一種防PM2.5噴霧對空氣污染致大鼠肺部炎癥反應的保護作用研究

初 明，王月丹 （北京大學醫(yī)學部基礎醫(yī)學院，北京100191）

0 引言

2012年，聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署公布的《全球環(huán)境展望5》中指出，每年有近200萬的過早死亡病例與顆粒物污染導致的呼吸系統(tǒng)疾病有關?！睹绹鴩铱茖W院院刊》（PNAS）也發(fā)表了研究報告稱，人類平均壽命因為空氣污染已經縮短了約5年半［1］。2013年10月17日，世界衛(wèi)生組織下屬國際癌癥研究機構首次指出大氣污染對人類致癌，并明確了顆粒物是主要的環(huán)境致癌物。

顆粒物污染系懸浮在空氣中的固體或液體顆粒物，因對生物和人體健康造成危害而得名。顆粒物種類很多，一般指 0.1～75 μm 的化學煙霧、煤煙、煙、塵粒、粉塵和霧塵。其中，PM2.5是指大氣中直徑小于或等于2.5 μm的顆粒物，也稱為可入肺顆粒物，其直徑還不到人頭發(fā)絲直徑的1／20。與較粗的大氣顆粒物相比，PM2.5多為帶正電荷的“陽離子”顆粒，粒徑小，活性強，比表面積大，易附帶有毒、有害物質，如重金屬、微生物等，且在空氣中停留的時間長，分散的距離遠，因而對人體健康的影響更大。大量研究［2-10］表明，顆粒物直徑越小，進入呼吸道的部位越深，直徑10 μm的顆粒物PM10通常沉積在上呼吸道，直徑小于2.5 μm 的顆粒物 PM2.5可深入細支氣管和肺泡，直接影響肺的通氣功能，造成肺組織的損傷，引起哮喘、肺功能下降、呼吸系統(tǒng)炎癥，累及心血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)，并促進癌癥的發(fā)生。PM2.5顆粒物污染不僅威脅人類的健康，而且對社會造成了巨大的經濟負擔。因此，結合科學研究，預防PM2.5迫在眉睫。本研究通過動物空氣暴露試驗研究一種防PM2.5噴霧對空氣污染導致大鼠肺部炎癥反應的保護作用。

1 材料和方法

1.1 實驗動物無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級的成年 SD大鼠，雄性40只，體質量343～395 g。實驗動物均購于北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部，動物合格證號：SCXK（京）2011-0012，常規(guī)飼養(yǎng)于北京大學醫(yī)學部實驗動物科學部的SPF級動物室，12 h光照，溫度22～24℃，濕度（55%±15%）。

1.2 主要試劑一種防 PM2.5噴霧（專利號：ZL201410108955.9，由北京意嘉健康科技有限公司提供）［11］，這種防 PM2.5噴霧能夠在皮膚的表面形成正電場，通過靜電排斥的原理有效減少PM2.5通過呼吸系統(tǒng)進入肺部；RNA提取試劑盒（美國Invitrogen公司）；逆轉錄聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）試劑盒（美國 Invitrogen公司）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司）；大鼠IL-4、IL-6和TNF-α的酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測試劑盒（美國R＆D公司）。

1.3 主要設備大氣PM2.5吸入暴露裝置（由北京大學環(huán)境科學與工程學院提供）［12］。裝置的放置點距離北京市北四環(huán)西路1000米。北京市北四環(huán)西路是北京市的主干道，每日承載220 000輛機動車通行。室外大氣經進氣口導入染毒柜或潔凈柜后排出，氣流量 300～350 L／min。 氣體進入染毒柜前經 PM2.5切割器濾除空氣動力學當量直徑≥2.5 μm的顆粒物，從而使進入染毒柜內的顆粒物直徑＜2.5 μm，且與外界PM2.5濃度保持一致；氣體進入潔凈柜前經 PM2.5切割器過濾再經高效空氣過濾器（high efficiency particulate air filter，HEPA）濾除全部顆粒物，使進入潔凈柜內的空氣不含大氣顆粒物。染毒柜與潔凈柜內其他氣態(tài)污染物濃度相同。其他主要設備包括便攜式PM2.5檢測儀（KHS-PMA，北京清風康華科技有限公司）；酶標儀（Thermo MK3，美國 Thermo公司）；正置熒光顯微照相系統(tǒng)（BX53，日本 Olympus公司）；NanoDrop One分光光度計（美國Thermo公司）；實時熒光定量PCR儀（7500 Fast，美國Applied Biosystems公司）。

