斑馬魚動(dòng)物模型在骨骼疾病研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀分析

尹恒 王建偉 馬勇 吳毛 華臻 蘇秋菊

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)無錫附屬醫(yī)院，江蘇 無錫 214071 2.南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京 210038 3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市人民醫(yī)院，江蘇 無錫 214023

在骨骼疾病的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中，最常用的模式動(dòng)物包括大鼠、小鼠、兔等。傳統(tǒng)的動(dòng)物模型有一系列難以克服的缺點(diǎn)，如造模用藥周期長、費(fèi)用高、工作量大等，人們在不斷尋找新的動(dòng)物模型來克服以上缺點(diǎn)。近年來，一種新的模式動(dòng)物-斑馬魚(zebrafish)逐漸進(jìn)入了研究人員的視野。

斑馬魚是一個(gè)古老的動(dòng)物模型，于上世紀(jì)80年代～90年代初被確立為一種新的模式動(dòng)物。經(jīng)過近30年的發(fā)展，目前斑馬魚已成為一種常用的模式生物，也是目前被認(rèn)為可用于提升科研效率的最好的動(dòng)物模型之一。在骨骼疾病研究中，斑馬魚以其獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與生理，提供了一種全新的、高效而靈活的動(dòng)物模型。既往的研究涉及骨質(zhì)疏松與骨代謝、骨發(fā)育、骨再生與修復(fù)、藥物篩選等幾個(gè)方向。更有意義的是，斑馬魚的兩種形態(tài)——胚胎魚與成年魚階段各有完全不同的可研究之處，研究者稱之為“一體兩面”的動(dòng)物模型。為了下一步研究的開展，作者收集了數(shù)據(jù)庫中的文獻(xiàn)資料，對(duì)目前斑馬魚的研究作出簡要分析綜述。

1 文獻(xiàn)篩選

1.1 文獻(xiàn)來源

以中文“骨、斑馬魚”為關(guān)鍵詞,檢索知網(wǎng)、萬方、維普數(shù)據(jù)庫中的中文文獻(xiàn)；以英文“osteoporosis/osteogenesis，zebrafish”為關(guān)鍵詞，檢索Pubmed、Embase、Web of science數(shù)據(jù)庫中的英文文獻(xiàn)，時(shí)間區(qū)間選取1990年1月-2017年6月。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：①原創(chuàng)性；②論點(diǎn)論據(jù)可靠；③動(dòng)物試驗(yàn)類文獻(xiàn)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①內(nèi)容重復(fù)的文獻(xiàn)；②綜述類文獻(xiàn)。

1.3 篩選結(jié)果

初檢共檢索到573篇含相關(guān)內(nèi)容的文獻(xiàn)。按照納入與排除標(biāo)準(zhǔn)，初篩得到285 篇文獻(xiàn)。經(jīng)過第二次篩選(閱讀摘要篩選，必要時(shí)全文篩選)，共納入107篇文獻(xiàn)。文獻(xiàn)大體分類包括骨質(zhì)疏松方向的文獻(xiàn)28篇，骨代謝方向的文獻(xiàn)18篇，骨發(fā)育方向的文獻(xiàn)36篇，骨再生與修復(fù)方向的文獻(xiàn)11 篇，藥物篩選方向的文獻(xiàn)14篇。此外，在107篇文獻(xiàn)中，涉及胚胎斑馬魚文獻(xiàn)88篇，成年斑馬魚文獻(xiàn)26篇；含轉(zhuǎn)基因研究方向文獻(xiàn)12篇。

