPSS 18.0 probit analysis法計算ADM對MG-63、MG-63/ADM細胞的半數(shù)抑制濃度（half effective inhibition concentrations，IC50）；根據(jù)IC50的值計算耐藥指數(shù)（resistance index，RI），RI=耐藥組IC50/親代細胞IC50。

1.2.3 MTT檢測CMC對人MG-63/ADM細胞增殖活性的影響 培養(yǎng)MG-63/ADM細胞至培養(yǎng)瓶底80%～90%時（對數(shù)生長期），行0.25%胰酶消化，然后800 r/min離心10 min，去除上清，收集細胞并接種于96孔板（1×104/孔），細胞貼壁培養(yǎng)24 h后分組。ADM組：ADM 2.0 μg/mL；ADM+CMC組：不同濃度（50、100、200 μmol/L）的CMC+ADM 2.0 μg/mL；CMC組：不同濃度（50、100、200 μmol/L）的CMC，每組設6個復孔，每孔終體積為200 μL。各組細胞繼續(xù)培養(yǎng)，取0、24、48、72 h時間點去除培養(yǎng)基行MTT檢測。按MTT試劑盒方法，每孔加入100 μL的MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h去除上清（不能移走結晶），每孔加入150 μL的DMSO，搖床低速震蕩10 min溶解結晶，全自動酶標儀測定OD值（490 nm吸光度）。計算每組生長抑制率，實驗重復3次。生長抑制率公式：細胞生長抑制率（%）=[1-（實驗組OD值）/（對照組OD值）]×100%。

1.2.4 Western blot檢測細胞膜P-gp及核轉錄因子-κB P65（NF-κB P65）的表達 實驗分組：①MG-63組；②MG-63/ADM組；③MG-63/ADM+CMC組（CMC 50、100、200 μmol/L，48 h）。蛋白提取步驟：①PBS洗細胞3次；②加入裂解緩沖液（1.5×106個細胞大約加入100 μL裂解液），冰上放置20 min；③收集裂解液；④12 000 r/min離心2～10 min；⑤吸取上清，蛋白定量，分裝，保存在-80℃?zhèn)溆?。蛋白提取裂解液采用胞漿和胞核蛋白提取試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司）。蛋白濃度檢測用BCA蛋白檢測試劑盒按操作說明進行測定。電泳方法：①配制10%的SDS-PAGE膠；②將所有蛋白樣品調(diào)至等濃度，充分混合沉淀后加Loading buffer后直接上樣，樣品兩側的泳道用等體積的1×Loading buffer上樣，Marker采用1×Loading buffer調(diào)整至與樣品等體積；③用恒流30 mA電泳至目的蛋白泳動至距膠下緣1 cm以上結束（約1 h）；④轉膜：采用濕轉法，恒流100 mA過夜轉膜，將P-gp及NF-κB p65蛋白轉到PVDF膜。隨后進行封閉劑雜交：將膜移至含有封閉液的平皿中，室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h，而后加入單克隆小鼠抗P-gp抗體（1∶500）、多克隆兔抗NF-κB p65抗體（1∶400）和單克隆小鼠抗β-actin抗體（1∶1000），在37℃孵育1 h后轉至4℃孵育過夜，以TBS-T洗滌3次，每次5 min，加入對應二抗：山羊抗小鼠IgG抗體或山羊抗兔IgG抗體，于室溫輕搖1 h。二抗孵育結束后，用PBST漂洗膜后再浸洗3次，每次5～10 min。用HRP-ECL發(fā)光法按試劑盒步驟進行化學發(fā)光反應，并用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標條帶的吸光度，并將膜片進行掃描或拍照。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 人骨肉瘤MG-63細胞ADM耐藥株的建立

采用ADM大劑量間隙作用法對人骨肉瘤MG-63細胞進行體外培養(yǎng)誘導，成功建立了對ADM耐藥的細胞株MG-63/ADM（歷時約70 d，可在2 μg/mL的ADM穩(wěn)定生長）。

2.2 MTT法檢測MG-63/ADM細胞的耐藥性

采用MTT法檢測MG-6組3及MG-63/ADM細胞組對ADM的IC50，發(fā)現(xiàn)MG-63/ADM細胞組的IC50（1.97±0.56）明顯高于MG-63細胞組（0.16±0.07），同時MG-63/ADM組的RI（11.35）顯著高于MG-63細胞組（1.00），差異均有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。

2.3 CMC對MG-63/ADM細胞增殖的影響

MTT結果顯示，加入CMC后MG-63/ADM細胞+ADM組的細胞增殖明顯被抑制，且在CMC濃度為50、100、200 μmol/L時，細胞生長抑制率隨作用時間的延長而增加（F = 3.89、4.99、5.78，均P < 0.05）；在CMC作用24、48、72 h時，細胞生長抑制率隨CMC濃度的升高而增加（F = 4.69、5.77、7.14，均P < 0.05）；CMC+ADM組與ADM組及CMC組比較，差異有統(tǒng)計學意義（F = 5.46、6.37、6.49，均P < 0.05）。見表1。