1.4 動物空氣暴露實驗按照不同處理方法設過濾空氣-去離子水組（簡稱空氣-純水組）、空氣-防 PM2.5噴霧組（ 簡稱空氣-噴霧組）、PM2.5-純水組、PM2.5-噴霧組，每組10只，暴露時間為90 d。暴露點的空氣PM2.5濃度采用便攜式 PM2.5檢測儀檢測，每日 8：30、12：30 和 16：30 檢測暴露點實時 PM2.5水平，取平均值與國家環(huán)境監(jiān)測站的同期監(jiān)測數(shù)據進行比較?？諝?噴霧組和 PM2.5-噴霧組每日 8：30、12：30 和16：30對大鼠的口鼻及面部霧化噴霧10 s?？諝?純水組和PM2.5-純水組以霧化純水10 s處理。 其中，以空氣-純水組為陰性對照組，以PM2.5-純水組為陽性對照組。

1.5 標本采集第91天，大鼠腹腔注射50 g／L戊巴比妥50 mg／kg。麻醉處死后，暴露氣管，氣管插管，結扎右肺葉，行左肺支氣管肺泡灌洗，每次3 mL，重復3次，回收率約83%，收集大鼠BALF。取右肺中葉（未經灌洗），行4%多聚甲醛固定，并進行病理組織切片，HE染色，在光學顯微鏡下觀察肺組織形態(tài)學變化。

1.6 BALF中炎癥細胞因子含量檢測采用ELISA法，檢測BALF中IL-4、IL-6和TNF-α的含量。分別設標準品孔和待測樣品孔，每孔分別加標準品或待測樣品100 μL，混勻，37℃孵育 2 h；洗板 3 次，每孔加入100 μL生物素標記的抗體工作液（1∶10 000），37℃孵育1 h；洗板3次，每孔加入100 μL辣根過氧化物酶標記的親和素工作液，37℃孵育1 h；洗板3次，每孔加入 90 μL底物工作液，37℃避光顯色30 min后，每孔加50 μL終止液。反應終止5 min內酶標儀檢測吸光度值，檢測波長為450 nm。

1.7 肺組織中炎癥細胞因子mRNA表達檢測采用qPCR法檢測大鼠肺組織中IL-4、IL-6和TNF-α的mRNA表達量。按照試劑盒說明書提取大鼠肺組織的總RNA，并進行mRNA反轉錄。基因引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。基因引物序列如下。 IL-4：上游5’-CGA GCT CAC TCT CTG TGG TG-3’，下游 5’-GAA CGA GGT CAC AGG AGA A-3’；IL-6：上游 5’-GCT GGA GTC ACA GAA GGA G-3’，下游 5’-GGC ATA ACG CAC TAG GTT T-3’；TNF-α：上游 5’-GCC AGC CGA TGG GTT GTA-3’，下游 5’-GGT TGA CTT TCT CCT GGT ATG-3’；磷酸甘油醛脫氫酶（reduced glyceraldehydes-phosphate dehydrogenase， GAPDH）：上游 5’-CTC ATG ACC ACA GTC CAT GC-3’，下游 5’-TTC AGC TCT GGG ATG ACC TT-3’。采用SYBR?GREEN染料法行qPCR反應，以2-ΔΔCt法計算目的基因相對于GAPDH的變化倍數(shù)作為目的基因表達的相對水平，以相對于空氣-純水組的變化倍數(shù)來比較組間差異。

1.8 統(tǒng)計學分析采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學處理。正態(tài)分布計量數(shù)據采用±s表示，多組間連續(xù)計量資料的比較采用多因素方差分析，進一步的兩兩比較采用 LSD法。 P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義［13］。

2 結果

2.1 PM2.5對大鼠 BALF中炎癥細胞因子含量的影響實驗實施期間（2014-12-01／2015-02-28），暴露點 PM2.5測得的濃度值范圍為 68.2 ～228.4 μg／m3，平均 127.6 μg／m3。 空氣暴露實驗實施 90 d，與空氣-純水組比較，PM2.5-純水組大鼠 BALF 中 IL-4、IL-6 和TNF-α 的含量明顯升高（P＜0.01）。 與 PM2.5-純水組比較，PM2.5-噴霧組大鼠 BALF 中 IL-4、IL-6 和 TNF-α的含量明顯下降（P＜0.01）。 空氣-純水組與空氣-噴霧組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖1，表1）。

