細(xì)胞免疫熒光法在視神經(jīng)脊髓炎患者血清及腦脊液中水通道蛋白-4抗體檢測(cè)中的運(yùn)用價(jià)值

趙鶴進(jìn)

視神經(jīng)脊髓炎因其嚴(yán)重的臨床癥狀，極大影響了人們生活質(zhì)量和生命安全，及早采取鑒別診斷就顯得格外重要。隨著水通道蛋白-4(anti-aquapprins-4，AQP-4)在脊髓和視神經(jīng)細(xì)胞上的慢慢發(fā)現(xiàn)[1]，以及水通道蛋白-4抗體(APQ-4Ab)在視神經(jīng)脊髓炎發(fā)病中的作用機(jī)制的認(rèn)識(shí)，尤其是可以與臨床癥狀極為相似多發(fā)性硬化進(jìn)行鑒別[2]，采用合理有效的APQ-4Ab檢查方法是本研究關(guān)注的重點(diǎn)。我們將細(xì)胞免疫熒光法(CBA)、乳膠免疫增強(qiáng)比濁法(PETIA)和酶聯(lián)免疫法(ELISA)3種檢查方法在血清和腦脊液中進(jìn)行檢測(cè)分析比較，為臨床診斷提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇在2013年6月至2017年4月在我院診斷為視神經(jīng)脊髓炎患者58例(NMO組)和49例多發(fā)性硬化患者(MS組)。視神經(jīng)脊髓炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)主要包括視敏度的下降、視網(wǎng)膜厚度減少、視覺(jué)誘發(fā)電位異常、MRI提示超過(guò)3個(gè)脊柱節(jié)段受損等[3]。多發(fā)性硬化診斷參照張星虎等人提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)包括嚴(yán)重心腦血管疾病患者、合并有其他器質(zhì)性神經(jīng)系統(tǒng)疾病患者已有經(jīng)過(guò)免疫抑制劑和激素治療的患者。同時(shí)選取體檢健康人群45例作為對(duì)照組。本研究經(jīng)過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)同意，所有患者均知情同意。

1.2 樣本采集 3組患者均空腹促凝管采血3 mL，3 000 r/min離心5 min，分離血清－20℃保存以備研究。NMO組和MS組患者需行腰椎穿刺留取腦脊液標(biāo)本0.5 mL，3 000 r/min離心5 min，分離上清液－20℃保存以備研究。

1.3 檢測(cè)方法 主要是檢測(cè)(APQ-4Ab)。①CBA檢測(cè)采用上海銳塞生物試劑盒，按照其說(shuō)明書(shū)提供的檢測(cè)步驟，將血清和腦脊液與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞孵育后采用熒光顯微鏡觀察，細(xì)胞膜出現(xiàn)綠色熒光為陽(yáng)性結(jié)果。②PETIA檢測(cè)采用上海銳塞生物試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)提供的檢查步驟操作，測(cè)定散射光的變化率。以說(shuō)明書(shū)提供的參考值判斷陽(yáng)性結(jié)果。③ELISA檢測(cè)采用上海銳塞生物試劑盒，按照說(shuō)明書(shū)提供的檢查步驟操作，450 nm處讀取吸光值，以說(shuō)明書(shū)提供的參考值判斷陽(yáng)性結(jié)果。

1.4 觀察指標(biāo) ①3組人群和3種檢測(cè)方法APQ-4Ab陽(yáng)性率的比較。②敏感性和特異性的比較，敏感性＝檢測(cè)陽(yáng)性人數(shù)/(真陽(yáng)性人數(shù)＋假陰性人數(shù))×100%。特異性=檢測(cè)陰性人數(shù)/(真陰性人數(shù)＋假陽(yáng)性人數(shù))×100%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的分析和處理。計(jì)量資料采用(±s)表示，計(jì)數(shù)資料采用[n(%)]表示。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組患者一般資料比較(表1) 經(jīng)卡方檢驗(yàn)，各組在性別和病程上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，方差分析顯示，3組在年齡上差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，具有可比性。

