芽孢桿菌產(chǎn)胞外酶的活性分析及其對(duì)凡納濱對(duì)蝦的作用?

游 龍， 韓 茵， 張 凱， 祁自忠? ?

(1.中國(guó)海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院應(yīng)用微生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266003； 2.青島貝寶海洋科技有限公司，山東 青島 266400)

在若干抗生素替代品中，益生菌是最有潛力的一種，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)[1]。益生菌的推廣應(yīng)用解決了抗生素及其他藥物濫用所帶來(lái)的問(wèn)題，并能夠通過(guò)提高水生動(dòng)物的生產(chǎn)性能和控制疾病等途徑提高水產(chǎn)品的產(chǎn)量，從而創(chuàng)造更好的經(jīng)濟(jì)效益[2]。水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域，應(yīng)用最多的益生菌是乳酸菌、芽孢桿菌和雙歧桿菌[3-4]。芽孢桿菌在缺乏營(yíng)養(yǎng)或遇不良環(huán)境時(shí)能夠形成內(nèi)生孢子，對(duì)干燥、高溫、高壓、氧化等不良環(huán)境具有很強(qiáng)的抵抗力[5]，具有易于保存，使用方便等特點(diǎn)，因此具有較大的推廣和應(yīng)用價(jià)值。

益生菌的作用機(jī)理之一是能產(chǎn)生有益的代謝產(chǎn)物，如乳酸菌可產(chǎn)生揮發(fā)性脂肪酸和乳酸，芽孢桿菌可產(chǎn)生脂肽類(lèi)代謝產(chǎn)物如表面活性素、伊枯草菌素等，可以有效抑制致病菌生長(zhǎng)；某些益生菌也能產(chǎn)生多種酶類(lèi)，參與動(dòng)物的消化作用，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收[6-7]，芽孢桿菌就是其中之一。芽孢桿菌進(jìn)入動(dòng)物消化道后能夠迅速定植并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，這些消化酶作用于植物性飼料中復(fù)雜的大分子物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、脂類(lèi)和碳水化合物等，將其降解成易于吸收利用的小分子物質(zhì)，改善飼料的適口性，促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收，進(jìn)而促進(jìn)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)[8]。至今為止，中國(guó)外對(duì)益生芽孢桿菌提高水生動(dòng)物消化酶活力、促進(jìn)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)，提高魚(yú)蝦類(lèi)的存活率作過(guò)不少研究[9]。丁賢等[10]的研究亦顯示水生動(dòng)物的生長(zhǎng)與消化酶活性之間存在一定的正向作用關(guān)系，即消化酶活性在一定程度上反映出機(jī)體對(duì)飼料養(yǎng)分的消化利用程度。因此，具有較高消化酶活性的芽孢桿菌可能對(duì)水生動(dòng)物的生長(zhǎng)具有更好的促進(jìn)作用。

一些研究表明芽孢桿菌作為益生菌能夠改善動(dòng)物體內(nèi)的微環(huán)境，提高水生動(dòng)物的消化性能和免疫性能，進(jìn)而促進(jìn)其生長(zhǎng)，提高水生動(dòng)物的存活率[1]。華雪銘等[9]將芽孢桿菌按照不同濃度添加到飼料中，投喂異育銀鯽，實(shí)驗(yàn)異育銀鯽的生長(zhǎng)具有顯著提高，實(shí)驗(yàn)異育銀鯽對(duì)嗜水氣單胞菌的抵抗力顯著增強(qiáng)。丁賢等[10]在飼料中添加芽孢桿菌制劑，發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組凡納濱對(duì)蝦的蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶較對(duì)照組顯著提高，對(duì)蝦成活率和增重率均優(yōu)于對(duì)照組。雖然，芽孢桿菌的益生效果已在大量的研究中體現(xiàn)，但對(duì)于芽孢桿菌所產(chǎn)生的胞外酶與水生動(dòng)物消化道內(nèi)酶活性的關(guān)系仍需要進(jìn)一步研究。

