硬骨魚(yú)腦芳香化酶的表達(dá)調(diào)節(jié)、功能推測(cè)以及類(lèi)固醇合成酶的研究進(jìn)展

相福生 ，黃天晴 ，谷偉 ，王炳謙 ，胡朝 ，徐革鋒

（1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黑龍江水產(chǎn)研究所，黑龍江 哈爾濱 150070;2.上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，上海 201306;3.四川省都江堰管理局，四川 都江堰 611830）

芳香化酶（aromatase,Cyp19）是細(xì)胞色素P450酶系中一種雌激素生物合成的限速酶。它能夠催化雄烯二酮、睪酮脫去19位碳，使A環(huán)芳構(gòu)化，分別形成雌二醇（E2）和雌酮。芳香化酶分為腦芳香化酶（Cyp19a1b）和性腺芳香化酶（Cyp19a1a）分別在腦和性腺中表達(dá)。芳香化酶只能催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素，該過(guò)程不可逆。雌激素是公認(rèn)的與生殖發(fā)育密切相關(guān)的關(guān)鍵調(diào)控因子。最初認(rèn)為雌激素只由性腺產(chǎn)生，后來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，它能夠在其它組織中產(chǎn)生，這是因?yàn)榉枷慊富蚰茉谛韵僖酝獾慕M織中表達(dá)；芳香化酶對(duì)許多E2靶組織的發(fā)育和功能具有重要調(diào)節(jié)作用，尤其是大腦。

早在20世紀(jì)相關(guān)研究就指出魚(yú)類(lèi)產(chǎn)前類(lèi)固醇[1]對(duì)腦組織的影響，能夠調(diào)控成魚(yú)對(duì)性類(lèi)固醇的生理響應(yīng)。這個(gè)重大研究結(jié)果具有深遠(yuǎn)的影響，最終催生了“芳香化假說(shuō)”，而該假說(shuō)正是依據(jù)睪酮來(lái)源于胚胎睪丸，并在腦中特定區(qū)域產(chǎn)生不可逆性芳香化[2]的結(jié)果提出。現(xiàn)在普遍認(rèn)為，雖然雌激素在腦中產(chǎn)生，并具有多元性功能，但其中部分功能未必與繁殖有關(guān)。

腦芳香化酶見(jiàn)于所有脊椎動(dòng)物中，在硬骨魚(yú)類(lèi)[3,4]中輻鰭魚(yú)綱占非常大的數(shù)量（近3 000種）。硬骨魚(yú)的腦芳香化酶的功能和作用較為特殊，本文綜述了硬骨魚(yú)腦芳香化酶的活性、表達(dá)、調(diào)節(jié)和功能[3,5]。

1 魚(yú)腦中芳香化酶活性

1.1 硬骨魚(yú)中芳香化酶活性較高

1978年，Callard G等[6]首次揭示了芳香化酶和5α還原酶的活性。之后，在金魚(yú)Carassius auratus和蟾魚(yú)Opsanus tau的研究中發(fā)現(xiàn)，用[3H]-雄烯二酮孵化的腦勻漿產(chǎn)生了大量特殊雌激素，芳香化酶活性在垂體和部分前腦區(qū)域特別高，尤其在下丘腦和視前葉區(qū)[7]。芳香化酶在魚(yú)類(lèi)神經(jīng)內(nèi)分泌組織中同樣具有高表達(dá)特性。

1.2 腦芳香化酶活性的分布

用顯微解剖或穿孔技術(shù)研究大腦芳香化酶活性分布發(fā)現(xiàn)[8,9]，三刺魚(yú)Gasterosteus aculeatus間腦中芳香化酶的活性最高，尤其是在下丘腦室周區(qū)域，包括視束前核結(jié)節(jié)外側(cè)核和垂體[8]。而非洲鲇Clarias gariepinu大腦視前區(qū)的芳香化酶活性最高，下丘腦腹側(cè)包括結(jié)節(jié)外側(cè)核和隱窩外側(cè)核的活性較低。同樣，歐洲海鱸Dicentrarchus labrax嗅球、中腦和下丘腦中的芳香化酶活性與腦垂體的接近，而視頂蓋、小腦和髓質(zhì)的活性較低[10]。

1.3 芳香化酶活性的季節(jié)變化

對(duì)金魚(yú)繁殖周期中芳香化酶活性自然變化的研究發(fā)現(xiàn)，性類(lèi)固醇能夠調(diào)節(jié)芳香化酶活性，4月、5月雌魚(yú)下丘腦前區(qū)/視前區(qū)達(dá)到高峰，是非繁殖期的6倍，而垂體的芳香化酶活性與繁殖周期無(wú)關(guān)[11]。在大西洋鮭Salmo salar、三刺魚(yú)Gasterosteus aculeatus和歐洲海鱸中也發(fā)現(xiàn)，類(lèi)固醇與芳香化酶活性強(qiáng)度密切相關(guān)，特別是睪酮和芳香化酶活性之間的關(guān)系尤為密切[12]。

研究還發(fā)現(xiàn)，繁殖期歐洲海鱸腦芳香化酶的活性變化顯著，最大值出現(xiàn)在產(chǎn)卵季節(jié)，而腦芳香化酶活性在血清睪酮濃度和性腺指數(shù)達(dá)到最大時(shí)的前1～2個(gè)月達(dá)到高峰[11]。4月產(chǎn)卵前斜齒鳊Rutilus rutilus Cyp19a1b mRNA的表達(dá)量最高，產(chǎn)卵之后迅速下降，5月水平最低，7月腦垂體中Cyp19a1b的表達(dá)顯著增加，此時(shí)正值其性腺再次發(fā)育，8月進(jìn)一步增加；而雄激素受體mRNA的表達(dá)也在8月最大，但esr1、esr2a以及esr2b沒(méi)有明顯的季節(jié)變化[12]。

