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    喹烯酮與雞鴨血漿蛋白結(jié)合率的檢測?

    2018-01-18 05:49:12張瑞麗郝智慧曲少奇王遠(yuǎn)紅姜廷福呂志華
    關(guān)鍵詞:雞鴨烯酮透析液

    張瑞麗, 郝智慧, 曲少奇, 王遠(yuǎn)紅, 姜廷福, 呂志華? ?

    (1中國海洋大學(xué)醫(yī)藥學(xué)院海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003; 2 青島農(nóng)業(yè)大學(xué)化學(xué)與藥學(xué)院農(nóng)用生物藥物創(chuàng)制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,山東 青島 266003)

    喹烯酮(Quinocetone,QCT),是經(jīng)國家農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)的一類新獸藥,屬于喹噁啉-1,4-二氧化物類化合物[1]。喹烯酮在抗菌[2]、促進(jìn)動(dòng)物生長、控制動(dòng)物消化道疾病以及提高飼料利用率方面具有顯著的作用[3]。喹烯酮為中國在國際上首創(chuàng)的一類新獸藥,其在我國養(yǎng)殖業(yè)中作為飼料添加劑已被廣泛使用。臨床上喹烯酮在雞鴨上的應(yīng)用也很普遍, Miao X L等[4]研究表明,喹烯酮提高肉仔雞日增重和改善飼喂效率效果顯著;徐善金等[5]研究表明,喹烯酮能夠很好地促進(jìn)肉鴨的生長及屠宰性能;陳權(quán)軍等[6]的試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)喹烯酮在肉鴨增重及料肉比方面優(yōu)于同類藥物喹乙醇。

    血漿蛋白結(jié)合率反應(yīng)出藥物與血漿蛋白結(jié)合的情況[7],藥物血漿蛋白結(jié)合率對藥物在體內(nèi)的吸收、分布、代謝及消除有影響,因此了解藥物的血漿蛋白結(jié)合率是新藥研發(fā)中必要開展的項(xiàng)目[8]。目前報(bào)道的喹烯酮的血漿蛋白結(jié)合的數(shù)據(jù)只有喹烯酮與草魚[9]及三黃雞[10]的血漿蛋白結(jié)合率,喹烯酮與白羽肉雞、櫻桃谷肉鴨的血漿蛋白結(jié)合率未有研究。本研究采用平衡透析法測定喹烯酮與雞、鴨血漿蛋白結(jié)合率,為喹烯酮在雞、鴨的臨床用藥以及體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供指導(dǎo)。

    1 材料與方法

    1.1 藥品與主要試劑

    喹烯酮原料(含量98.6%,武漢拉那白醫(yī)藥化工有限公司);喹烯酮對照品(純度≥99%,德國Dr. Ehrenstorfer公司);乙腈(德國Merck公司,色譜純);甲酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,色譜純);三氯乙酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司,分析純),肝素鈉(效價(jià)150 μ/mg,北京博奧拓達(dá)科技有限公司,分析純),其它試劑為分析純。

    1.2 主要儀器

    Agilent1260型高效液相色譜儀(美國安捷倫科技有限公司,配備四元泵、脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、DAD檢測器等);臺式冷凍離心機(jī)(UNIVERSAL 320R,德國海蒂詩(Hettich)科學(xué)儀器公司);分析天平(AL204型,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司);迷你旋渦振蕩器(MS-3型,德國IKA集團(tuán)公司);透析袋(截留分子量8 000~14 000,Solarbio Life Sciences);超純水系統(tǒng)(Milli-QE型,美國MILLIPOR公司)。

    1.3 血漿的采集

    櫻桃谷肉鴨5只,體重1.5~2 kg,飼喂不含喹噁啉類藥物及其他抗生素的定制肉鴨飼料,試驗(yàn)前采血檢測確認(rèn)血漿中無喹噁啉類藥物的干擾。正常預(yù)飼一周,頸靜脈采血,分離血漿-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    健康白羽肉雞5只,體重1.5 kg左右,飼喂不含喹噁啉類藥物及其他抗生素的定制肉鴨飼料,試驗(yàn)前采血檢測確認(rèn)血漿中無喹噁啉類藥物的干擾。正常預(yù)飼一周,頸靜脈采血,分離血漿-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.4 溶液的配制

    喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)儲備液:準(zhǔn)確稱取喹烯酮對照品10 mg置10 mL棕色容量瓶中,加入1 mL的DMSO溶解后,用乙腈定容至刻度,配制成濃度為1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液, -20 ℃避光保存?zhèn)溆茫挥行?個(gè)月。

