腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞分選方法研究進(jìn)展

龐 龍，張軍峰，劉博迪，郝宏博，徐 曦

（1西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部，陜西西安710021；2西安交通大學(xué)能動(dòng)學(xué)院，陜西西安710049）

0 引言

腦膠質(zhì)瘤干細(xì)胞（glioma stem cells，GSCs）是指存在于腦膠質(zhì)瘤中具有獨(dú)立成瘤能力的一種細(xì)胞［1-3］。相較于其他的腫瘤細(xì)胞，GSCs具有自我更新、無(wú)限增殖、多向分化潛能、耐藥性等特征［4-5］。研究［6-7］表明GSCs是腦膠質(zhì)瘤發(fā)生的“始動(dòng)”細(xì)胞，在腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、維持、轉(zhuǎn)移擴(kuò)散和復(fù)發(fā)過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用。但是GSCs在整個(gè)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的含量極其微小，這給它的研究帶來(lái)了很大的困難［8］。目前根據(jù)分選是否需要細(xì)胞表面標(biāo)記物，GSCs的分選主要可以分為細(xì)胞表面標(biāo)志物分選和不依賴細(xì)胞表面標(biāo)記物分選法兩種方式［8-9］，利用細(xì)胞表面標(biāo)志物分選的特點(diǎn)是分離得到的GSCs純度高，但缺點(diǎn)是該方法破壞了細(xì)胞的生物化學(xué)性質(zhì)不利于后續(xù)的檢驗(yàn)研究。此外，該方法必須依賴已知的標(biāo)記物，而對(duì)于未知的標(biāo)記物則無(wú)法進(jìn)行檢驗(yàn)［10］。隨著微流控芯片技術(shù)的發(fā)展，不依賴細(xì)胞表面標(biāo)記物分選法得到了長(zhǎng)足的發(fā)展。本文將結(jié)合GSCs的生物學(xué)特性對(duì)目前GSCs分選的常用方法和技術(shù)展開探討。

1 GSCs的生物學(xué)特性

作為腫瘤干細(xì)胞（tumor stem cells，TSCs）的一種，GSCs擁有與腫瘤干細(xì)胞相同的生物學(xué)特性，而這些特征也是GSCs分選的依據(jù)。所謂TSCs是指存在于腫瘤細(xì)胞中的一小部分細(xì)胞，這些細(xì)胞具有自我更新、無(wú)限增殖能力以及多向分化潛能的干細(xì)胞樣特性，它們是腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移以及復(fù)發(fā)的根源［11-12］。TSCs的概念提出于20世紀(jì)60年代，但當(dāng)時(shí)缺乏先進(jìn)的分子生物學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)，直到21世紀(jì)初美國(guó)癌癥研究學(xué)會(huì)（American Association for Cancer Research，AACR）才正式宣布承認(rèn)TSCs。這標(biāo)志著TSCs得到了醫(yī)學(xué)界的公認(rèn)，從而使TSCs的研究進(jìn)入了一個(gè)新的階段。TSCs理論為我們重新認(rèn)識(shí)腫瘤的起源、腫瘤的診斷與治療等方面提供了新方向［13］。TSCs的主要特征包括類干細(xì)胞特性、懸浮球狀生長(zhǎng)、無(wú)限增殖能力、致瘤能力等。

1.1 類干細(xì)胞特性從某種意義上，干細(xì)胞與TSCs具有相似性［14-16］。在最初研究TSCs時(shí)發(fā)現(xiàn)它和干細(xì)胞表達(dá)相同的基因與標(biāo)記物如SOX2、CD133、Nestin等［17-18］，這些標(biāo)記物通常作為TSCs鑒定的主要依據(jù)之一［19-20］；研究［21-22］發(fā)現(xiàn) TSCs 和干細(xì)胞共用一些與細(xì)胞代謝、自我更新相關(guān)的信號(hào)通路，如Notch和 Wnt／β-catenin；此外，TSCs和干細(xì)胞都具有自我更新能力、增殖能力及多向分化潛能，并且兩者的增殖方式都為不對(duì)稱分裂（asymmetrical division）。