2 胚胎斑馬魚模型

2.1 胚胎斑馬魚骨組織的發(fā)育

與哺乳動(dòng)物一樣, 斑馬魚存在兩種不同類型的骨生成方式[1]：從軟骨支架骨化(軟骨內(nèi)骨化)或直接從間充質(zhì)干細(xì)胞前體骨化(膜內(nèi)骨化)。在胚胎期斑馬魚體內(nèi)，典型的軟骨內(nèi)骨化的部位包括顱骨和咽弓軟骨，典型的膜內(nèi)骨化包括脊椎與鱗片。在細(xì)胞水平上,斑馬魚的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞與哺乳動(dòng)物高度相似，因此，胚胎斑馬魚已被廣泛應(yīng)用于骨組織的發(fā)育研究。Pasqualetti等[2]利用胚胎斑馬魚評(píng)估鍶對(duì)骨骼發(fā)育的影響，評(píng)估了鍶在胚胎發(fā)生過程中是否會(huì)影響軟骨發(fā)育，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鍶不會(huì)擾亂軟骨組織的發(fā)育。在礦化過程中，研究者證明了低濃度鍶增加脊椎礦化，而高濃度鍶抑制礦物沉積，認(rèn)為在胚胎成骨形成過程中，鈣/鍶的比例調(diào)節(jié)了礦化過程。結(jié)果表明斑馬魚對(duì)于研究微量營養(yǎng)素在組織/器官發(fā)育過程中的作用是一種很好的動(dòng)物模型。Adams等[3]為了研究COL11A1 在顱面和軸向骨骼發(fā)育中的功能作用，在斑馬魚身上進(jìn)行了這種基因的復(fù)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示斑馬魚呈現(xiàn)麥?zhǔn)宪浌腔巍⒓顾魅毕?、魚體短縮、死亡率增加。該結(jié)果提供了COL11A1對(duì)正常斑馬魚發(fā)展至關(guān)重要的證據(jù)。作者認(rèn)為斑馬魚能夠提供一種用于研究人類軟骨營養(yǎng)不良機(jī)制的復(fù)染動(dòng)物模型，并能建立潛在的治療方法。

2.2 胚胎斑馬魚骨組織活體染色

骨組織的發(fā)育與重建是一個(gè)完整的動(dòng)態(tài)過程，研究者很難在其他動(dòng)物模型中觀察到該過程。胚胎斑馬魚軀體透明度高，便于直視下觀察。研究者可以采用非侵入式的熒光染色方法進(jìn)行活體染色，并進(jìn)行動(dòng)態(tài)、連續(xù)觀察。目前常用的熒光染料包括鈣黃綠素、茜素紅和槲黃素。染色劑可以直接暴露給藥，通過滲透作用進(jìn)入到斑馬魚胚胎中。不同的染色劑可以顯示不同的組織結(jié)構(gòu)，給研究帶來了極大便利。

鈣黃綠素(calcein)在體內(nèi)專門與鈣離子結(jié)合，直視下可見綠色熒光色團(tuán)。骨骼主要由包含鈣化的骨基質(zhì)組成，因此鈣黃綠素可用于在胚胎發(fā)育期標(biāo)記骨結(jié)構(gòu)。無毒性和強(qiáng)熒光信號(hào)使得鈣黃綠素成為活體斑馬魚骨染色最好的染色劑。Du等[4]跟蹤了鈣黃綠素染色后第1天到第21天的斑馬魚胚胎骨骼結(jié)構(gòu)，并分析了骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2 (bone morphogenetic protein-2，BMP2)對(duì)中軸骨發(fā)育的影響。發(fā)現(xiàn)鈣黃綠素染色確實(shí)能夠標(biāo)示鈣化的骨骼結(jié)構(gòu)，并能用于檢測異常的骨發(fā)育，表明鈣黃綠素染色在斑馬魚胚胎中觀察骨結(jié)構(gòu)具有相當(dāng)?shù)拿舾行?，以及?duì)有骨結(jié)構(gòu)缺陷的突變體進(jìn)行篩選的有效性。與只標(biāo)示綠色熒光的鈣黃綠素不同，茜素紅(alizarin red)在強(qiáng)光下可見直視下紅染，在熒光燈下可見紅色熒光。茜素紅能夠染色骨鈣化基質(zhì)，通過對(duì)比阿爾新藍(lán)復(fù)染，用來區(qū)分軟骨和骨骼。韋英杰等[5]在國內(nèi)首次利用胚胎斑馬魚建立骨質(zhì)疏松模型，采用茜素紅對(duì)9dpf斑馬魚顱骨進(jìn)行染色,以顯微檢測、數(shù)碼成像方法定量分析骨骼染色區(qū)域，取得了一系列研究成果。槲黃素(quercetin)是一種植物激素，廣泛存在于水果和蔬菜(如洋蔥、蘋果、葡萄)中，可用于染色骨基質(zhì)。Zhao等[6]使用槲黃素研究胚胎斑馬魚抗血管生成。研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)這種染色劑的活體干預(yù)已對(duì)胚胎發(fā)育和骨生理有影響,因此最好使用其他染色劑。阿爾新藍(lán)(alcian blue)和阿爾新綠(alcian green)用于染色軟骨細(xì)胞周圍細(xì)胞外基質(zhì)中的蛋白多糖。它可用來顯示胚胎斑馬魚和成年魚復(fù)染軟骨，以此區(qū)分軟骨和骨。Walker等[7]最早開發(fā)了一種無酸的方法，使用阿爾新藍(lán)和茜素紅對(duì)胚胎斑馬魚軟骨和骨骼進(jìn)行復(fù)染，取得了良好的觀察效果。同時(shí)這種方法還有一個(gè)優(yōu)點(diǎn)，即可以染色標(biāo)本的PCR基因型。