    空白透析液(PBS)的配制:準(zhǔn)確稱取磷酸氫二鉀7.06 g、磷酸二氫鉀1.29 g和氯化鈉0.995 g,加入超純水定容至500 mL(pH=7.4)。

    肝素鈉抗凝劑的配制:稱取肝素鈉1 g,加入100 mL超純水,超聲溶解。

    1.5 試驗(yàn)方法(平衡透析法)

    將透析袋剪成長度約7 cm的小段,一端用線扎緊,將1 mL空白血漿加入至透析袋中,扎緊袋口,將透析袋置于 100 mL聚乙烯塑料離心管(其中裝有25 mL的含藥溶液),調(diào)整透析袋位置,使其內(nèi)外液面保持在同一水平面,并避免透析袋緊貼于管壁,密封管口,于4 ℃冰箱直至藥物擴(kuò)散平衡,每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行。

    透析結(jié)束后,吸取一定量透析外液,加入10%三氯乙酸溶液,若析出白色絮狀沉淀,表明有血漿蛋白漏出,則該樣品作廢。無血漿蛋白漏出者,分別取透析袋內(nèi)外樣品,按照1.5項(xiàng)下方法處理,檢測透析袋內(nèi)外喹烯酮的濃度,計(jì)算血漿蛋白結(jié)合率;血漿蛋白結(jié)合率計(jì)算公式見(1)。

    (1)

    式中:(Dt為透析袋內(nèi)喹烯酮的濃度;Df為透析袋外喹烯酮的濃度

    1.6 樣品的前處理方法

    取透析平衡后的血漿0.5 mL于2 mL離心管中,加入1 mL乙腈,充分渦旋1 min, 4 ℃、12 000 r/min離心10 min,取上清液,殘?jiān)靡译嬷貜?fù)萃取3次,合并上清液, 50℃氮?dú)庀麓蹈桑?00μL乙腈復(fù)溶后過0.22μm的濾膜,進(jìn)行HPLC分析。

    取透析平衡后的外液0.5 mL,冷凍干燥后用500μL乙腈復(fù)溶后過0.22μm的濾膜,進(jìn)行HPLC分析。

    1.7 液相色譜條件

    色譜柱:InterSustain-C18(4.6×250 mm,5μm);流動(dòng)相:0.1%甲酸-乙腈(60:40),等度洗脫;流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃;檢測波長:314 nm;進(jìn)樣量:20μL。

    1.8 測定方法的考察

    1.8.1 專屬性 考察喹烯酮對照品色譜圖、空白透析液色譜圖、空白透析液加喹烯酮色譜圖、空白血漿樣品的色譜圖、空白血漿樣品加喹烯酮色譜圖,血漿及透析液中所含的雜質(zhì)應(yīng)不干擾喹烯酮的檢測。

    1.8.2 檢測限及定量限 分別在空白透析液及雞、鴨血漿中添加系列濃度喹烯酮對照品溶液依次進(jìn)樣檢測,以信噪比S/N=3時(shí)的喹烯酮濃度定為檢測限,S/N=10時(shí)的喹烯酮濃度定為定量限。

    1.8.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 取雞、鴨血漿和空白透析液各450μL,分別加入3、5、10、20、50和100μg/mL喹烯酮對照品溶液各50μL,使得樣品中喹烯酮終濃度為0.3、0.5、1、2、5和10μg/mL,渦旋1 min混勻,按照1.6項(xiàng)下方法處理,進(jìn)HPLC分析。記錄色譜圖和喹烯酮的峰面積,將喹烯酮的峰面積與其濃度作線性回歸,得出標(biāo)準(zhǔn)曲線及相關(guān)系數(shù)。

    1.8.4 回收率 取雞、鴨血漿和空白透析液各450μL,分別加入3、10和20μg/mL喹烯酮對照品溶液50μL,使得樣品中喹烯酮終濃度為0.3、1和2μg/mL,渦旋1 min混勻,按照1.6項(xiàng)下方法處理,進(jìn)HPLC分析,每個(gè)濃度制備5個(gè)平行樣品。根據(jù)峰面積計(jì)算出喹烯酮的濃度并與喹烯酮添加濃度相比,計(jì)算回收率。

    1.8.5 精密度及準(zhǔn)確度 日內(nèi)精密度:在同一天內(nèi),按照1.8.4項(xiàng)下方法制備低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品,每個(gè)濃度制備5個(gè)平行樣品,測定低、中、高濃度的質(zhì)控樣品間的RSD。