2 硬骨魚(yú)類(lèi)的兩種芳香化酶基因

2.1 魚(yú)類(lèi)的兩種Cyp19a1基因和兩種P450芳香化酶蛋白

第三輪全基因組復(fù)制硬骨魚(yú)譜系中顯示出基因組結(jié)構(gòu)的巨大變化[13]，這被稱(chēng)為“3R復(fù)制”。魚(yú)類(lèi)存在許多復(fù)制基因，這些基因變化巨大。許多硬骨魚(yú)中存在兩個(gè)芳香化酶基因Cyp19a1a和Cyp19a1b，這與3R復(fù)制學(xué)說(shuō)相吻合。

目前，硬骨魚(yú)的這兩個(gè)基因被統(tǒng)一命名為Cyp19a1a（卵巢芳香化酶）和Cyp19a1b（腦芳香化酶）。它們生成兩種結(jié)構(gòu)和功能不同的亞型，大部分各自在卵巢和腦中表達(dá)。這兩個(gè)基因存在于許多種類(lèi)中，包括虹鱒Oncorhynchus mykiss、斑馬魚(yú)Danio rerio、尼羅羅非魚(yú)Oreochromis niloticus、歐洲海鱸、細(xì)棘海豬魚(yú)Halichoeres tenuispinis、底鳉Fundulus heteroclitus、點(diǎn)帶石斑魚(yú)Epinephelus coioides和黃鱔Monopterus albus。然而，目前在歐洲鰻鱺Anguilla anguilla和日本鰻鱺Anguilla japonica中只找到一個(gè)基因，這個(gè)基因在性腺和腦中都有表達(dá)，其表達(dá)受不同啟動(dòng)子調(diào)控[14,15]。

2.2 Cyp19a1a和Cyp19a1b的特性差異

由于芳香化酶活性的研究是在這兩種基因被發(fā)現(xiàn)之前，因此這兩種基因間的比對(duì)資料甚少。但在對(duì)金魚(yú)與中國(guó)倉(cāng)鼠Cricetulus barabensis Pallas的腦型和卵巢型芳香化酶性能比較研究發(fā)現(xiàn)，盡管雄烯二酮和睪酮的Km值相近，分別為2.5nM和1.1nM，但腦型Vm值比卵巢型要高。用β[3H]-雄烯二酮氚化水技術(shù)分析表明，水溫10～30℃時(shí)，海鱸勻漿和微粒體中芳香化酶活性呈線性變化。產(chǎn)卵期海鱸腦和卵巢勻漿的Km值分別為7.3nM和4.6nM，兩者差異不明顯，最大反應(yīng)速率是卵巢的4倍，與微粒體分析結(jié)果一致。由此得出，海鱸和金魚(yú)一樣，芳香化酶對(duì)雄烯二酮的親和力較高，比其他魚(yú)類(lèi)和哺乳類(lèi)高。

3 魚(yú)腦中芳香化酶的表達(dá)

3.1 魚(yú)腦中Cyp19a1b的表達(dá)

使用芳香化酶抗體技術(shù)首次確定了金魚(yú)Cyp19a1b的表達(dá)細(xì)胞。此研究在與繁殖有關(guān)的控制區(qū)域（視前區(qū)、下丘腦）對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)標(biāo)記的細(xì)胞具有神經(jīng)元外表[16]。然而只有少數(shù)的芳香化酶免疫活性細(xì)胞被標(biāo)記，這與在金魚(yú)腦中較高的芳香化酶活性和轉(zhuǎn)錄水平的研究結(jié)果不同。大量研究表明，芳香化酶B免疫活性細(xì)胞存在于后腦、中腦、間腦和前腦，廣泛分布于室周區(qū)域，尤其沿著下丘腦的第三腦室、視前區(qū)的視周層嗅球腹面中側(cè)、腹側(cè)核和端腦半球外緣較為豐富[15]。Forlano等[17]的研究還發(fā)現(xiàn)，芳香化酶B在特有的細(xì)胞中表達(dá)，如放射性膠質(zhì)細(xì)胞。

原位雜交結(jié)果表明，虹鱒Cyp19a1b在前腦的視周層、端腦、間腦和中腦表達(dá)較高，在某種程度上與珍蟾魚(yú)Porichthys notatus相似，下丘腦、視前區(qū)和腦垂體雜交信號(hào)較強(qiáng)[17]，而在視周層的半規(guī)隆凸、視頂蓋和第四腦室的雜交信號(hào)較弱。用芳香化酶B檢測(cè)抗體法發(fā)現(xiàn)，虹鱒垂體腦葉和細(xì)胞邊緣端腦腦室以及間腦腹側(cè)有豐富的芳香化酶B免疫活性細(xì)胞，在視前區(qū)和下丘腦表達(dá)較高[18]。

原位雜交、免疫組化和GFP（綠色熒光蛋白）研究表明，斑馬魚(yú)腦中芳香化酶的分布與Cyp19a1b在放射性膠質(zhì)細(xì)胞中的結(jié)果一致。斑馬魚(yú)腦芳香化酶mRNA的這種表達(dá)模式與珍蟾魚(yú)一致，Cyp19a1b在視周層、近端嗅球的腦實(shí)質(zhì)、腹側(cè)端腦、視前區(qū)、下丘腦和垂體的前葉和后葉中都有轉(zhuǎn)錄[19]。