2.3 胚胎斑馬魚特異性轉(zhuǎn)基因品系的建立

胚胎斑馬魚有一系列研究優(yōu)勢，如胚胎斑馬魚幾乎完全透明，便于直視觀察；性成熟期約2～3個(gè)月，傳代時(shí)間短，便于繁育；基因可操縱性強(qiáng)，轉(zhuǎn)基因技術(shù)較為成熟。這些優(yōu)勢給研究者帶來了極大的研究便利，并從不同研究角度建立了各種品系的轉(zhuǎn)基因斑馬魚。Thomas等[8]在最小信號(hào)通路反應(yīng)因素控制下，使用轉(zhuǎn)基因技術(shù)在胚胎魚體內(nèi)不同的骨骼細(xì)胞或組織中表達(dá)熒光蛋白，實(shí)現(xiàn)了發(fā)育中的特定細(xì)胞可視化研究。這樣的轉(zhuǎn)基因魚尤其適用在不同的骨骼細(xì)胞或組織中表達(dá)熒光蛋白。Dale等[9]使用Col2a1轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系，比較了兩個(gè)col2a1同系的表達(dá)，并發(fā)現(xiàn)了col2a1b的表達(dá)，只與col2a1a有部分的重疊，并通過比較基因組序列發(fā)現(xiàn)了一個(gè)小的高度保守的序列(R2)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。Delaurier等[10]在2010年報(bào)道建立了一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚品系Tg(sp7:EGFP)b1212，用于研究骨骼發(fā)育。在這一轉(zhuǎn)基因品系中，綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)的表達(dá)重新生成了內(nèi)生的sp7基因表達(dá)，并在胚胎斑馬魚骨發(fā)育的過程中產(chǎn)生了內(nèi)生的sp7基因表達(dá)。在成年魚體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了gfp-陽性細(xì)胞，并被發(fā)現(xiàn)與在截肢后重新生成長的鰭線有關(guān)。該轉(zhuǎn)基因品系為進(jìn)一步研究斑馬魚的囊泡形成和骨骼發(fā)育及再生提供了必要的工具。Kim等[11]建立了一種轉(zhuǎn)基因斑馬魚，明確地表達(dá)了一種特定于骨胚胎的骨結(jié)構(gòu)，用以區(qū)別軟骨的發(fā)育。研究者在斑馬魚內(nèi)生的col10a1表達(dá)域內(nèi)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)2-2-kb的啟動(dòng)子區(qū)域col10a1:GFP轉(zhuǎn)基因斑馬魚，該標(biāo)記只來自成骨細(xì)胞，可用于明確骨發(fā)育過程。杜興華等[12]利用To12轉(zhuǎn)座子和Cre-loxP技術(shù)構(gòu)建Tg(nkx2.3:CreERT2)和Tg(nkx2.3:EGFP-CAAX)轉(zhuǎn)基因魚品系，發(fā)現(xiàn)敲低bmper、miR-23a的表達(dá)嚴(yán)重影響斑馬魚的顱面骨發(fā)育，為與咽囊相關(guān)的研究工作提供了重要的工具。