1.2 懸浮生長(zhǎng)與無(wú)限增殖能力研究［23-24］發(fā)現(xiàn)使用神經(jīng)干細(xì)胞的無(wú)血清培養(yǎng)液培養(yǎng)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞時(shí)會(huì)出現(xiàn)腫瘤球。連續(xù)傳代后的腫瘤球生長(zhǎng)速度加快，且能夠保持穩(wěn)定的聚集狀態(tài)。此外，研究［25-26］還發(fā)現(xiàn)由親本腦膠質(zhì)腫瘤干細(xì)胞球制成的單細(xì)胞懸液能夠再次培養(yǎng)形成腫瘤球，且該腫瘤球保持與親本腫瘤球一致的表型。GSCs具有無(wú)限增殖能力，這表現(xiàn)為在腫瘤組織中絕大多數(shù)的腫瘤細(xì)胞增殖能力有限，只有含量很少的GSCs才能夠形成新的腫瘤細(xì)胞群并轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散［27］。膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可以實(shí)現(xiàn)自我更新，形成與父代相同表型的子代TSCs，與此同時(shí)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞可以分裂增殖成腫瘤組織中大量含有的其他腫瘤細(xì)胞。

1.3 致瘤能力GSCs最大的特征是其致瘤能力。不同于腫瘤組織中其他的腫瘤細(xì)胞，含量稀少的TSCs具有很強(qiáng)的致瘤能力［28］。人源性腫瘤細(xì)胞的致瘤能力通常通過(guò)體外克隆形成和免疫缺陷小鼠體內(nèi)的腫瘤形成能力兩個(gè)方面進(jìn)行評(píng)價(jià)。其中體外克隆形成是將源自原發(fā)性腫瘤組織或細(xì)胞系的TSCs在軟瓊脂或基底膜類似物上進(jìn)行培養(yǎng)，比較它們可形成的克隆數(shù)目及所形成的腫瘤球大??；免疫缺陷動(dòng)物體內(nèi)的腫瘤形成能力是指將分選的相同數(shù)量的TSCs和非TSCs分別按相同方式接種于免疫缺陷小鼠體內(nèi)，觀察它們?cè)谙嗤瑫r(shí)間內(nèi)的腫瘤形成情況。研究［19］表明，TSCs（CD133+）體外克隆明顯大于CD133-的腦腫瘤非干細(xì)胞。同時(shí)對(duì)比接種后24周內(nèi)形成可以連續(xù)移植的腫瘤，使用非糖尿病型嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷小鼠（non-obese diabetic， severe combined immunodeficient，NOD-SCID），接種105個(gè)CD133-的腦腫瘤非干細(xì)胞的NOD-SCID未見腫瘤形成，而使用100個(gè)腦TSCs接種則可以形成腫瘤［5］。腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展、維持、轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等均與 GSCs有著密切的關(guān)系［29］，可以說(shuō)GSCs是導(dǎo)致腦膠質(zhì)的罪魁禍?zhǔn)祝?/p>

2 GSCs常用的分選方法

由于GSCs在整個(gè)腦膠質(zhì)瘤中含量非常稀少，使它的分離非常困難。因此，GSCs的分選是進(jìn)一步研究膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的難點(diǎn)和基礎(chǔ)。按是否使用細(xì)胞表面標(biāo)記物可分為細(xì)胞表面標(biāo)志物分選和不依賴細(xì)胞表面標(biāo)記物分選法兩種方式。下面將這兩種方法進(jìn)行概述。

2.1 細(xì)胞表面標(biāo)志物分選作為膠質(zhì)瘤細(xì)胞中含量較少的一個(gè)亞群，對(duì)于GSCs特異性標(biāo)記物的研究一直是熱點(diǎn)內(nèi)容。目前已經(jīng)證實(shí)的GSCs標(biāo)記主要包括：位于細(xì)胞核中的 SOX2、Olig2、BMI-1、EZH2，位于細(xì)胞質(zhì)中的 Nestin、BMX以及細(xì)胞膜表面標(biāo)記物CD133、CD15、CD90、Integrin-α6、L1CAM 等［29］。 其中，細(xì)胞表面標(biāo)記物對(duì)特定細(xì)胞分選是目前進(jìn)行細(xì)胞分選研究最為常用的方法。這種方法是借助于已知的特殊細(xì)胞表面標(biāo)志物，利用免疫磁珠或?qū)⒖膳c特殊表面標(biāo)記物結(jié)合的帶熒光的“標(biāo)簽”對(duì)GSCs進(jìn)行標(biāo)記并分選［30-32］。通常采用的方法包括免疫磁珠分選法（magnetic activated cell sorting， MACS）、熒光激活細(xì)胞分選法（fluorescence-activated cell sorting，F(xiàn)ACS）等。