3.2 Cyp19a1b蛋白主要在放射性膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)

魚(yú)類(lèi)的腦芳香化酶位于放射性膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，而鳥(niǎo)類(lèi)和哺乳類(lèi)的則主要在神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)[20,21]。哺乳類(lèi)的放射性膠質(zhì)細(xì)胞在胚胎形成后消失，但隨著小鼠的不斷發(fā)育，在其皮層的放射性膠質(zhì)細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了芳香化酶[22]。鳥(niǎo)類(lèi)的放射性膠質(zhì)細(xì)胞存在于成體腦的許多部分，它們通常不表達(dá)芳香化酶，但在受損的斑胸草雀Poephila guttata皮層中檢測(cè)到了芳香化酶免疫活性，而在其身體的相關(guān)部位卻沒(méi)有出現(xiàn)[23]。魚(yú)類(lèi)的腦芳香化酶幾乎只在放射性膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)，這說(shuō)明此細(xì)胞作為硬骨魚(yú)中的祖細(xì)胞很可能參與神經(jīng)形成[24]。

4 魚(yú)腦中Cyp19a1b表達(dá)的調(diào)節(jié)

4.1 Cyp19a1b啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)

Yang Zhang 等發(fā)現(xiàn)[25]，黃鱔 Monopterus albus中存在兩種組織特異性啟動(dòng)子I和II，分別影響腦和垂體。啟動(dòng)子I包含一個(gè)非識(shí)別雌激素反應(yīng)元件（ERE），不能對(duì)E2產(chǎn)生響應(yīng)；啟動(dòng)子II包含一個(gè)雄激素反應(yīng)元件（ARE），能夠?qū)?DHT（Dihydrotestosterone，二氫睪酮）產(chǎn)生響應(yīng)。因此，雌激素?zé)o法上調(diào)黃鱔下丘腦和垂體中Cyp19a1b的表達(dá)，而雄激素也僅在腦垂體中上調(diào)Cyp19a1b的表達(dá)。由于啟動(dòng)子的細(xì)胞特異性，在啟動(dòng)子水平上研究Cyp19a1b基因調(diào)節(jié)的實(shí)驗(yàn)較少。盡管斑馬魚(yú)體內(nèi)Cyp19a1b基因在放射性膠質(zhì)細(xì)胞中高度特異性表達(dá)，但在體外神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中同樣能表達(dá)[26]。

其他硬骨魚(yú)如點(diǎn)帶石斑魚(yú)Epinephelus coioides的Cyp19a1b基因近端區(qū)域包含一個(gè)保守的結(jié)合位點(diǎn)，用于與雌激素反應(yīng)組件ERE結(jié)合。Stat1（信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活1 signal transducer and activator of transcription 1）和Rfx（X蛋白調(diào)節(jié)因子regulatory factor X protein）在近端啟動(dòng)子區(qū)域同樣高度保守，這說(shuō)明它們調(diào)節(jié)硬骨魚(yú)Cyp19a1b的表達(dá)同樣保守。斑馬魚(yú)中E2介導(dǎo)ERE來(lái)上調(diào)Cyp19a1b轉(zhuǎn)錄活性，可能存在一個(gè)能夠自動(dòng)調(diào)節(jié)的正反饋途徑，調(diào)節(jié)腦芳香化酶的高表達(dá)。

4.1.1 類(lèi)固醇激素對(duì)Cyp19a1b的調(diào)節(jié)

在雌激素受體存在的情況下，多數(shù)細(xì)胞系的Cyp19a1b熒光素酶無(wú)法被E2所激活，說(shuō)明E2對(duì)Cyp19a1b的調(diào)節(jié)取決于細(xì)胞環(huán)境。如黃鱔腦和垂體中Cyp19a1b的表達(dá)受組織特異性啟動(dòng)子的調(diào)控，但體外環(huán)境中E2對(duì)腦特異性Cyp19a1b啟動(dòng)子的活性沒(méi)有影響，也就不能刺激Cyp19a1b的表達(dá)。這說(shuō)明除E2外可能還存在其他調(diào)節(jié)硬骨魚(yú)腦Cyp19a1b表達(dá)的因子[27]。Joel Cano-Nicolau等發(fā)現(xiàn)，雌激素依賴(lài)型Cyp19a1b基因的上調(diào)必須在功能性雌激素受體ERs和神經(jīng)膠質(zhì)X因子的存在下才能奏效[28]。

斑馬魚(yú)和鯰的雄激素通過(guò)雌激素受體將其轉(zhuǎn)化成雌激素來(lái)上調(diào)Cyp19a1b的表達(dá)。Cyp 19a1b基因在體內(nèi)同樣受某些雄激素的調(diào)節(jié)，尤其是睪酮（T）。黃鱔Cyp19a1b的腦垂體特異性啟動(dòng)子包含一個(gè)ARE組件，該組件能通過(guò)雄激素直接刺激Cyp19a1b的表達(dá)。因此，硬骨魚(yú)類(lèi)固醇上調(diào)垂體Cyp19a1b的表達(dá)至少存在兩種形式：一是黃鱔中的雄激素正反饋調(diào)節(jié)，另一種是其他硬骨魚(yú)中的雌激素正反饋調(diào)節(jié)[27]。盡管雄激素反應(yīng)元件（ARE）參與調(diào)節(jié)Cyp19ab的表達(dá)，但轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)說(shuō)明，雄激素受體或ARE都不是刺激Cyp19a1b表達(dá)的必要條件。事實(shí)上，最近的研究顯示，雄性化受位于-348bp上的ER與ERE的結(jié)合介導(dǎo)。睪酮通過(guò)自身的芳香化轉(zhuǎn)化成E2影響ER，而DHT則通過(guò)自身代謝轉(zhuǎn)化成5α-androstan-3β,17β-diol，直接影響和激活 ERs[28]。哺乳類(lèi)中DHT能夠變?yōu)?α-雄甾烷-3α-17β-二醇或5α-雄烷二醇中的任何一種[29]。雄魚(yú)的主要雄激素11-睪酮不可能轉(zhuǎn)化成雌激素類(lèi)化合物，也就不能在體內(nèi)或體外上調(diào)Cyp19a1b啟動(dòng)子活性[28]。這就解釋了為什么體內(nèi)或體外T和DHT不可能通過(guò)純抗雌激素ICI的方式上調(diào)Cyp19a1b[29]。