本研究探討了液體發(fā)酵單株芽孢桿菌(解淀粉芽孢桿菌YL-10、枯草芽孢桿菌YL-09、地衣芽孢桿菌ge6-1和巨大芽孢桿菌H1)和多株混合芽孢桿菌(Tm1、Tm2、Tm3、Tm4和Tm5)的產(chǎn)酶情況，根據(jù)消化酶活性的高低和靜置期消化酶的穩(wěn)定性，選取解淀粉芽孢桿菌YL-10和多株混合芽孢桿菌Tm3添加到對(duì)蝦飼料中飼喂凡納濱對(duì)蝦，研究單株芽孢桿和多株混合芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、消化酶活性和肝胰腺中胞外酶組成的影響，為芽孢桿菌制劑作為益生菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的合理應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

巨大芽孢桿菌(B.megateriumH1)：分離自山東蓬萊健康養(yǎng)殖的仿刺參(ApostichopusjaponicusSelenka)腸道；枯草芽孢桿菌(B.subtilisYL-09)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformisge6-1)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciensYL-10)：分離自山東膠南龍灣近海沉積物。

1.2 培養(yǎng)基

(1)胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)用于菌株活化培養(yǎng)。

(2)發(fā)酵培養(yǎng)基以TSB為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，以麥麩替代90%的蛋白胨和葡萄糖含量。

1.3 芽孢桿菌酶學(xué)性質(zhì)研究

1.3.1 粗酶液的制備 用TSB培養(yǎng)基活化菌株YL-10、YL-09、H1和ge6-1，將培養(yǎng)物按1%接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，32 ℃、160 r/m培養(yǎng)24 h，取發(fā)酵液6 000g離心10 min，吸取上清液即為單株芽孢桿菌粗酶液(分別標(biāo)注為YL-10、YL-09、ge6-1和H1)。在培養(yǎng)24 h后的單株芽孢桿菌培養(yǎng)液中分別選取任意3株按1∶1∶1(Tm1：YL-10+H1+ge6-1；Tm2：YL-10+H1+YL-09；Tm3：YL-10+YL-09+ge6-1；Tm4：YL-09+H1+ge6-1)比例混合，以及四株按1∶1∶1∶1(Tm5：YL-10+H1+ge6-1+YL-09)的比例混合，室溫放置2 h后，6 000g離心10 min，吸取上清液即為多株混合芽孢桿菌粗酶液。

1.3.2 消化酶活性測(cè)定方法 蛋白酶活性采用Folin-酚法[11]測(cè)定：在pH為7.5的條件下，37 ℃水浴反應(yīng)10 min，酶液1 min水解干酪素產(chǎn)生1.0 μg酪氨酸作為1個(gè)酶活性單位(U)；

淀粉酶活性采用3,5-二硝基水楊酸顯色法(DNS法)[12]測(cè)定：在pH為5.6，溫度為40 ℃的條件下，酶液1 min催化淀粉生成1.0 μg麥芽糖作為1個(gè)酶活性單位(U)；

脂肪酶活性采用以聚乙烯醇橄欖油為底物的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定法[13]測(cè)定：在pH為7.5，溫度為40 ℃的條件下，酶液1 min水解底物產(chǎn)生1.0 μmol的可滴定的脂肪酸，即為1個(gè)酶活性單位(U)。

1.3.3 芽孢桿菌胞外酶產(chǎn)生情況測(cè)定 采用API zym系統(tǒng)對(duì)單株芽孢桿菌發(fā)酵液(YL-10、YL-09、H1和ge6-1)和多株混合芽孢桿菌發(fā)酵液(Tm1、Tm2、Tm3、Tm4和Tm5)中胞外酶產(chǎn)生情況進(jìn)行半定量測(cè)定。測(cè)定過(guò)程分別吸取單株與多株混合芽孢桿菌粗酶液65 μL，加到試劑條小室中，并將試劑條放入濕盒，于每個(gè)API zym酶學(xué)測(cè)試板邊緣標(biāo)記菌株名稱(chēng)，37 ℃放置4 h。培養(yǎng)結(jié)束后，于每個(gè)小室中分別滴加一滴ZYM-A試劑和一滴ZYM-B試劑，反應(yīng)5 min后，強(qiáng)光下照射10 s，根據(jù)顯色進(jìn)行結(jié)果的判定，并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作為篩選芽孢桿菌進(jìn)行凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)的依據(jù)。