2.4 胚胎斑馬魚突變體基因篩選

突變基因的鑒定是組織和器官發(fā)育研究中非常重要的一個(gè)方面。通過突變基因,研究者可以明確目標(biāo)基因在骨正常發(fā)育中的作用。在這類研究中,斑馬魚的一個(gè)特定優(yōu)勢得以凸顯即使用熒光標(biāo)記轉(zhuǎn)基因胚胎魚，使得實(shí)時(shí)監(jiān)控骨發(fā)育成為可能。研究者已進(jìn)行大規(guī)模突變基因篩選，并已確定50多個(gè)與軟骨和骨骼發(fā)育缺陷有關(guān)的突變基因。嬰兒期的廣義動(dòng)脈鈣化是一種致命的人類疾病，大多數(shù)病例被認(rèn)為是由外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶-1(ectonucleotide pyrophosphatase/phosphodiesterase-1，ENPP1)的突變引起的。一些假黃色瘤(PXE)的病例最近與ENPP1有關(guān)。Apschner等[13]利用斑馬魚ENPP1突變體證明在皮膚、軟骨、心臟、脊索等組織中，異位礦化是獨(dú)立于典型的成骨細(xì)胞或軟骨標(biāo)記的表達(dá)而發(fā)生的。Eames等[14]使用斑馬魚突變體來揭示軟骨細(xì)胞抑制軟骨細(xì)胞的成熟。研究者分離了一組突變基因，減少了軟骨基質(zhì)，并增加了軟骨下骨。位置克隆鑒定了兩種基因，fam20b和xylo三段(xylt1)的損傷，這兩種基因都編碼了前列腺素(prostaglandin，PG)合成酶。超微結(jié)構(gòu)分析顯示變異矩陣組織和突變體中軟骨細(xì)胞肥大的早期細(xì)胞特征。研究發(fā)現(xiàn)fam20b和xylt1參與了PG合成。Gray等[15]描述了三種隱性的斑馬魚leviathan/col8a1a突變等位基因(m531，vu41，vu105)，它破壞了col8a1a，并導(dǎo)致了胚胎脊索的折疊，從而導(dǎo)致了成年的脊柱畸形。研究表明，在胚胎發(fā)生時(shí)，藥物在胚胎發(fā)生時(shí)的短暫性喪失或抑制利syl氧化酶，足以引起成年后的脊椎融合和脊柱側(cè)凸。

2.5 胚胎斑馬魚高通量藥物篩選

中藥成分的有效性及安全性得到了日益重視，如何進(jìn)行高通量、快速的篩選，是目前研究人員需要面臨的問題。傳統(tǒng)的的動(dòng)物模型在藥物高通量篩選中存在各種弊端，如耗時(shí)長，成本高等，而體外模型不能完全模擬體內(nèi)環(huán)境，篩選質(zhì)量可信度不高。近年來國內(nèi)外研究者利用胚胎斑馬魚這一模型，對(duì)各類中藥成分進(jìn)行了大規(guī)模、高通量篩選，具有在體化、微板化、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)、簡單、高效等優(yōu)勢。Fleming等[16]2005年首次利用胚胎斑馬魚開發(fā)了一種快速、高通量的活體藥物篩選模型，該模型能夠識(shí)別出在骨骼中產(chǎn)生的代謝作用的藥物，活性維生素D3和間斷性給予甲狀旁腺素(parathyroid hormone，PTH)會(huì)促進(jìn)骨礦化，而持續(xù)暴露于PTH則會(huì)導(dǎo)致凈骨損失。研究者認(rèn)為該模型具有快速、經(jīng)濟(jì)和遺傳的可追溯性，能夠?yàn)椴溉閯?dòng)物模型提供一種強(qiáng)有力的輔助手段。陳穎等[17]利用受精后1 DPF(days post fertilization，DPF)胚胎斑馬魚毒性模型評(píng)價(jià)26種常見傷科中藥材的安全性，發(fā)現(xiàn)13種藥味(續(xù)斷等)的水煎液致幼斑馬魚臟器形態(tài)明顯改變,毒性主要表現(xiàn)為卵黃囊腫大、變形、變黑,心包水腫、出血等,且它們的魚LC50值較低。其余13種藥味(鹿銜草等),未見魚臟器毒性,且致魚死亡濃度高。研究者認(rèn)為斑馬魚模型具有簡單、高效、實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)的優(yōu)勢,使中藥在體毒性規(guī)?；Y選成為可能。

3 成年斑馬魚模型

胚胎斑馬魚用于研究骨骼系統(tǒng)的發(fā)育與藥物高通量篩選有著巨大優(yōu)勢，然而,由于缺乏成熟的骨骼，骨組織的代謝、修復(fù)和重建無法使用胚胎斑馬魚進(jìn)行。成年斑馬魚骨屬性與人類相似,提示可能成為用于研究人類骨骼疾病的模型，研究者進(jìn)行了不斷探索，目前已復(fù)制出數(shù)個(gè)成年魚骨病如骨質(zhì)疏松，用于分析病理生理機(jī)制和設(shè)計(jì)新的治療方案。因此,成年斑馬魚模型是一個(gè)研究骨代謝和骨轉(zhuǎn)換重要的模型。人們在研究中發(fā)現(xiàn),成年斑馬魚的魚鰭和鱗片各自代表具有獨(dú)立特征的模型。