4.1.2 放射性膠質(zhì)細(xì)胞中Cyp19a1b表達(dá)的細(xì)胞特異性控制

通過(guò)ER調(diào)節(jié)，Cyp19a1b的表達(dá)局限于放射性膠質(zhì)細(xì)胞，在腦實(shí)質(zhì)的神經(jīng)細(xì)胞中腦芳香化酶都不表達(dá)[30]。存在雌激素時(shí)，ER不能有效調(diào)控魚(yú)腦中Cyp19a1b的表達(dá)。斑馬魚(yú)Cyp19a1b啟動(dòng)子包含一個(gè)復(fù)雜的調(diào)節(jié)組件，位于起始位點(diǎn)-277和-257之間。其序列有20個(gè)堿基，被稱(chēng)為GxRE，在細(xì)胞特異性和Cyp19a1b基因的E2調(diào)節(jié)中起重要作用[31]。敲除GxRE序列或其突變會(huì)造成E2-依賴(lài)型基因誘導(dǎo)率減少80%，說(shuō)明ERE的必要性，但是，并不能有效地調(diào)節(jié)神經(jīng)膠質(zhì)環(huán)境中的雌激素來(lái)激活Cyp19a1b。這同樣說(shuō)明GxRE可啟用特異性轉(zhuǎn)錄因子，與ERs協(xié)同作用。在ER和其他核受體或轉(zhuǎn)錄因子之間存在相關(guān)聯(lián)的因子（cross-talk）[32]。ER和其他轉(zhuǎn)錄因子之間的cross-talk的共同特性是能夠影響ER結(jié)構(gòu)，決定ER亞型。GxRE和ER協(xié)同增強(qiáng)了特異性ER亞型或ER-磷酸化位點(diǎn)的E2刺激獨(dú)立性。重要的是，GxRE能夠作為自發(fā)的順式元件，在膠質(zhì)細(xì)胞環(huán)境中提高E2的刺激性[31]。與之相對(duì)，在非膠質(zhì)細(xì)胞系中加入GxRE不能增強(qiáng)ERE-reporter基因的作用。如果在誘導(dǎo)期間GxRE區(qū)域啟用轉(zhuǎn)錄因子能夠與E2-依賴(lài)型的ER共同作用，這與膠質(zhì)細(xì)胞特異性因子類(lèi)似。為測(cè)試這種假說(shuō)，用凝膠遷移分析法，將GxRE作為探針和不同細(xì)胞系提取物進(jìn)行試驗(yàn)。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，DNA邊界轉(zhuǎn)錄因子能夠與ER共同調(diào)節(jié)Cyp19a1b基因。GxRE包含的核心序列AGGTCA能夠啟用不同類(lèi)型的核受體，肝臟受體同系物1（LRH-1）和孤兒核受體能夠介導(dǎo)睪丸中包含AGGTCA序列的Cyp19a1的表達(dá)[33]。

4.2 發(fā)育期間的Cyp19a1b的早期表達(dá)

Callard G V等[34]研究發(fā)現(xiàn)，斑馬魚(yú)的未受精卵Cyp19a1a和Cyp19a1b基因即開(kāi)始轉(zhuǎn)錄，但是從受精后1.5h（hpf）到12hpf（原腸胚）Cyp19a1b的轉(zhuǎn)錄一直降低，這可能是由于母本mRNA的轉(zhuǎn)移和退化所致。斑馬魚(yú)受精卵3h開(kāi)始轉(zhuǎn)錄芳香化酶，細(xì)胞分裂期（12～24hpf）開(kāi)始緩慢增加；之后，在 24～48hpf Cyp19a1b mRNA快速增加，直至累積到120hpf[34]。受精后20d（dpf）左右性腺尚未分化，此時(shí)Cyp19a1b的表達(dá)分成兩個(gè)部分，這說(shuō)明其表達(dá)與性腺分化相關(guān)。30～50dpf性腺分化期間，腦芳香化酶的表達(dá)與性腺芳香化酶不存在相關(guān)性[35]。需要指出的是，其他研究已經(jīng)證實(shí)雙峰模式的存在，但除青鳉屬和斑馬魚(yú)外的大多數(shù)魚(yú)類(lèi)[36]沒(méi)有已知的性別決定基因，所以不可能知道雙峰群體是否與雌性和雄性相符。Denise Vizziano-Cantonnet等[37]研究發(fā)現(xiàn)，在 35dpf時(shí)，虹鱒性腺未分化，雄性Cyp19a1b mRNA水平比雌性高，這種差異在50dpf后消失。