1.4 凡納濱對(duì)蝦養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)

1.4.1 實(shí)驗(yàn)菌株 單株芽孢桿菌：解淀粉芽孢桿菌YL-10，由于YL-10具有最高的蛋白酶和淀粉酶活性，脂肪酶活性也僅低于ge6-1，選取該芽孢桿菌進(jìn)行凡納濱對(duì)蝦實(shí)驗(yàn)。

多株混合芽孢桿菌：根據(jù)多株混合芽孢桿菌在靜置期的消化酶活性(結(jié)果另見(jiàn))，選取最高的Tm3組(解淀粉芽孢桿菌YL-10，枯草芽孢桿菌YL-09，地衣芽孢桿菌ge6-1)進(jìn)行凡納濱對(duì)蝦實(shí)驗(yàn)。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦 實(shí)驗(yàn)凡納濱對(duì)蝦來(lái)自青島貝寶海洋科技有限公司，平均初始體重為(0.005±0.001)g，體色正常，健康活潑，共270只。實(shí)驗(yàn)前先暫養(yǎng)7d，每日換水1次，投餌4次。

1.4.3 實(shí)驗(yàn)飼料 對(duì)照組飼料：寧波天邦公司生產(chǎn)的“蝦好養(yǎng)”對(duì)蝦配合飼料，粗蛋白含量42.5%，脂肪含量為5%。

實(shí)驗(yàn)組飼料：(1)YL-10菌株活化后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，將菌液添加到對(duì)蝦配合飼料中，制成YL-10菌株含量為108CFU/g的對(duì)蝦飼料。(2)菌株YL-10、YL-09和ge6-1活化后接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h，培養(yǎng)完成后將菌液等量混勻，添加到對(duì)蝦配合飼料中，制成多株混合芽孢桿菌Tm3(YL-10+YL-09+ge6-1)含量為108CFU/g的對(duì)蝦飼料。室溫晾干后4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.4 養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)處理組：YL-10組：投喂添加解淀粉芽孢桿菌YL-10的對(duì)蝦飼料；Tm3組：投喂添加多株混合芽孢桿菌Tm3的對(duì)蝦飼料；對(duì)照組：只投喂對(duì)蝦配合飼料。每組各設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行30尾對(duì)蝦。實(shí)驗(yàn)期間，每日投餌4次，每日吸污、換水，實(shí)驗(yàn)持續(xù)42 d。根據(jù)對(duì)蝦攝食情況調(diào)節(jié)投喂量，水溫26～32℃，鹽度(30±1)，pH=8.0±0.2，連續(xù)充氣。

1.4.5 指標(biāo)測(cè)定

1.4.5.1 生長(zhǎng)指標(biāo) 生長(zhǎng)性能指標(biāo)的計(jì)算公式如下：

體重增加(Weight gain,WG)=末均重-初均重；

特定生長(zhǎng)率(Special growth rate,SGR)=(ln末均重-ln初均重)/飼養(yǎng)天數(shù)×100%；

存活率(Survival rate,SR)=試驗(yàn)結(jié)束對(duì)蝦尾數(shù)/試驗(yàn)開(kāi)始對(duì)蝦尾數(shù)×100%。

1.4.5.2 對(duì)蝦肝胰腺中消化酶活性測(cè)定 于實(shí)驗(yàn)的第42天，隨機(jī)選取規(guī)格相近的各平行組對(duì)蝦，每個(gè)組5只，冰浴解剖取出肝胰腺，去離子水沖洗后用濾紙吸干，迅速稱(chēng)重，置于玻璃勻漿器中，準(zhǔn)確加入9倍體積生理鹽水，冰浴勻漿，勻漿液用生理鹽水稀釋10倍，配制成1%的勻漿稀釋液，冷凍離心10 min(4 ℃，6 000g)，取上清液測(cè)定消化酶活性。