3.1 成年斑馬魚模型的檢測方法

成年斑馬魚體長約3～4 cm，體表覆蓋鱗片。在骨骼疾病研究中，鱗片、脊柱、尾鰭是最常用的研究部位，常用的觀察方法如組織提取檢測、特異性染色、顯微觀察、雙能X線、Micro-CT等方法均已常規(guī)開展。在過去的幾年里,斷層技術(shù)如時(shí)間門控光學(xué)投影斷層分析(TGOPT)被用于成年斑馬魚來重建三維內(nèi)部結(jié)構(gòu)，斑馬魚完整骨骼系統(tǒng)可由μCT掃描,可進(jìn)行全身以及特定骨骼(如脊柱)的骨密度(bone mineral density，BMD)測定，全身μCT掃描可進(jìn)行斑馬魚骨骼系統(tǒng)的3D重建以檢測特殊的膳食(如鍶)補(bǔ)充后不同的骨骼結(jié)構(gòu)顯影，這些檢測方法為研究提供了便利條件。Pasqualetti等[18]將成年斑馬魚鱗片進(jìn)行多種染色，發(fā)現(xiàn)鱗片的特定礦化模式和分布在不同區(qū)域的成骨細(xì)胞分布。沿著外環(huán)觀察到，在礦化的過程中，鱗片邊緣復(fù)染細(xì)胞在礦化過程發(fā)生之前就會(huì)遷移并組織起來，表現(xiàn)出堿性磷酸酶活性。內(nèi)環(huán)也以新的矩陣沉積為特征。研究者認(rèn)為斑馬魚鱗片是分析骨形成和礦化過程中成骨細(xì)胞行為的一個(gè)非常有效的模型。Kitamura等[19]為研究成骨-破骨細(xì)胞相互作用，將6月齡斑馬魚鱗片進(jìn)行qPCR檢測，分析了RANK-RANKL-OPG、semaphorin 4D相關(guān)mRNA，發(fā)現(xiàn)3.0 g負(fù)載振動(dòng)顯著降低了RANKL/RANK功能比，而靜態(tài)3.0 g加速導(dǎo)致了骨吸收mRNA的表達(dá)。Hur等[20]利用Micro-CT檢測成年斑馬魚脊椎，進(jìn)行表型組學(xué)研究。在大量的位點(diǎn)上，對(duì)數(shù)以百計(jì)的表型和密度特征進(jìn)行了分析。發(fā)現(xiàn)與人類骨質(zhì)疏松癥有關(guān)的表型和甲狀腺刺激激素受體過度活躍。Farwell等[21]利用成年斑馬魚再生尾鰭作為活體模型，觀察TMEM184 A對(duì)再生的血管再生的表達(dá)及影響。在Tmem184a分子的作用下，再生尾鰭產(chǎn)生了混亂的再生血管，這些血管不會(huì)向外生長，也限制了正常的總鰭的再生。

3.2 骨質(zhì)疏松模型

胚胎斑馬魚骨質(zhì)疏松模型目前在國內(nèi)外得到了廣泛應(yīng)用[22-24]，然而存在如下幾個(gè)問題：① 胚胎斑馬魚骨骼尚未成熟，正常的骨重建機(jī)制尚未完全建立；② 胚胎斑馬魚的軀體較小，約2～4 mm，目前多采用頭骨染色觀察，其他檢測方法難以進(jìn)行；③ 藥物，尤其是中藥天然成分的耐受性較差，許多藥物試驗(yàn)難以進(jìn)行。為此研究者近年不斷開發(fā)成年斑馬魚模型用于骨質(zhì)疏松研究。Vrieze等[25]將成年斑馬魚暴露于含潑尼松龍藥液的水中，取再生的魚鱗片檢測礦物質(zhì)含量和破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的骨基因表達(dá)譜。發(fā)現(xiàn)潑尼松龍?zhí)岣吡似乒羌?xì)胞的活性和骨基質(zhì)的吸收，減緩了鈣/磷的摩爾比率的增加，預(yù)示著改變骨礦化過程。通過在骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的時(shí)間剖面上的改變，在骨形成和骨吸收的不平衡等方面阻礙再生。研究者認(rèn)為糖皮質(zhì)激素能夠成功誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松斑馬魚模型，提供一種極其高效的研究工具。尹恒[26]利用成年斑馬魚建立糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的骨質(zhì)疏松(glucocorticoid induced osteoporosis，GIOP)斑馬魚模型，并研究中藥龜鹿二仙膠對(duì)魚鱗片礦化、骨膠原結(jié)構(gòu)及TGF-β/Smad信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)激素能夠成功誘導(dǎo)出骨質(zhì)疏松的斑馬魚，而鱗片的檢測結(jié)果可以為后續(xù)的研究提供一定參考。