斑馬魚(yú)發(fā)育早期，雌激素受體和Cyp19a1b的表達(dá)存在時(shí)空關(guān)系。原位雜交和RT-PCR技術(shù)研究顯示，在24～48hpf斑馬魚(yú)雌激素受體esr1、esr2a,和esr2b的表達(dá)顯著性增加，這與Cyp19a1b基因的結(jié)果一致。這可能是胚胎暴露于純抗雌激素ICI 182 780下導(dǎo)致24～120hpf之間的Cyp19a1b的表達(dá)顯著下降。在視前區(qū)和下丘腦（24～48hpf時(shí)Cyp19a1b mRNA首次出現(xiàn)的區(qū)域），雌激素受體esr2b和esr2a的表達(dá)存在空間相關(guān)性。功能性雌激素受體在24～48hpf之間早已出現(xiàn)，這是由于此階段胚胎暴露于雌激素或外來(lái)雌激素下，Cyp19a1b mRNA顯著增加，以及腦芳香化酶蛋白和Cyp19a1b-GFP在腦中的表達(dá)上調(diào)。

5 魚(yú)腦中芳香化酶表達(dá)的顯著性功能

Cyp19a1b在魚(yú)類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)僅限于放射性膠質(zhì)細(xì)胞，芳香化酶活性異常是由于雌激素（或芳香化雄激素）對(duì)Cyp19a1b基因的高效誘導(dǎo)產(chǎn)生。正因?yàn)槿绱?，雌激素（芳香化產(chǎn)物）刺激了該酶的表達(dá)?，F(xiàn)在仍未確認(rèn)的是，這些雌激素潛在的功能是否只在大腦局部產(chǎn)生，盡管膜介導(dǎo)受體現(xiàn)已應(yīng)用到esr1和esr2的基因組效應(yīng)，但這些膜介導(dǎo)效應(yīng)可能參與到GPR30、神經(jīng)遞質(zhì)受體等膜雌激素受體與生長(zhǎng)因子的相互作用，以及這些膜效應(yīng)在硬骨魚(yú)中的普遍性仍未得到全面證實(shí)。

5.1 芳香化酶在性別分化中的作用

一般認(rèn)為，芳香化酶是性腺分化的關(guān)鍵因子，上調(diào)Cyp19a1a是觸發(fā)和維持卵巢分化的必需條件，其下調(diào)是誘導(dǎo)睪丸分化的有效條件。腦芳香化酶在性別分化中也起作用。越來(lái)越多的研究表明，Cyp19a1b在早期發(fā)育和性腺、性別分化階段的表達(dá)呈性別二態(tài)型模式[38]。20日齡時(shí)，斑馬魚(yú)性別未分化，性腺組織的Cyp19a1b表達(dá)為雙峰模式，盡管發(fā)育后期逐漸消失，但是明確反映出性別二態(tài)性特征。高溫影響硬骨魚(yú)性別分化過(guò)程中的分子通路，進(jìn)而影響性別比例。銀漢魚(yú)Odontesthes bonariensis的性別由溫度決定，隨著水溫不斷提升雄性腦芳香化酶的表達(dá)提高。Li等[39]研究發(fā)現(xiàn)，高溫能夠顯著下調(diào)Cyp19a1a在尼羅羅非魚(yú)性腺中的表達(dá)。在黑鯛Acanthopagrus schlegeli中發(fā)現(xiàn)類(lèi)固醇合成酶包括腦芳香化酶是在60dpf時(shí)表達(dá)，離睪丸分化期較遠(yuǎn)。類(lèi)固醇合成酶表達(dá)量的增加說(shuō)明在腦的很多區(qū)域都存在雌二醇。這說(shuō)明黑鯛的腦芳香化酶對(duì)雄性性別分化有重要作用[40]。在虹鱒中也有類(lèi)似研究，性腺形態(tài)學(xué)分化之前雄性腦中神經(jīng)類(lèi)固醇含量較高。許多研究揭示，神經(jīng)類(lèi)固醇，尤其是神經(jīng)雌激素可能參與雄性腦分化。對(duì)歐洲海鱸的研究也發(fā)現(xiàn)，Cyp19a1b在雄性與雌性中的表達(dá)水平明顯不同。許多物種在生活史中改變性別，這種性別可塑性是一種進(jìn)化策略——?jiǎng)游锔淖冃詣e有助于繁殖[41]。這意味著如果性腺是雙向的，腦也必須顯示出兩性潛勢(shì)。哺乳動(dòng)物中在發(fā)育臨界期對(duì)睪丸進(jìn)行腦芳香化，致使其腦向雄性化發(fā)展，最終產(chǎn)生雄性化個(gè)體，而且不可逆。魚(yú)類(lèi)腦能夠調(diào)控雌雄異體物種的性別分化，但在后期發(fā)育中仍可借助激素誘導(dǎo)使其性別發(fā)生改變。Kobayashi等[42]認(rèn)為，腦兩性潛勢(shì)呈永久性，但用激素改變性別非常快。這是因?yàn)榧に啬軌蚣せ钜延械姆肿诱{(diào)控機(jī)制，這種改變的機(jī)制尚不清楚。然而，芳香化酶在放射性膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)始于魚(yú)腦，且受性類(lèi)固醇介導(dǎo)，為雄激素和雌激素調(diào)節(jié)神經(jīng)活性提供底物。