蛋白質(zhì)含量采用試劑盒(購(gòu)自南京建成生物研究所)測(cè)定；

蛋白酶活性采用Folin-酚法[11]測(cè)定；

淀粉酶活性采用3,5-二硝基水楊酸顯色法(DNS法)[12]測(cè)定；

脂肪酶活性采用以聚乙烯醇橄欖油為底物的標(biāo)準(zhǔn)氫氧化鈉溶液滴定法[13]測(cè)定。

1.4.5.3 對(duì)蝦肝胰腺中胞外酶測(cè)定 于實(shí)驗(yàn)結(jié)束第42天，冰浴解剖取出各平行組對(duì)蝦肝胰腺，稱(chēng)重，冰浴勻漿，配制成10%的肝胰腺勻漿液，分別取65 μL的勻漿液于API zym試劑條小室中，放入濕盒，于每個(gè)API zym酶學(xué)測(cè)試板邊緣標(biāo)記菌株，37 ℃培養(yǎng)4 h，培養(yǎng)完成后于每個(gè)小室中分別滴加一滴ZYM-A試劑和一滴ZYM-B試劑，反應(yīng)5 min，在強(qiáng)光下照射10 s，根據(jù)顯色進(jìn)行結(jié)果的判定并記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS11.5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和統(tǒng)計(jì)，先對(duì)數(shù)據(jù)作單因素方差分析，若處理間差異顯著，再用Duncan’s分析進(jìn)行多重比較，顯著性水平為0.05。

2 結(jié)果

2.1 芽孢桿菌消化酶活性測(cè)定

四株芽孢桿菌(YL-10、YL-09、H1和ge6-1)在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h后，測(cè)定發(fā)酵液中消化酶(蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶)活性，結(jié)果如圖1所示。四株芽孢桿菌均能產(chǎn)生蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，但四株芽孢桿菌產(chǎn)生消化酶的能力各不相同。其中，YL-10具有最高的蛋白酶活性和淀粉酶活性，分別為335和3.0 U/mL；ge6-1具有最高的脂肪酶活性，為5.0 U/mL。測(cè)定多株混合芽孢桿菌發(fā)酵液中消化酶活性，結(jié)果顯示：多株混合芽孢桿菌Tm1、Tm2、Tm3和Tm5發(fā)酵液中蛋白酶活性與淀粉酶活性均高于單株芽孢桿菌H1和ge6-1；多株混合芽孢桿菌Tm1具有最高的蛋白酶活性和脂肪酶活性，Tm5具有最高的淀粉酶活性。

圖1 芽孢桿菌培養(yǎng)物中消化酶活性測(cè)定Fig.1 Protease activity, lipase activity and amylase activity of single and mixed Bacillus cultures

2.2 芽孢桿菌發(fā)酵液中胞外酶產(chǎn)生情況

單株芽孢桿菌和多株混合芽孢桿菌發(fā)酵液中胞外酶的組成如表1所示。酶譜顯示：?jiǎn)沃暄挎邨U菌(YL-10，YL-09，H1和ge6-1)發(fā)酵液中均能檢測(cè)到酯酶(C4)、類(lèi)脂酯酶(C8)和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶。僅H1發(fā)酵液中能檢測(cè)到β-葡萄糖醛酸酶，僅YL-10發(fā)酵液中能檢測(cè)到β-葡萄糖苷酶，僅YL-09發(fā)酵液中能檢測(cè)到α-甘露糖苷酶。單株芽孢桿菌YL-10、YL-09和H1發(fā)酵液中能檢測(cè)到6種胞外酶，ge6-1發(fā)酵液中能檢測(cè)到7種胞外酶。