MACS進(jìn)行GSCs分選主要是將GSCs表面的特異性抗原標(biāo)記到免疫磁珠表面［33］，將標(biāo)記過(guò)的磁珠與單細(xì)胞懸液共同孵育，使磁珠結(jié)合到GSCs表面，然后在磁場(chǎng)的作用下將GSCs分離出來(lái)。此外，還有一種方法是先用特殊的一抗與膠質(zhì)瘤干細(xì)胞結(jié)合，再用標(biāo)記有二抗的磁珠與之結(jié)合，通過(guò)使用易降解材料制作磁珠可以降低對(duì)目標(biāo)細(xì)胞的損傷。

與MACS相同，F(xiàn)ACS也是常用的一種分選方法［34-37］。FACS具體是利用細(xì)胞表面的特異性抗原，通過(guò)將帶熒光標(biāo)記的特異抗體與TSCs表面特殊抗原結(jié)合，將細(xì)胞分為帶熒光標(biāo)記的目標(biāo)群和不帶熒光標(biāo)記的細(xì)胞群，然后借助于流式細(xì)胞儀將目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行分離。由于使用了流式細(xì)胞儀，該方法又被稱為流式分選法。

采用細(xì)胞表面標(biāo)志物分選的優(yōu)點(diǎn)是可以利用已知的確定性標(biāo)記物得到純度高的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞，給后續(xù)的膠質(zhì)瘤干細(xì)胞研究提供了良好的基礎(chǔ)［38-39］。缺點(diǎn)是該方法需要復(fù)雜的操作和昂貴的設(shè)備支持，如使用MACS需要制備特殊的磁珠，而使用FACS則需要使用流式細(xì)胞儀［40］。而且分離的通量受到設(shè)備和操作參數(shù)的影響，如FACS需要使用合適的電壓進(jìn)行，在需要提高操作通量增加電壓時(shí)又會(huì)影響到目標(biāo)細(xì)胞的活性。此外這些操作必須保證均在無(wú)菌環(huán)境下進(jìn)行。

除去以上兩種方法外，還可利用啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的熒光蛋白表達(dá)特性進(jìn)行GSCs的分選。啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光蛋白表達(dá)特性是通過(guò)控制GSCs特異性標(biāo)志蛋白的基因啟動(dòng)子構(gòu)建慢病毒載體，并用這些慢病毒載體去感染膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通過(guò)與藥物共培養(yǎng)篩選或流式分選等方法進(jìn)行分離，分離得到的細(xì)胞可以進(jìn)一步培養(yǎng)［41］。該方法對(duì)于完善和證明相關(guān)標(biāo)記物與GSCs之間的關(guān)系以及靶點(diǎn)藥物的研制有重要的意義。此外，羅丹明123（Rhodamine 123， Rho123）是一種可透過(guò)細(xì)胞膜的陽(yáng)離子熒光染料，是一種線粒體跨膜電位指示劑。研究［42］表明TSCs區(qū)別于其它細(xì)胞，可以通過(guò)細(xì)胞表面的P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）將線粒體染色劑Rho123主動(dòng)外泵至胞外，利用Rho123結(jié)合流式細(xì)胞分選術(shù)富集干細(xì)胞的方法將低熒光亞群分選即可達(dá)到富集和分離TSCs的目的。

2.2 不依賴細(xì)胞表面標(biāo)記物分選法

2.2.1 側(cè)群細(xì)胞（side population， SP）分析法 SP 分析法是一種不依賴于細(xì)胞表面標(biāo)記物的分選方法［43］。其原理主要是利用GSCs高表達(dá)細(xì)胞膜ABCG2轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白［44-45］，這種蛋白可以將細(xì)胞核染料Hoechst33342轉(zhuǎn)移到細(xì)胞外。這種特性使GSCs區(qū)別于其他膠質(zhì)瘤細(xì)胞，具有Hoechst33342細(xì)胞核染料拒染性，可以利用這一特征采用流式細(xì)胞術(shù)將GSCs從膠質(zhì)瘤細(xì)胞中分離出來(lái)。

2.2.2 無(wú)血清培養(yǎng)法 無(wú)血清培養(yǎng)法是利用神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液中不含血清，這可以阻止其中絕大多數(shù)非膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的增殖［46］。但這種培養(yǎng)液中添加有表皮生長(zhǎng)因子、堿性成纖維生長(zhǎng)因子，可以促進(jìn)膠質(zhì)瘤TSCs的增殖。在這種細(xì)胞培養(yǎng)液中，GSCs可以形成致密的腫瘤球并懸浮在細(xì)胞培養(yǎng)液中；而非TSCs則貼壁生長(zhǎng)?？赏ㄟ^(guò)多次收集懸浮腫瘤球進(jìn)行克隆培養(yǎng)得到次代純度高的 GSCs［47］。