表1 3組患者一般資料比較[n，(±s)]

表1 3組患者一般資料比較[n，(±s)]

組別 例數(shù) 性別(男/女) 年齡/歲 病程/月NMO組 58 28/30 43.7±5.9 12.3±2.6 MS組 49 24/25 44.6±5.7 11.8±3.3對(duì)照組 45 23/22 43.2±6.1 χ2/F值 1.65 2.61 0.89 P值 ＞0.05 ＞0.05 ＞0.05

2.2 3種檢測(cè)方法在不同分組血清APQ-4Ab陽(yáng)性率的比較(表2) 雖然3種檢測(cè)方法在NMO組、MS組和對(duì)照組中APQ-4Ab的檢測(cè)陽(yáng)性率均有差異(χ2＝11.64，8.52，7.49，P＜0.05)，但是在NMO組中，CBA法檢測(cè)APQ-4Ab的陽(yáng)性率為81.1%，高于PETIA法的55.2%和ELISA的43.1%(χ2＝6.23，P＜0.05)。在MS組中，3種檢測(cè)方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝1.17，P＞0.05)。3種檢測(cè)方法在對(duì)照組中APQ-4Ab陽(yáng)性率均為0。

表2 3種檢測(cè)方法在不同分組血清APQ-4Ab陽(yáng)性率的比較

2.3 3種檢測(cè)方法在不同分組腦脊液APQ-4Ab陽(yáng)性率的比較(表3) 同樣3種檢測(cè)方法在NMO組、MS組腦脊液中APQ-4Ab陽(yáng)性率均有差別(χ2＝7.92，8.24，8.15，P＜0.05)，但是在NMO組中，CBA法檢測(cè)APQ4-Ab的陽(yáng)性率為84.5%，高于PETIA法的58.6%和ELISA的48.3%(χ2＝10.52，P＜0.05)，在MS組中，3種檢測(cè)方法差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝0.84，P＞0.05)。

表3 3種檢測(cè)方法在不同分組腦脊液APQ-4Ab陽(yáng)性率的比較[n(%)]

2.4 3種檢測(cè)方法在NMO組血清和腦脊液檢測(cè)APQ-4Ab的敏感性和特異性比較(表4) 本研究計(jì)算的是NMO組血清和腦脊液總敏感性和特異性，結(jié)果可見(jiàn)，CBA的敏感性為83.1%，高于PETIA的62.4%和ELISA的57.6%(χ2＝6.85，P＜0.05)。3種檢測(cè)方法的特異性都可達(dá)到90%以上，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2＝0.78，P＞0.05)。