多株混合芽孢桿菌發(fā)酵液中均能檢測(cè)到堿性磷酸酶、酯酶(C4)、類(lèi)脂酯酶(C8)、亮氨酸芳胺酶、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶和α-葡萄糖苷酶，其中Tm1、Tm4和Tm5培養(yǎng)液中能檢測(cè)到β-葡萄糖醛酸酶。多株混合芽孢桿菌Tm1、Tm4和Tm5發(fā)酵液中均能檢測(cè)到8種胞外酶，Tm2和Tm3發(fā)酵液中能檢測(cè)到7種胞外酶。

表1 API zym系統(tǒng)測(cè)定單株芽孢桿菌和多株混合芽孢桿菌胞外酶產(chǎn)生情況半定量結(jié)果Table 1 Extracellular enzymatic activity of single and mixed Bacillus cultures

注：1.各芽孢桿菌培養(yǎng)物均不產(chǎn)生：類(lèi)脂酶(C14)、纈氨酸芳胺酶、胱氨酸芳胺酶、胰島素、胰凝乳蛋白酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、N-乙酰葡萄糖胺酶和β-巖藻糖苷酶。2.YL-09：枯草芽孢桿菌；ge6-1：地衣芽孢桿菌；H1：巨大芽孢桿菌；YL-10：解淀粉芽孢桿菌；Tm1：解淀粉芽孢桿菌+巨大芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌；Tm2：解淀粉芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+巨大芽孢桿菌；Tm3：解淀粉芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌；Tm4：枯草芽孢桿菌+巨大芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌；Tm5：解淀粉芽孢桿菌+巨大芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌+枯草芽孢桿菌。3.陰性反應(yīng)：0；陽(yáng)性反應(yīng)：1～5。

Note：1.Negative results were obtained with:Lipase(C14),Valine arylamidase,α-chymotrypsin,Cystine arylamidase,Trypsin,α-galactosidase,β-glucuronidase,N-acetyl-β-glucosaminidase and α-fucosidase.2.YL-09=B.subtilis;ge6-1=B.licheniformis;H1=B.megaterium;YL-10=B.amyloliquefaciens;Tm1=B.amyloliquefaciens+B.megaterium+B.licheniformis;Tm2=B.amyloliquefaciens+B.subtilis+B.megaterium;Tm3=B.amyloliquefaciens+B.subtilis+B.licheniformis;Tm4=B.subtilis+B.megaterium+B.licheniformis;Tm5=B.amyloliquefaciens+B.subtilis+B.licheniformis+B.megaterium.3.0=negative reaction;1～5=positive reaction.

2.3 單株芽孢桿菌YL-10和多株混合芽孢桿菌Tm3對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的影響

飼料中添加芽孢桿菌YL-10和Tm3對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)的影響如表2所示。與對(duì)照組相比，測(cè)得實(shí)驗(yàn)組YL-10與實(shí)驗(yàn)組Tm3對(duì)蝦的體重增加、特定生長(zhǎng)率和存活率均有顯著提高(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組YL-10和實(shí)驗(yàn)組Tm3對(duì)蝦體重增加、特定生長(zhǎng)率和存活率無(wú)明顯差別(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組Tm3對(duì)蝦具有最高的成活率，為(91.1±1.9)%，較對(duì)照組提高了10.8%。

表2 添加單株芽孢桿菌YL-10與多株混合芽孢桿菌Tm3對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)和存活率的影響Table 2 Growth performance and survival of L.vannamei fed with single and mixed Bacillus cultures, YL-10 and Tm3

注：上標(biāo)字母不相同表示差異顯著(P<0.05)。

Note: Values(means±SE)in the same column with different superscripts are significantly different (P<0.05).