    日間精密度:在連續(xù)3天內(nèi)按照1.8.4項(xiàng)下方法,每天連續(xù)制備1個(gè)分析批次的低、中、高濃度的質(zhì)控樣品,測定低、中、高濃度的質(zhì)控樣品間的RSD,一般RSD應(yīng)小于15%。

    1.8.6 穩(wěn)定性 按照1.8.4項(xiàng)下方法配制低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品,分別在4、25和37 ℃放置36 h,按照1.6項(xiàng)下方法處理,進(jìn)HPLC分析,根據(jù)峰面積計(jì)算喹烯酮的濃度,考察喹烯酮在鴨血漿中的穩(wěn)定性。

    1.9 平衡透析時(shí)間的考察

    取1 mL空白透析液加入到透析袋中,扎緊袋口,將透析袋置于盛有20 mL含喹烯酮濃度為0.5μg/mL的PBS溶液中,按照1.6項(xiàng)下操作,分別于2、4、12、24、36、48、60和72 h結(jié)束試驗(yàn),測定透析袋內(nèi)外的QCT濃度,以透析袋內(nèi)外QCT濃度的比值對時(shí)間作圖,當(dāng)QCT濃度比隨時(shí)間延長而基本不變時(shí)表明透析達(dá)到平衡。

    1.10 透析膜對藥物的吸附作用

    取1 mL空白透析液加入透析袋中(V1),將透析袋放入裝有20 mL (V2)藥物濃度為0.5μg/mL (Co)的透析液的離心管中,放入4 ℃恒溫培養(yǎng)箱,藥物擴(kuò)散平衡后,測定透析袋外的喹烯酮的濃度(C1),按照公式(2)計(jì)算透析袋對喹烯酮的吸附率。

    X=[ Co×V2- C1×( V1+ V2)]/ Co×V2×100%。

    (2)

    1.11 藥物濃度對結(jié)合率的影響

    分別取1 mL的空白雞鴨血漿若干份加入透析袋中,每份分別置于20 mL含喹烯酮濃度為0.5、1、2、4和8μg/mL透析液中,于4 ℃冰箱靜置36 h直至藥物擴(kuò)散平衡。測定袋內(nèi)血漿中喹烯酮濃度及袋外緩沖液中喹烯酮濃度,按照公式(1)計(jì)算喹烯酮血漿蛋白結(jié)合率。

    2 結(jié)果

    2.1 測定方法的考察

    2.1.1 方法的專屬性 圖1為QCT對照品溶液HPLC圖。由圖可知,喹烯酮在該液相色譜圖條件下保留時(shí)間為4.9 min,色譜圖的系統(tǒng)適用性良好。由圖2~4可以看出,透析液和血漿中的雜質(zhì)均在3 min以前出峰,雜質(zhì)峰不干擾QCT的檢測,方法的專屬性良好。

    圖1 喹烯酮對照品溶液HPLC色譜圖Fig.1 Chromotogram of QCT standard solution

    圖2 空白透析液(A)和加標(biāo)透析液(B)HPLC色譜圖Fig.2 Chromotograms of QCT in PBS solution

    圖3 空白鴨血漿(A)和加標(biāo)鴨血漿(B)HPLC色譜圖Fig.3 Chromotograms of QCT in duck plasma

    圖4 空白雞血漿(A)和加標(biāo)雞血漿(B)HPLC色譜圖Fig.4 Chromotograms of QCT in chicken plasma

    2.1.2 檢測限及定量限 試驗(yàn)可知,QCT在血漿和透析液中的檢測限為0.1μg/mL,定量限為0.3μg/mL。

    2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線 QCT在雞、鴨血漿和透析液中的標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1,結(jié)果表明QCT在PBS緩沖液、雞鴨血漿中線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)在0.999 5以上。

    表1 QCT標(biāo)準(zhǔn)工作曲線Table1 Standard curve of QCT

    2.1.4 回收率和精密度 經(jīng)測定,PBS溶液及雞、鴨血漿樣品中的QCT的回收率和精密度見表2。高、中、低濃度的樣品平均回收率均能達(dá)到85%以上。日內(nèi)、日間精密度的RSD值均小于5%。表明方法的精密度和準(zhǔn)確度良好。

    表2 QCT在雞鴨血漿及PBS中的回收率及精密度

    2.1.5 穩(wěn)定性 從表3可知,低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品,在4 、25和37 ℃放置36 h,損失率小于5.0%,RSD均小于3.5%,結(jié)果表明,鴨血漿中喹烯酮在上述條件下36 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