2.4 CMC對MG-63/ADM細胞中P-gp和細胞核中NF-κB P65表達的影響

Western blot結果表明，MG-63/ADM細胞組P-gp表達水平較MG-63細胞組表達明顯上調(diào)（P < 0.05），且MG-63/ADM細胞組細胞核中NF-κB P65的表達水平較對照組MG-63細胞組明顯上調(diào)（P < 0.05）。MG-63/ADM細胞+CMC組P-gp的表達水平較MG-63/ADM細胞組（不加藥物）明顯下調(diào)（P < 0.05），MG-63/ADM細胞+CMC組細胞核NF-κB P65的表達水平較MG-63/ADM細胞組明顯下調(diào)（P < 0.05），且呈劑量依賴性。見表2，圖1。

3 討論

骨肉瘤多藥耐藥是該病復發(fā)轉移的主要因素之一。體外研究其耐藥機制及逆轉方法的條件及基礎是建立骨肉瘤的耐藥細胞株。大量研究表明，通過持續(xù)誘導或大劑量間歇誘導等方法體外誘導建立骨肉瘤多藥耐藥細胞株是可行的[8-9]。大劑量間歇誘導法更接近臨床化療實際。因此，本研究采用了大劑量間歇誘導法。骨肉瘤化療的主要藥物包括鉑類、蒽環(huán)類、達卡巴嗪等。其中，ADM是骨肉瘤最主要的化療藥物之一[11]。本研究根據(jù)文獻采取了ADM大劑量間歇干預人骨肉瘤MG-63細胞進行體外誘導約70 d建立了MG-63/ADM，通過MTT法檢測該組細胞耐藥性，發(fā)現(xiàn)MG-63/ADM對ADM呈中度耐藥，其IC50為（1.97±0.56）μg/mL，RI為11.35。提示該耐藥株具有耐藥性，說明成功誘導建立了對ADM耐藥的人骨肉瘤耐藥細胞MG-63/ADM。

CTS是自然界中的第二大生物資源，是廣泛存在于甲殼類動物等生物組織中的一種天然高分子聚合物。其具有較好的生物相容性、生物可降解性、低毒性等特點，在藥物載體、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)等多方面顯示出了良好的前景[12]。研究表明，CTS可抑制多種腫瘤細胞的增殖[13]。CMC是殼聚糖最常見的衍生物，經(jīng)CTS醚化改性后的CMC具有更好的水溶性和生物相容性[14]。楊靖亞等[15]通過實驗發(fā)現(xiàn)CMC可抑制Hela細胞和LS174-T細胞的增殖。張敏等[16]發(fā)現(xiàn)CMC可以抑制口腔癌及癌前病變細胞黏附和侵襲。CMC對多藥耐藥細胞，特別是對骨肉瘤多藥耐藥細胞的影響，目前鮮見報道。本研究顯示，CMC可部分逆轉人骨肉瘤MG-63/ADM耐藥細胞株對ADM的耐藥。

目前，已知的骨肉瘤多藥耐藥的產(chǎn)生機制主要有：化療藥物的排出增多，如P-gp的外排泵藥機制；細胞解毒增強，如谷胱甘肽巰基轉移酶（GST）的細胞解毒作用；細胞凋亡抑制；骨肉瘤干細胞；自噬相關化療抵抗等機制相關[17-19]。其中P-gp介導的藥物外排機制，是經(jīng)典的多藥耐藥產(chǎn)生機制之一，但其具體調(diào)節(jié)過程及調(diào)節(jié)因素仍不完全明確。在多種耐藥的腫瘤細胞系中存在著異常的NF-κB的表達[20]。朱文魏等[21]研究認為，NF-κB p65蛋白參與皮膚鱗狀細胞癌的形成和發(fā)展，隨患者病情的進展，NF-κB p65蛋白的陽性表達率越高。隋華等[22]發(fā)現(xiàn)，在人結腸HCT-116/L-OHP細胞中，NF-κB與ABCB1基因在啟動子區(qū)域相結合，啟動ABCB1基因的轉錄，引起P-gp的過表達，從而增強耐藥。本研究結果顯示，MG-63/ADM細胞組較MG-63細胞組P-gp表達明顯上調(diào)，且細胞核NF-κB P65表達增加。推測在人骨肉瘤耐藥細胞中，P-gp導致的耐藥與NF-κB P65信號通路有關。

綜上所述，CMC可逆轉MG-63/ADM細胞耐藥，即通過下調(diào)P-gp及NF-κB P65表達實現(xiàn)，推測CMC逆轉骨肉瘤耐藥機制可能與抑制細胞核NF-κB信號通路相關。

[參考文獻]

[1] 李曉菊.骨肉瘤各病理亞型臨床特點及病理分型研究[J].實用癌癥雜志，2018，33（2）：204-210.

[2] 王文劍，于秀淳.局部復發(fā)性骨肉瘤臨床治療療效的系統(tǒng)文獻分析[J].中國骨與關節(jié)雜志，2017，6（6）：421-427.

[3] 易生輝，秦剛，黃肖華.新輔助化療聯(lián)合保肢手術治療骨肉瘤療效Meta分析[J].中醫(yī)臨床研究，2017，9（25）：139-141.

[4] 豐濤，沈贊.三氧化二砷對骨肉瘤細胞株MG-63/dox多藥耐藥的逆轉作用及其機制[J].臨床腫瘤學雜志，2016， 21（1）：6-11.

[5] 楊懷宇，武婷茹，劉俊希.甲殼素一殼聚糖的生理功能及應用研究進展[J].安徽農(nóng)業(yè)科學，2015，43（18）：24-25.