2.4 單株芽孢桿菌YL-10和多株混合芽孢桿菌Tm3發(fā)酵液對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺消化酶活性的影響

由圖2可知，實(shí)驗(yàn)組YL-10和實(shí)驗(yàn)組Tm3對(duì)蝦肝胰腺中蛋白酶活性較對(duì)照組分別提高了11.2%和20.7%；實(shí)驗(yàn)組Tm3對(duì)蝦蛋白酶活性較對(duì)照組有顯著提高(P<0.05)，實(shí)驗(yàn)組Tm3與實(shí)驗(yàn)組YL-10之間蛋白酶活性無(wú)明顯差別(P>0.05)。實(shí)驗(yàn)組Tm3對(duì)蝦肝胰腺中脂肪酶活性較對(duì)照組顯著提高(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)組YL-10肝胰腺中脂肪酶活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)組YL-10具有最高的淀粉酶活性，較對(duì)照組淀粉酶活性提高了44.1%，實(shí)驗(yàn)組Tm3淀粉酶活性較對(duì)照組提高了29.4%。

圖2 添加單株芽孢桿菌YL-10與多株混合芽孢桿菌Tm3對(duì)凡納濱對(duì)蝦消化酶的影響Fig.2 Protease activity,lipase activity and amylase activity of L.vannamei fed with control diet,YL-10(B.amyloliquefaciens YL-10)and Tm3(B.amyloliquefaciens+B.subtilis+B.licheniformis)

2.5 芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺胞外酶活性的影響

實(shí)驗(yàn)組(YL-10和Tm3)和對(duì)照組對(duì)蝦肝胰腺中胞外酶組成如表3所示，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)蝦肝胰腺中均檢測(cè)到堿性磷酸酶、酯酶(C4)、類(lèi)脂酶(C8)、亮氨酸芳胺酶、纈氨酸芳胺酶、胰島素、酸性磷酸酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、N-乙酰葡萄糖胺酶、α-甘露糖苷酶和α-巖藻糖苷酶(16種)。實(shí)驗(yàn)組YL-10對(duì)蝦肝胰腺中類(lèi)脂酶(C8)、亮氨酸芳胺酶、纈氨酸芳胺酶、胰島素、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、β-半乳糖苷酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶和α-巖藻糖苷酶(10種)的活性高于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組Tm3對(duì)蝦肝胰腺中類(lèi)脂酶(C8)、亮氨酸芳胺酶、纈氨酸芳胺酶、胰島素、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-葡萄糖醛酸酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、α-甘露糖苷酶和α-巖藻糖苷酶(12種)的活性高于對(duì)照組。其中，Tm3具有最高的亮氨酸芳胺酶、纈氨酸芳胺酶、萘酚-AS-BI-磷酸水解酶、α-半乳糖苷酶和β-葡萄糖醛酸酶活性；YL-10具有最高的類(lèi)脂酶(C8)、酸性磷酸酶和α-巖藻糖苷酶活性。

3 討論

芽孢桿菌(Bacillus)能夠產(chǎn)生內(nèi)生孢子，抗逆性強(qiáng)，能耐高溫高壓，易于儲(chǔ)存，是一種具有發(fā)展前景的益生菌[5]。芽孢桿菌在生長(zhǎng)繁殖的同時(shí)能夠分泌產(chǎn)生包括蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶在內(nèi)的多種胞外酶，能有效分解大分子營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的消化吸收[8]，這是芽孢桿菌作為益生菌的益生機(jī)理之一。因此，選取具有較高消化酶活性的芽孢桿菌應(yīng)用于對(duì)蝦養(yǎng)殖，能夠更好地促進(jìn)對(duì)蝦的生長(zhǎng)。然而，不同芽孢桿菌菌株之間所產(chǎn)生的胞外酶的種類(lèi)和活性具有較大差異。陶容霞[14]研究了17株芽孢桿菌產(chǎn)酶特性，結(jié)果顯示，17株芽孢桿菌的消化酶活性各不相同，其中，脂肪酶產(chǎn)生能力差異尤其顯著。唐麗江等[15]測(cè)定了10株芽孢桿菌淀粉酶產(chǎn)生能力，測(cè)得菌株P(guān)ab03具有最高的淀粉酶活力，為(31.331±0.985)U，而同是芽孢桿菌的菌株P(guān)SAF1淀粉酶活力僅為(0.366±0.022) U。本實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定四株單株芽孢桿菌(YL-10、YL-09、ge6-1和H1)和五種多株混合芽孢桿菌(Tm1、Tm2、Tm3、Tm4和Tm5)發(fā)酵液中的消化酶活性，結(jié)果表明：YL-10具有最高的蛋白酶和淀粉酶活性，ge6-1具有最高的脂肪酶活性；與單株芽孢桿菌ge6-1和H1相比，多株混合芽孢桿菌Tm1、Tm2、Tm3和Tm5具有更高的蛋白酶和淀粉酶活性。在益生菌的實(shí)際應(yīng)用中，混合微生物制劑相較于單一微生物制劑具有更好的穩(wěn)定性，作為飼料添加劑應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)取得了更好的效果[2]。王彥波等[16]的研究顯示混合益生菌(包含等量的凝結(jié)芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、乳酸乳球菌、嗜酸乳桿菌和屎腸球菌，活菌總數(shù)為1×109CFU/g)能夠顯著促進(jìn)凡納濱對(duì)蝦的生長(zhǎng)和腸道消化酶產(chǎn)生。Zokaeifar等[17]將混合芽孢桿菌BM5和BM8添加到飼料中飼喂凡納濱對(duì)蝦也取得了相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。因此，本實(shí)驗(yàn)選取具有較高消化酶活性的單株芽孢桿菌YL-10和具有最好穩(wěn)定性的多株混合芽孢桿菌Tm3進(jìn)行對(duì)蝦養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)以研究芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦生長(zhǎng)、消化酶活性和消化道胞外酶組成的影響。