2.2.3 利用耐藥性進(jìn)行分選 膠質(zhì)瘤的耐藥機(jī)制是目前已知膠質(zhì)瘤患者化療失敗的主要原因之一，而GSCs起到了關(guān)鍵作用［48-49］。這是因?yàn)镚SCs通常高表達(dá)ATP結(jié)合盒（ATP-binding casette，ABC）轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，如 ABCG2、ABCG1、P-糖蛋白等［50］。 這些蛋白可以將抗癌藥物“泵出”到細(xì)胞外，從而形成對(duì)抗癌藥物的耐藥性特征［51］。 Wang 等［52］利用無(wú)血清懸浮培養(yǎng)聯(lián)合低濃度長(zhǎng)春新堿富集分離GSCs。其中長(zhǎng)春新堿是一種細(xì)胞周期特異性藥物，可誘導(dǎo)除GSCs外的絕大多數(shù)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡或死亡，而具有耐藥性的GSCs得以保留并繼續(xù)增殖。結(jié)果表明相較以前單獨(dú)使用無(wú)血清培養(yǎng)液純化GSCs，這種方法可以縮短傳代次數(shù)，提高GSCs的純度。

3 基于微流控芯片技術(shù)的分選方法

除了上述常用的TSCs分選方法外，近年來(lái)隨著微流控芯片技術(shù)的發(fā)展，使TSCs分選方面有了更為多樣的選擇。相對(duì)于傳統(tǒng)的方法，微流控芯片技術(shù)可以將很多反應(yīng)單元集成到一塊只有幾厘米大小的芯片上進(jìn)行，這使得微流控芯片具有低成本、操作簡(jiǎn)單、高度集成的特點(diǎn)［53-54］。目前其在生物學(xué)領(lǐng)域特別是細(xì)胞分選方面有著廣泛的應(yīng)用。按傳統(tǒng)的分類方法可以將基于微流控芯片技術(shù)的細(xì)胞分選方法分為細(xì)胞表面標(biāo)志物分選和不依賴細(xì)胞表面標(biāo)記物分選法兩種方式。

3.1 細(xì)胞表面標(biāo)志物分選與傳統(tǒng)的分選方法相同，基于微流控芯片分選方法的基本分選原理不變，但利用微流控芯片技術(shù)可以大大降低研究成本，并減少操作步驟，提高分選效率和通量［55-56］。使用微流控芯片進(jìn)行細(xì)胞分選主要是利用特異性的標(biāo)記物通過(guò)充分接觸或者流體操作的原理進(jìn)行分選［57-58］。目前利用細(xì)胞表面標(biāo)記物特異性地針對(duì)GSCs分選的微流控芯片還未出現(xiàn)，但是捕獲源于腦膠質(zhì)瘤的循環(huán)腫瘤細(xì)胞技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)。由于源于腦膠質(zhì)瘤的循環(huán)腫瘤細(xì)胞與GSCs存在著密切的關(guān)系，因此源于腦膠質(zhì)瘤的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分選技術(shù)可以給GSCs分選提供借鑒和參考。

在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）是最常被過(guò)度表達(dá)的受體酪氨酸激酶癌基因。EGFR與腫瘤細(xì)胞的遷移、粘附、侵襲的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等相關(guān)，并與細(xì)胞增殖、血管生成和抗凋亡機(jī)制有密切關(guān)系［59］。 Wan 等［60］設(shè)計(jì)了專門與腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞表面EGFR特異性結(jié)合的適配子，并將其預(yù)先孵育到微管道中。適配子技術(shù)是利用人工合成的單鏈寡核苷酸（DNA或RNA），或者肽鏈與非核苷酸靶目標(biāo)物質(zhì)進(jìn)行高親和力、高特異性的結(jié)合。借助于微流控流體操作技術(shù)可以將目標(biāo)細(xì)胞捕獲到芯片中，而其他正常的細(xì)胞則被去除。Sullivan等［61］利用抗體雞尾酒法將 SOX2、Tubulin beta-3、EGFR、A2B5和c-MET的抗體孵育到CTC-iChip的流體管道表面，利用微流控流體操控技術(shù)使細(xì)胞樣品與管道表面充分的結(jié)合，從而使目標(biāo)細(xì)胞被分離出來(lái)。