5.2 芳香化酶和性行為

改變芳香化酶活性能夠影響雄性性行為。雄激素或雌激素處理導(dǎo)致許多魚(yú)產(chǎn)生典型的雄性性行為，但其機(jī)制尚不清楚。type I雄性珍蟾魚(yú)通過(guò)聲音運(yùn)動(dòng)核控制魚(yú)鰾產(chǎn)生聲音吸引雌性進(jìn)入巢穴完成繁殖[17]。而type II雄性聲音運(yùn)動(dòng)核的芳香化酶mRNA水平比type I雄性和雌性高，不需要產(chǎn)生聲音來(lái)吸引雌性，而是直接攻入雌性巢穴完成受精。與這種運(yùn)動(dòng)核里的芳香化酶表達(dá)一樣，雌激素處理能夠快速改變聲音產(chǎn)生的時(shí)間。睪酮對(duì)雌性和typeII雄性的效應(yīng)一樣，而在雌性中的作用完全取決于睪酮在雌二醇中的快速芳香化[43]。

Moulik等[44]研究發(fā)現(xiàn)，許多硬骨魚(yú)在繁殖期間卵母細(xì)胞的發(fā)育和Cyp19a1b的表達(dá)量達(dá)最高水平，血清中E2水平也達(dá)到峰值，而野鯪Labeo rohita在整個(gè)繁殖期Cyp19a1b的表達(dá)水平?jīng)]有改變，這說(shuō)明野鯪腦中Cyp19a1b對(duì)發(fā)育、繁殖和行為的作用很小或者沒(méi)有作用，至少成體如此。

5.3 神經(jīng)發(fā)生中的芳香化酶和雌激素以及腦修復(fù)

雌激素能夠促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生、分化和遷移或提高繁殖能力。斑馬魚(yú)大腦皮質(zhì)的機(jī)械損傷導(dǎo)致芳香化酶在放射性膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)以應(yīng)對(duì)損傷；這種表達(dá)與損傷部位的細(xì)胞增殖密切相關(guān)[23]。進(jìn)一步研究顯示，雌激素直接參與應(yīng)對(duì)腦損傷，可能為其再生提供較好的環(huán)境以及保護(hù)新細(xì)胞。大鼠雌激素通過(guò)降低活性氧水平以及促進(jìn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（BDNF）和胰島素生長(zhǎng)因子（IGF-1）等與生長(zhǎng)有關(guān)因子的分泌來(lái)減少氧化損傷。但是，斑馬魚(yú)中的結(jié)果與此并不一致[45]。Diotel等[46]發(fā)現(xiàn)，抑制斑馬魚(yú)神經(jīng)發(fā)生的雌激素和雌激素受體的作用并不能影響其細(xì)胞增殖。

魚(yú)腦具有較強(qiáng)的損傷修復(fù)能力。如斑馬魚(yú)能修復(fù)神經(jīng)損傷、脊髓橫斷、光照損傷、刺傷或化學(xué)損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)[47]。放射性膠質(zhì)細(xì)胞的擴(kuò)增聚集在損傷部位說(shuō)明，此細(xì)胞能夠幫助新生的細(xì)胞遷移。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，芳香化酶具有很強(qiáng)的促進(jìn)損傷部位細(xì)胞增殖的作用。雌激素和芳香化酶在保護(hù)和修復(fù)神經(jīng)中具有重要作用，損傷部位的芳香化酶表達(dá)上調(diào)，而且能夠提高細(xì)胞增殖活性和加強(qiáng)腦修復(fù)。

6 斑馬魚(yú)腦中的神經(jīng)類(lèi)固醇的生物合成

魚(yú)腦是芳香化酶表達(dá)和發(fā)揮活性的主要部位[5]。哺乳類(lèi)的神經(jīng)甾體完全產(chǎn)生于腦內(nèi)的假說(shuō)促使科學(xué)家用孕烯醇酮和脫氫表雄酮（DHEA）的方法抑制雄性化或?qū)?shí)驗(yàn)動(dòng)物的腎上腺切除。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這兩種方法并不能改變腦內(nèi)某些類(lèi)固醇激素的水平。研究發(fā)現(xiàn)，腦部海馬體能合成雌二醇，這說(shuō)明類(lèi)固醇合成酶能夠在大腦中表達(dá)。鳥(niǎo)類(lèi)類(lèi)固醇合成酶同樣在腦發(fā)育期間的腦室區(qū)域表達(dá)[4]。

6.1 細(xì)胞色素P450側(cè)鏈裂解酶

類(lèi)固醇合成酶促反應(yīng)的第一步是將膽固醇前體轉(zhuǎn)化成C21-類(lèi)固醇、孕烯醇酮（△5p）。該反應(yīng)由細(xì)胞色素P450scc催化，是一種線粒體酶，由Cyp11a1基因編碼。P450scc在大腦中的表達(dá)證據(jù)最早在小鼠中發(fā)現(xiàn)。P450scc和新生的以及成體鼠類(lèi)[4,48]的海馬神經(jīng)元一樣都是在膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。斑馬魚(yú)14hpf時(shí)，Cyp11a1 mRNA開(kāi)始在卵黃合胞體中出現(xiàn)，成體時(shí)Cyp11a1 mRNA出現(xiàn)在性腺、腎上腺皮質(zhì)腺和腦中。用原位雜交和RT-PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)，成體斑馬魚(yú)Cyp11a1基因同樣在端腦、腎小球和下丘腦中表達(dá)[14]。

6.2 P450 17α 羥化酶/c17-20 lyase（P450c17）

細(xì)胞色素P450 17α羥化裂解酶（P450c17）是微粒體酶，具有兩種作用：羥化和裂解。P450c17首次在胖頭Pimephales promelas中發(fā)現(xiàn)。用RT-PCR和DNA雜交檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，P450c17在雌和雄性大腦中都有表達(dá)。在黑鯛中發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵類(lèi)固醇合成酶的轉(zhuǎn)錄（即 P450c 17），在 60dpf、120dpf和 150dpf時(shí)腦中表達(dá)，這說(shuō)明魚(yú)腦是類(lèi)固醇合成的起始部位[49]。