表3 添加單株芽孢桿菌YL-10與多株混合芽孢桿菌發(fā)酵液Tm3對(duì)凡納濱對(duì)蝦肝胰腺胞外酶活性的影響Table 3 Enzyme analysis of L.vannamei fed with single Bacillus culture(YL-10)and mixed Bacillus culture(Tm3)by using API zym Kit /U·mL-1

注：1.各組對(duì)蝦消化道內(nèi)均未檢測(cè)到：類(lèi)脂酶(C14)、胱氨酸芳胺酶和胰凝乳蛋白酶。2.陰性反應(yīng)：0；陽(yáng)性反應(yīng)：1～5。

Note:1.Negative results were obtained with:Lipase(C14),Cystine arylamidase and α-chymotrypsin.2.0=negative reaction;1～5=positive reaction.

實(shí)驗(yàn)采用API zym系統(tǒng)測(cè)定單株芽孢桿菌發(fā)酵液和多株混合芽孢桿菌發(fā)酵液中胞外酶的產(chǎn)生情況，以進(jìn)一步研究芽孢桿菌的產(chǎn)酶特性。胞外酶譜顯示單株芽孢桿菌胞外酶產(chǎn)生存在一定的同源性，四株芽孢桿菌均能產(chǎn)生酯酶(C4)、類(lèi)脂酯酶(C8)和萘酚-AS-BI-磷酸水解酶，且酶活性相差不大(半定量數(shù)值為2或3)，這與Pane等[18]采用API zym系統(tǒng)測(cè)定的五株芽孢桿菌胞外酶產(chǎn)生情況所得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。胞外酶譜亦顯示四株芽孢桿菌胞外酶產(chǎn)生存在一定的差別，如只在芽孢桿菌H1發(fā)酵液中檢測(cè)到β-葡萄糖醛酸酶，僅在YL-10發(fā)酵液中檢測(cè)到β-葡萄糖苷酶。比較單株芽孢桿菌與多株混合芽孢桿菌發(fā)酵液中胞外酶的組成，發(fā)現(xiàn)多株混合芽孢桿菌發(fā)酵液中胞外酶的種類(lèi)要高于單株芽孢桿菌。表明通過(guò)將不同芽孢桿菌發(fā)酵液混合，發(fā)酵液中各芽孢桿菌菌株產(chǎn)生的胞外酶互補(bǔ)，使得多株混合芽孢桿菌發(fā)酵液中能檢測(cè)到更多種類(lèi)的胞外酶和更為穩(wěn)定的胞外酶產(chǎn)生。