3.2 不依賴細(xì)胞表面標(biāo)記物分選法利用不依賴細(xì)胞表面標(biāo)記物分選法可以克服細(xì)胞表面標(biāo)記物法破壞所分選細(xì)胞的生物化學(xué)性質(zhì)的缺點(diǎn)。此外，該方法還可以對(duì)于某些未知的標(biāo)記進(jìn)行篩選和確認(rèn)。隨著對(duì)TSCs研究的深入，越來(lái)越多的研究證據(jù)表明TSCs的生物機(jī)械性能與其生物學(xué)特征密切相關(guān)［62-63］。腫瘤通過(guò)外周血循環(huán)發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)，TSCs需要穿過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞層到達(dá)血液中，此時(shí)細(xì)胞大小、變形性起到了關(guān)鍵作用［64-65］。此外，當(dāng)TSCs移動(dòng)到次生腫瘤發(fā)生部位時(shí)，通常要與血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生粘附作用，此時(shí)TSCs粘附血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力起到了關(guān)鍵作用［66-67］。因此，利用TSCs的生物機(jī)械性能對(duì)其進(jìn)行分選，不但能夠最大限度地保留所分離細(xì)胞的生物化學(xué)性質(zhì)，而且能夠?yàn)榘l(fā)現(xiàn)新的TSCs標(biāo)記物提供條件［68-69］。利用傳統(tǒng)的研究方法實(shí)現(xiàn)對(duì)TSCs生物機(jī)械性能的研究比較復(fù)雜且困難，而微流控芯片技術(shù)的發(fā)展則為TSCs生物機(jī)械性能的研究提供了更為方便的工具。

Zhang等［70］利用微流控芯片微柱陣列將腫瘤細(xì)胞按變形性分為變形性強(qiáng)亞群和變形性弱亞群。通過(guò)比較兩個(gè)亞群細(xì)胞的TSCs特征基因表達(dá)檢測(cè)、成瘤能力分析、流式細(xì)胞術(shù)TSCs含量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，變形性強(qiáng)的細(xì)胞亞群中TSCs的含量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于變形性弱的亞群。隨后該小組又設(shè)計(jì)了一種利用細(xì)胞粘附力進(jìn)行腫瘤細(xì)胞分選的微流控芯片，研究表明在特定條件下，粘附力與TSCs含量成反比，粘附力弱的細(xì)胞亞群TSCs的含量高［68］。通過(guò)微流控芯片分選不同大小的人間充質(zhì)干細(xì)胞時(shí)，小的干細(xì)胞比大的干細(xì)胞更易誘導(dǎo)成為其他的終末細(xì)胞，該發(fā)現(xiàn)首次將干細(xì)胞的大小與干細(xì)胞的生物學(xué)性質(zhì)聯(lián)系了起來(lái)［71-72］。基于以上研究背景，Pang等［73］設(shè)計(jì)并制備了一種能夠?qū)⒉煌笮『妥冃涡詥渭?xì)胞陣列化的微流控芯片。以人多形性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U-251為模板，研究發(fā)現(xiàn)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生物機(jī)械性能與其耐藥性密切相關(guān)，即小而／或變形性大的腫瘤細(xì)胞的耐藥性比大而／或變形性差的腫瘤細(xì)胞要強(qiáng)。這提示是否GSCs與生物機(jī)械性能也存在著密切的聯(lián)系？當(dāng)然這有待于進(jìn)一步的研究證明。

4 結(jié)論與展望

GSCs在腦腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移中起著關(guān)鍵作用。而GSCs分選依然是TSCs研究的關(guān)鍵性技術(shù)瓶頸問(wèn)題。傳統(tǒng)的方法多基于GSCs表面特異性標(biāo)記物對(duì)TSCs進(jìn)行分選研究。隨著對(duì)GSCs研究的進(jìn)一步深入和微流控芯片細(xì)胞分選技術(shù)的發(fā)展，基于GSCs侵襲特性、細(xì)胞分裂次數(shù)異質(zhì)性、大小和變形性等非標(biāo)記物分選 GSCs將得到長(zhǎng)足的發(fā)展。未來(lái)GSCs的分選研究主要面向兩個(gè)方面：①臨床的檢測(cè)，這就要求檢測(cè)的操作更為簡(jiǎn)單，成本更為低廉，檢測(cè)的過(guò)程更為高效，該過(guò)程只需要針對(duì)目前已知的標(biāo)記物進(jìn)行檢測(cè)；②科學(xué)研究，該過(guò)程對(duì)GSCs分選的研究主要集中在分選后提過(guò)的后續(xù)理論研究與藥物篩選，因此需要將分選與后續(xù)的檢驗(yàn)結(jié)合起來(lái)使GSCs的研究更為便利和豐富，為腦膠質(zhì)瘤臨床治療提供新的理論基礎(chǔ)。