6.3 3-β-羥化類(lèi)固醇脫氫酶/D-5-4異構(gòu)酶（3β-HSD）

3β-HSD是一種類(lèi)固醇合成關(guān)鍵酶，通過(guò)氧化和異構(gòu)作用催化孕烯醇酮轉(zhuǎn)化成黃體酮，17-羥基孕烯醇酮轉(zhuǎn)化成17-羥孕酮，以及脫氫表雄酮轉(zhuǎn)化成雄烯二酮（DHEA）。斑馬魚(yú)的3β-HSD-樣免疫反應(yīng)出現(xiàn)在端腦背部、丘腦核中央后側(cè)、視前區(qū)核和結(jié)節(jié)核后側(cè)等的神經(jīng)樣細(xì)胞中。高效液相色譜法顯示，成體斑馬魚(yú)腦能夠?qū)⒃邢┐纪D(zhuǎn)化成黃體酮，說(shuō)明3β-HSD酶活性較高。研究發(fā)現(xiàn)，90dah（孵化后天數(shù)days after hatching）時(shí)石斑魚(yú)前、中、后腦的Hsd3b1 mRNA表達(dá)水平較低，之后在110dah時(shí)前、中、后腦表達(dá)量明顯增加，相比于110dah 150dah時(shí)除中腦外前腦和后腦的表達(dá)水平顯著性降低。孵出和不同發(fā)育階段下丘腦Hsd3b1的mRNA表達(dá)水平?jīng)]有顯著性差異。90dah時(shí)前腦、下丘腦和后腦Hsd3b1的表達(dá)水平相似，而中腦的表達(dá)水平是其他部位的5倍。110dah時(shí)中腦和后腦的Hsd3b1 mRNA表達(dá)水平分別是前腦和下丘腦的14倍和3.2倍[50]。

3β顯示出明顯的性別二態(tài)性。雄性成體鯰中腦3β-HSD總體轉(zhuǎn)錄豐度比雌性高，分布的季節(jié)性變化說(shuō)明雌雄之間存在差異。產(chǎn)卵前雄性延腦、端腦、下丘腦的3β-HSD活性最高，雌性下丘腦、嗅球和延腦3β-HSD活性最高，但無(wú)論雌雄，3β-HSD在腦垂體中的表達(dá)量都最低[51]。

6.4 17β-羥化類(lèi)固醇脫氫酶（17β-HSD）

17β-羥化類(lèi)固醇脫氫酶（17β-HSD）是催化類(lèi)固醇生物合成最后一步的一組酶。這些酶將雌激素酮轉(zhuǎn)化成雌二醇（反之亦然），是催化哺乳類(lèi)和非哺乳類(lèi)脊椎動(dòng)物減少雄烯二酮轉(zhuǎn)化成睪酮的關(guān)鍵酶。魚(yú)類(lèi)有多達(dá)9種類(lèi)型的17β-HSD，只有4種具有催化活性和表達(dá)模式。斑馬魚(yú)17β-HSD在精巢和卵泡中表達(dá)，但是RT-PCR顯示，17β-HSD 1,2,3型同樣能夠在雌魚(yú)和雄魚(yú)的腦中表達(dá),但斑馬魚(yú)缺少 17β-HSD-2 型酶[52]。

6.5 5α還原酶

5α-還原酶也是一種微粒體酶，能夠減少某些類(lèi)固醇底物的C4-C5雙鍵，能顯著催化睪酮向更強(qiáng)勢(shì)的5α二氫睪酮轉(zhuǎn)化（或?qū)ⅫS體酮轉(zhuǎn)化成二氫孕酮以及將11-脫氧皮質(zhì)酮轉(zhuǎn)化成5α-二羥去氧皮質(zhì)酮）[4]。研究發(fā)現(xiàn)，早期硬骨魚(yú)腦中5α-還原酶活性較高[6]，隨后的研究證實(shí)，金魚(yú)和蟾魚(yú)腦中5α-還原酶活性也較高。最近發(fā)現(xiàn)，非洲肺魚(yú)Protopterus annectens具有5α-還原酶免疫反應(yīng)性，但是未發(fā)現(xiàn)5α還原酶在硬骨魚(yú)中細(xì)胞定位的相關(guān)信息。

6.6 Foxl2基因

Foxl2是fox家族中一員，在發(fā)育過(guò)程中起轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，包括調(diào)節(jié)卵巢和睪丸的分化、發(fā)育和維持[53]。Foxl2在尼羅羅非魚(yú)、牙鲆Paralichthys olivaceus、歐洲海鱸 Dicentrarchus labrax、虹鱒、青鳉Oryzias latipes和尖齒胡鯰Clarias gariepinus中能夠與性腺特異性Cyp19基因啟動(dòng)子結(jié)合，抑制雄性的性別分化通路而促進(jìn)卵巢的分化和發(fā)育。其另一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)在芳香化酶外顯子的5’-側(cè)翼區(qū)。魚(yú)類(lèi)Foxl2a在性腺中顯示出明確的性別二態(tài)性，在卵巢中的表達(dá)水平比精巢高[54]。

Cyp19a1a、Cyp19a1b和Foxl2并列表達(dá)，其他轉(zhuǎn)錄因子如Ad4BP和SF-1同樣參與調(diào)節(jié)Cyp19a1a的表達(dá)，這可能是因?yàn)镕oxl2基因不能單獨(dú)激活芳香化酶的表達(dá)，需要其他因子共同調(diào)節(jié)。