    表3 鴨血漿中QCT的穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

    2.2 透析平衡時(shí)間

    以透析袋內(nèi)外QCT濃度比時(shí)間作圖,結(jié)果見圖5,QCT平衡時(shí)間約需36 h。

    圖5 QCT平衡透析時(shí)間Fig.5 Equilibration time of QCT

    2.3 透析膜對藥物的吸附作用

    結(jié)果表明,低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度下吸附率的結(jié)果分別為1.31%、1.46%、0.95 %,透析膜對喹烯酮有少量吸附,但對喹烯酮的檢測沒有顯著影響。

    2.4 藥物濃度與血漿蛋白結(jié)合率

    考察了不同濃度喹烯酮與雞、鴨血漿的蛋白結(jié)合率,結(jié)果見表4。喹烯酮與雞鴨血漿蛋白結(jié)合率平均分別為40.53%±1.09%和46.88%±1.25%,不同濃度的喹烯酮與雞鴨血漿蛋白結(jié)合率經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行方差分析。結(jié)果表明,不同濃度的喹烯酮血漿蛋白結(jié)合率不存在顯著性差異(P>0.05),蛋白結(jié)合呈現(xiàn)非濃度依賴的特性。但雞、鴨之間的喹烯酮的血漿蛋白結(jié)合率經(jīng)SPSS軟件進(jìn)行方差分析,存在顯著性差異(P<0.05),表明喹烯酮血漿蛋白結(jié)合率在不同動(dòng)物種屬間存在差異。

    表4 不同濃度喹烯酮在雞、鴨血漿中的蛋白結(jié)合率(Mean±SD)(n=3)Table 4 Protein binding rate of QCT in duck and chicken plasma(n=3)

    3 討論

    藥物血漿蛋白結(jié)合率的測定是新藥研究開發(fā)中必要的項(xiàng)目。目前,血漿蛋白結(jié)合率的常見的測定方法有平衡透析法、超濾法、微透析法、超速離心法[8]。雖然測定血漿蛋白結(jié)合率的新方法不斷出現(xiàn),但平衡透析法可以最大限度反映體內(nèi)情況[11],結(jié)果可靠,目前仍是一種使用頻繁的經(jīng)典參比方法[11]。本試驗(yàn)參考已有文獻(xiàn)中的喹烯酮檢測方法[13-14],建立了檢測雞鴨血漿以及PBS溶液中喹烯酮的HPLC方法,喹烯酮在PBS溶液中的平均回收率高于90%,在血漿中的平均回收率高于86%;上述介質(zhì)中的回收率高于已有文獻(xiàn)報(bào)道[9],且建立方法的重復(fù)性和精密度良好。

    采用建立的HPLC方法結(jié)合平衡透析法測定了喹烯酮在雞鴨血漿中的蛋白結(jié)合率,喹烯酮平均蛋白結(jié)合率在40%~50%之間,屬于中等蛋白結(jié)合藥物,且在實(shí)驗(yàn)檢測濃度范圍內(nèi),喹烯酮與蛋白結(jié)合呈現(xiàn)非濃度依賴的特點(diǎn)。目前報(bào)道的喹烯酮與草魚血漿蛋白結(jié)合率平均為80.5%[9],喹烯酮與三黃雞血漿蛋白結(jié)合率平均為51.6%[10],均高于喹烯酮與白羽肉雞、櫻桃谷肉鴨的血漿蛋白結(jié)合率,喹烯酮的血漿蛋白結(jié)合率在不同動(dòng)物種屬間存在一定的差異,因此在臨床用藥時(shí)需考慮動(dòng)物種屬及其血漿蛋白結(jié)合率的情況合理用藥。喹烯酮在草魚中應(yīng)用時(shí)較易發(fā)生血漿蛋白結(jié)合介導(dǎo)的藥物相互作用,進(jìn)而導(dǎo)致毒性反應(yīng);而在雞鴨中應(yīng)用時(shí)喹烯酮藥物時(shí)出現(xiàn)上述相互作用的概率較低。喹烯酮與雞鴨血漿蛋白結(jié)合的測定結(jié)果表明喹烯酮大部分以游離形式發(fā)揮作用,且不具有濃度依賴性,它可以更有效地穿過細(xì)胞膜達(dá)到機(jī)體作用部位,且游離型藥物能通過腎小管排泄出體外,因此喹烯酮在雞鴨中用藥的安全性較高。本文的研究結(jié)果對喹烯酮在雞、鴨的臨床聯(lián)合用藥以及體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供參考依據(jù)。

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