圖1 PM2.5對大鼠BALF中炎癥細胞因子含量的影響

表1 PM2.5對大鼠BALF中炎癥細胞因子含量的影響（n＝10，±s，pg／mL）

表1 PM2.5對大鼠BALF中炎癥細胞因子含量的影響（n＝10，±s，pg／mL）

bP＜0.01 vs PM2.5-純水組。

組別 IL-4 IL-6 TNF-α空氣-純水組 112.11±39.21 231.51±49.21 252.64±45.33空氣-噴霧組 106.56±33.82 196.84±43.17 226.31±52.16 PM2.5-純水組 378.38±57.70 896.25±83.32 778.38±54.26 PM2.5-噴霧組 142.16±48.90b 272.30±38.90b 302.16±42.67b

2.2 PM2.5對大鼠肺組織中炎癥細胞因子 mRNA 表達的影響空氣暴露實驗實施90 d，與空氣-純水組比較，PM2.5-純水組大鼠肺組織中 IL-4、IL-6 和 TNF-α的 mRNA 表達水平明顯升高（P＜0.01）。 與 PM2.5-純水組比較，PM2.5-噴霧組大鼠肺組織中 IL-4、IL-6 和TNF-α 的 mRNA 表達水平明顯下降（P＜0.01）。 空氣-純水組與空氣-噴霧組之間比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05，圖 2）。

圖2 PM2.5對大鼠肺組織中炎癥細胞因子mRNA表達的影響

2.3 大鼠肺組織病理學改變空氣暴露實驗實施90 d，空氣-純水組、空氣-噴霧組和 PM2.5-噴霧組大鼠肺組織結構正常。PM2.5-純水組肺間隔增厚，肺間質大量炎癥細胞浸潤，肺泡間隔明顯淤血（圖3）。

圖3 大鼠肺組織病理學改變

3 討論

PM2.5顆粒物，又稱“可入肺顆粒物”，主要通過呼吸道進入人體。值得注意的是，PM2.5也可通過吸附在皮膚的毛孔中，導致皮膚炎癥，特別是攜帶脂溶性有毒物質的PM2.5顆粒更容易通過皮膚進入人體。流行病學研究表明，長期暴露于空氣污染物中的人群，其死亡率與空氣污染物的濃度呈正相關。空氣中的病毒、細菌、灰塵和煙霧等PM2.5顆粒物均帶正電，負離子空氣凈化器即通過產生生態(tài)負離子中和沉降空氣中的PM2.5顆粒物。在此基礎上，本課題組研發(fā)了一種防PM2.5噴霧，其基本原理是在皮膚表面形成靜電場，通過靜電排斥的作用減少PM2.5顆粒物通過呼吸和皮膚進入機體，發(fā)揮保護作用［11］。本研究選用PM2.5空氣污染物所致的SD大鼠肺損傷模型，探討這種防PM2.5噴霧對空氣污染導致大鼠肺部炎癥反應的保護作用。

研究［14-15］發(fā)現(xiàn)，成年小鼠 PM2.5顆粒物暴露后出現(xiàn)氣道高反應性和以嗜酸性粒細胞、中性粒細胞浸潤為主的炎癥反應，同時IL-4分泌增加，而IFN-γ的表達水平無明顯變化，影響Th1／Th2的動態(tài)平衡狀態(tài)，從而導致免疫系統(tǒng)功能異常。Th2細胞的過度活化會釋放大量的細胞因子，包括 IL-4、IL-6和 TNF-α等，加重氣道炎癥反應［13］。本研究結果證明，大鼠長期暴露于PM2.5較高的環(huán)境下會導致肺部慢性炎癥，肺組織中炎癥細胞因子長期處于較高水平，引起肺間隔增厚、肺間質大量炎癥細胞浸潤及肺泡間隔淤血。值得注意的是，盡管PM2.5-噴霧組的大鼠同樣長期暴露于 PM2.5較高的環(huán)境，但是在使用防 PM2.5噴霧進行干預后，未見明顯的肺組織病理學改變，而且在大鼠的肺組織和BALF中炎癥細胞因子的表達水平與暴露于潔凈空氣的大鼠相比，沒有明顯的差異，處于正常水平。這一結果證明了防PM2.5噴霧可明顯抑制肺部的炎癥反應，對肺部發(fā)揮保護作用。鑒于PM2.5顆粒物暴露不僅可造成肺組織的損傷，而且可累及心血管系統(tǒng)、神經系統(tǒng)、甚至導致癌癥的發(fā)生。因此，我們需要進一步明確防PM2.5噴霧的保護作用，為全方面預防PM2.5顆粒物對人體造成的危害提供理論依據和可行方案。