將單株芽孢桿菌YL-10和多株混合芽孢桿菌Tm3發(fā)酵液添加到飼料中飼喂凡納濱對(duì)蝦，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組對(duì)蝦的體重增加和特殊生長(zhǎng)率較對(duì)照組具有顯著提高，表明芽孢桿菌能夠提高對(duì)蝦的生長(zhǎng)性能。這與Wang YB[19]和丁賢等[10]的研究結(jié)果一致。芽孢桿菌的促生長(zhǎng)作用可能是由于芽孢桿菌進(jìn)入對(duì)蝦消化道后，在消化道內(nèi)增殖過(guò)程中能夠合成分泌消化酶，這些消化酶可以彌補(bǔ)對(duì)蝦內(nèi)源酶分泌量的不足，間接提高對(duì)蝦消化道內(nèi)消化酶的活性，即兩種不同來(lái)源的酶物質(zhì)的協(xié)同作用引起宿主腸道內(nèi)消化酶活性的疊加效應(yīng)，而消化酶是對(duì)蝦消化能力的體現(xiàn)，能夠參與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化利用[20]，提高飼料的利用率，進(jìn)而促進(jìn)對(duì)蝦的生長(zhǎng)。本實(shí)驗(yàn)中，養(yǎng)殖對(duì)蝦的生長(zhǎng)與消化道內(nèi)消化酶活性呈現(xiàn)較強(qiáng)的相關(guān)性；實(shí)驗(yàn)組Tm3對(duì)蝦肝胰腺中蛋白酶活性與脂肪酶活性較對(duì)照組顯著提高，實(shí)驗(yàn)組YL-10淀粉酶活性較對(duì)照組顯著提高。Ziaei-Nejad等[21]，Moriarty等[22]和丁賢等[10]的研究也取得了相似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。另一方面，芽孢桿菌作為活菌進(jìn)入對(duì)蝦體內(nèi)，能夠代謝產(chǎn)生對(duì)蝦生長(zhǎng)所需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如菌體蛋白、維生素和微量元素等，參與調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)成分在對(duì)蝦消化道內(nèi)的代謝過(guò)程，從而促進(jìn)對(duì)蝦生長(zhǎng)[10,20]。本實(shí)驗(yàn)中測(cè)定的是加入芽孢桿菌后對(duì)蝦肝胰腺內(nèi)消化酶酶活，對(duì)于芽孢桿菌分泌產(chǎn)生的消化酶的貢獻(xiàn)率以及通過(guò)免疫刺激等作用機(jī)制所產(chǎn)生的消化酶活性變化，還需要進(jìn)一步研究。實(shí)驗(yàn)組YL-10和實(shí)驗(yàn)組Tm3對(duì)蝦存活率較對(duì)照組均顯著提高，Zokaeifar等[17]用芽孢桿菌投喂凡納濱對(duì)蝦也取得了相似的結(jié)果，其可能的免疫刺激作用表現(xiàn)為消化道內(nèi)超氧化物歧化酶和溶菌酶等免疫酶的活力的提高。

為了進(jìn)一步研究芽孢桿菌對(duì)凡納濱對(duì)蝦胞外酶產(chǎn)生情況的影響，實(shí)驗(yàn)采用API zym系統(tǒng)測(cè)定對(duì)蝦肝胰腺內(nèi)胞外酶的產(chǎn)生情況。實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組對(duì)蝦消化道內(nèi)均能夠檢測(cè)到相同的16種胞外酶。其中，實(shí)驗(yàn)組YL-10對(duì)蝦肝胰腺中有10種胞外酶活性高于對(duì)照組，而實(shí)驗(yàn)組Tm3對(duì)蝦肝胰腺中有12種胞外酶活性高于對(duì)照組。因此，添加芽孢桿菌能夠提高凡納濱對(duì)蝦肝胰腺胞外酶的活性，并且多株混合芽孢桿菌對(duì)于凡納濱對(duì)蝦肝胰腺胞外酶的活性提高好于單株芽孢桿菌。研究結(jié)果為混合芽孢桿菌的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

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