6.7 Cyp11a和Cyp11b2酶

Cyp11a酶能夠?qū)⒛懝檀嫁D(zhuǎn)化成孕烯醇酮，其表達(dá)模式受 Sf-1、Dax-1、TreP-132、LBP 和 GATA 等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。Cyp11a1是所有類(lèi)固醇激素合成的限速酶。石斑魚(yú)[51]的Cyp11a1 mRNA在110dah時(shí)表達(dá)，前腦、中腦和下丘腦表達(dá)量增加，之后逐漸降低，這與黑鯛類(lèi)似。這些結(jié)果說(shuō)明，硬骨魚(yú)腦能夠?qū)⒛懝檀嫁D(zhuǎn)化成孕烯醇酮。Cyp17a1 mRNA類(lèi)似，黑鯛Cyp17a1自性腺分化期開(kāi)始表達(dá)。虹鱒雄性腦中Cyp11a1、Hsd3b1、Cyp17a1和 Cyp19a1b基因的表達(dá)以及芳香化酶活性在性腺形態(tài)學(xué)分化（35～39dpf）之前較高，說(shuō)明硬骨魚(yú)腦中神經(jīng)類(lèi)固醇基因的表達(dá)較為強(qiáng)烈，很可能在早期發(fā)育階段產(chǎn)生神經(jīng)甾體。先前的研究發(fā)現(xiàn)，雄激素處理能降低虹鱒精巢Cyp11a基因的表達(dá)，而乙炔基雌二醇（EE2）能上調(diào)大西洋鮭卵母細(xì)胞中Cyp11a的表達(dá)。用17α甲基睪丸酮（MT）處理后的黃顙魚(yú)Pelteobagrus fulvidraco卵巢Cyp11a的表達(dá)下降[55]（Cyp11b2酶能夠催化11-酮睪的合成）。

7 總結(jié)和展望

成熟魚(yú)中芳香化酶的活性較高是受雌激素和雄激素的影響，提高了放射性膠質(zhì)細(xì)胞中Cyp19a1b基因的上調(diào)。然而，芳香化酶在這些細(xì)胞中的功能很大程度上源于推測(cè)。事實(shí)上放射性膠質(zhì)細(xì)胞是成魚(yú)中芳香化酶表達(dá)的起始細(xì)胞，這說(shuō)明雌激素在神經(jīng)發(fā)生中參與了經(jīng)典的分子機(jī)制。越來(lái)越多的證據(jù)顯示，芳香化酶在腦性別分化中起作用，參與影響了動(dòng)物的性行為。硬骨魚(yú)腦是產(chǎn)生芳香化酶底物的起始者。如果腦不需要性腺產(chǎn)生芳香化雄激素，那么就從根本上改變了腦芳香化的功能性意義。最近在對(duì)斑馬魚(yú)腦的研究中發(fā)現(xiàn)，激活關(guān)鍵類(lèi)固醇合成酶是導(dǎo)致芳香化雄激素的原因。原位雜交發(fā)現(xiàn)了腦芳香化酶表達(dá)細(xì)胞的表達(dá)模式。這些結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明魚(yú)腦確實(shí)是類(lèi)固醇合成器官，在缺乏性腺雄激素的情況下能夠在放射性膠質(zhì)祖細(xì)胞中產(chǎn)生雌二醇?？紤]到雌激素在增殖、分化和細(xì)胞凋亡上的作用，這種性能有助于提高腦神經(jīng)活性和特殊的可塑性。放射性膠質(zhì)祖細(xì)胞存在于許多區(qū)域和貫穿整個(gè)生活史說(shuō)明神經(jīng)發(fā)生能夠在腦中發(fā)生并貫穿整個(gè)成體期。

成魚(yú)腦的神經(jīng)發(fā)生與其他模式生物類(lèi)似，如存在側(cè)遷移流。胚胎神經(jīng)發(fā)生機(jī)制（放射性膠質(zhì)細(xì)胞促進(jìn)腦的生長(zhǎng)）也與其他模式生物類(lèi)似?？紤]到芳香化酶的表達(dá)對(duì)雌激素和雄激素的高度敏感性，性腺活性有可能進(jìn)一步調(diào)節(jié)某些區(qū)域的神經(jīng)性活性和可塑性。如視前區(qū)和下丘腦內(nèi)側(cè)基底部芳香化酶表達(dá)活性最高。這些特性可能構(gòu)建了貫穿整個(gè)生活史的性別特異性環(huán)路。對(duì)鳥(niǎo)類(lèi)和小鼠中的研究發(fā)現(xiàn)，翻譯后的機(jī)制能夠快速調(diào)節(jié)芳香化酶活性，比如磷酸化作用[24]。這種快速的改變能夠解釋同步的雌雄同體中的雄性和雌性之間的轉(zhuǎn)變。其精確機(jī)制有待研究，尤其是關(guān)于雌激素受體（ERα、ERβ和ERβ2）在魚(yú)類(lèi)神經(jīng)發(fā)生中的作用[5]，以及GPR30的作用和其他膜介導(dǎo)效應(yīng)。最近發(fā)現(xiàn)，在哺乳類(lèi)中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）中GPR30通過(guò)雌激素調(diào)節(jié)腦部的不同功能。盡管GPR30在卵母細(xì)胞和魚(yú)類(lèi)性腺中表達(dá)，其在大腦中的表達(dá)模式和功能尚待研究。

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