成年斑馬魚骨質(zhì)疏松模型是一種非常有效的研究工具，具有諸多優(yōu)勢：①斑馬魚易飼養(yǎng)、成本低；②暴露給藥方法簡便，給藥濃度可精確控制；③大幅度縮短造模及給藥干預(yù)時(shí)間，提高研究效率；④分子水平與人類相似度高。這些優(yōu)勢給研究帶來了極大的便利。與此同時(shí)斑馬魚骨質(zhì)疏松模型還有一些亟待解決的問題：①目前開展的骨質(zhì)疏松模型多采用激素誘導(dǎo)，其病理機(jī)制與原發(fā)性骨質(zhì)疏松并不完全相同，因此研究結(jié)果可能受到影響；②目前斑馬魚模型的檢測指標(biāo)不夠統(tǒng)一，不能形成完善的參考體系，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度不高；③目前成年斑馬魚骨質(zhì)疏松研究中，骨標(biāo)本一般選擇脊柱或鱗片，缺乏骨-血清代謝相關(guān)性研究；④由于斑馬魚體型的限制，只能進(jìn)行一次性剪尾法采血，難以進(jìn)行連續(xù)性血清學(xué)藥效鑒定。因此，需要開展進(jìn)一步的研究來完善這一模型。

3.3 骨再生與修復(fù)

以尾鰭為代表的成年斑馬魚部分組織在截肢或受傷后擁有再生的能力。尾鰭由基底部骨骼、放射狀鱗質(zhì)鰭條(骨組織)、軟組織和血管組成[27]。尾鰭的基底部骨骼為軟骨內(nèi)骨化，切除后不能再生。放射狀鱗質(zhì)鰭條不含細(xì)胞，為膜內(nèi)骨化，可實(shí)現(xiàn)完全再生，因此被用于研究成熟骨組織的修復(fù)和再生能力。Sousa等[28]在成年斑馬魚尾鰭上建立了一個(gè)骨折模型，將骨骼放射狀骨折，對(duì)比截肢模型，發(fā)現(xiàn)損傷反應(yīng)的初始階段與傷口愈合分子標(biāo)記的激活是相同的。然而，在骨折試驗(yàn)中，胚芽的表達(dá)比在截肢后的再生過程要晚，骨細(xì)胞的沉積和基因的表達(dá)也被延遲。進(jìn)一步研究表明，骨骼和血管也會(huì)受到影響。表明骨折修復(fù)的時(shí)間比截肢后再生的時(shí)間更長。研究者認(rèn)為這一新模型可能有助于確定控制骨折的關(guān)鍵過程，并有助于改善人類的骨骼修復(fù)。Mahamid等[29]利用同步加速器微光束X射線衍射和小角度散射，結(jié)合低溫掃描電子顯微鏡，研究了斑馬魚尾鰭組織的連續(xù)礦化過程。前者提供了礦物相和礦物顆粒大小和形狀的信息，后者則提供了原生水化組織的高分辨率成像。這兩種技術(shù)的整合表明，新的礦物是作為一種無定形的磷酸鈣納米球的包裹來運(yùn)送和沉積的，然后在膠原基質(zhì)中轉(zhuǎn)化為結(jié)晶磷灰石骨板。該研究為尾鰭的再生與修復(fù)提供了全新的方向。此外，斑馬魚尾鰭透明度高，有利于活體染色和放射學(xué)觀察，為研究帶來了便利條件，目前已有多種轉(zhuǎn)基因品系用于骨再生與修復(fù)。

4 總結(jié)與展望

斑馬魚以其“一體兩面”獨(dú)特的結(jié)構(gòu)與生理，為骨骼疾病的研究提供了一種全新的、高效而靈活的動(dòng)物模型，經(jīng)過數(shù)十年的不斷研究，在分子、基因水平均得到了長足的進(jìn)展，越來越成為人類骨骼疾病基因分析與治療、藥物開發(fā)研究方面的重要工具。在中醫(yī)藥研究中，結(jié)合傳統(tǒng)中醫(yī)理論，斑馬魚將成為一種快速、高通量篩選中藥的一個(gè)重要模型，為全面開展藥效學(xué)、毒理學(xué)及藥物代謝學(xué)等全方面多角度的研究打下基礎(chǔ)。