表4 3種檢測(cè)方法在NMO組血清和腦脊液檢測(cè)APQ-4Ab的敏感性和特異性比較 單位：%

3 討論

視神經(jīng)脊髓炎又稱Devic綜合征，是視神經(jīng)和脊髓同時(shí)或相繼受累的急性或亞急性脫髓鞘病變，好發(fā)于青狀年，兒童也有常見(jiàn)，男女均可發(fā)病。臨床多表現(xiàn)為不同程度的視力敏感度下降、甚至失明，感覺(jué)喪失，下肢癱瘓等。短時(shí)間的視力障礙和癱瘓是本病的特點(diǎn)[5]。發(fā)病機(jī)制不詳，可能原因是與病毒感染導(dǎo)致機(jī)體自身免疫系統(tǒng)功能混亂，造成視神經(jīng)和脊髓脫髓鞘病變。臨床診斷檢測(cè)方法主要包括眼部和脊髓神經(jīng)檢測(cè)、血清和腦脊液分析和影像學(xué)檢查，是多系統(tǒng)聯(lián)合檢查完成對(duì)其診斷。在以往的研究中，由于臨床癥狀的相似性，視神經(jīng)脊髓炎被誤認(rèn)為是多發(fā)性硬化的一種亞型[6]，但隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，慢慢發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)脊髓炎在影像學(xué)、血清學(xué)檢查等與多發(fā)性硬化都有很大的不同。MRI檢查上，視神經(jīng)脊髓炎受損的脊髓節(jié)段往往在3個(gè)或3個(gè)以上，稱之橫貫性脊髓炎，而多發(fā)性硬化的病灶多在大腦半球上，脊髓很少受損超過(guò)3個(gè)。血清學(xué)檢查上，APQ-4Ab是能夠早期區(qū)別視神經(jīng)脊髓炎和多發(fā)性硬化的檢測(cè)指標(biāo)，并對(duì)視神經(jīng)脊髓炎指導(dǎo)用藥、預(yù)后、復(fù)發(fā)等均有重大價(jià)值[7]。APQ-4是分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的水通道跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白上，在大腦、脊髓和視神經(jīng)均有可見(jiàn)。不同部位的APQ-4發(fā)揮不同功能，共同參與腦脊液分泌和重吸收，以及維持大腦神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)外離子平衡[8]。APQ-4Ab又稱視神經(jīng)脊髓炎特異性抗體(NMO-lgG)。病理狀態(tài)下，APQ-4Ab能激活補(bǔ)體系統(tǒng)，導(dǎo)致視神經(jīng)和脊髓脫髓鞘炎性病變，可破壞血腦屏障、誘導(dǎo)星型膠質(zhì)細(xì)胞死亡、中樞系統(tǒng)神經(jīng)元丟失等[9]。同時(shí)也支持視神經(jīng)脊髓炎是一種主要由體液免疫介導(dǎo)的自身免疫性疾病。

CBA是將熒光素標(biāo)志在已知的細(xì)胞抗原或抗體上，在與相應(yīng)抗體進(jìn)行特異性結(jié)合，在細(xì)胞上形成含有熒光素的抗原抗體復(fù)合物，通過(guò)顯微鏡可以直接觀察熒光反應(yīng)來(lái)判斷結(jié)果。這種檢測(cè)方法具有檢測(cè)速度快、準(zhǔn)確性高、敏感性和特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。而常規(guī)的抗原抗體結(jié)合檢測(cè)方法如PETIA和ELISA存著一些問(wèn)題，如前帶后帶現(xiàn)象、脂血溶血、比色杯和光源對(duì)檢測(cè)的影響，導(dǎo)致準(zhǔn)確性和敏感度上有一定缺陷[10]。本研究主要進(jìn)行比較了CBA、PETIA和ELISA這3種檢查方法對(duì)于APQ-4Ab檢測(cè)能力的比較。從確診的NMO患者、MS患者以及健康人群的分組中可以看到，這3種方法在3組人群的血清和腦脊液中APQ-4Ab檢測(cè)均有差異性，提示這3中檢查方法都可以在一定程度上用于視神經(jīng)脊髓炎的鑒別和診斷。但是在確診的NMO組中，無(wú)論是腦脊液還是血清中，CBA對(duì)于APQ-4Ab檢測(cè)的陽(yáng)性率均高于PETIA和ELISA，可以說(shuō)明CBA對(duì)于APQ-4Ab的檢測(cè)準(zhǔn)確性還是高于常規(guī)的抗原抗體檢測(cè)方法。在檢測(cè)敏感性上，CBA法的敏感性為83.1%，高于PETIA和ELLISA法。而在特異性上，3種檢測(cè)方法幾乎差距不大，都在90%以上，進(jìn)一步證明細(xì)胞免疫熒光法對(duì)于水通道蛋白-4抗體檢測(cè)的重要性。

綜上所述，CBA在視神經(jīng)脊髓炎患者血清及腦脊液中APQ-4Ab檢測(cè)中具有較高的準(zhǔn)確性，且敏感性和特異性俱佳，值得在臨床上大力推廣。

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