液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在化學(xué)藥雜質(zhì)譜研究中的應(yīng)用

許曉輝，劉建飛，黨子龍，趙 波，慕 偉，張生萍

（1蘭州市食品藥品檢驗(yàn)所，甘肅 蘭州730050；2中國科學(xué)院蘭州化學(xué)物理研究所，西北特色植物資源化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，3蘭州大學(xué)第一醫(yī)院藥劑科，甘肅蘭州730000）

0 引言

液質(zhì)聯(lián)用全稱為液相色譜?質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，它以液相色譜作為分離系統(tǒng)，質(zhì)譜為檢測系統(tǒng)，被測樣品經(jīng)流動(dòng)相分離后，進(jìn)入質(zhì)譜系統(tǒng)被離子化，經(jīng)質(zhì)譜的質(zhì)量分析器將碎片離子按質(zhì)量數(shù)分開，經(jīng)檢測器得到質(zhì)譜圖。其優(yōu)勢是分析范圍廣，定性結(jié)果可靠，檢測限低，分析時(shí)間短。液質(zhì)聯(lián)用中常用的質(zhì)譜包括四級桿、三重四級桿、離子阱、四級桿?飛行時(shí)間質(zhì)譜、傅里葉變換質(zhì)譜等。其結(jié)合了色譜對復(fù)雜樣品的高分離能力與質(zhì)譜的高選擇性、高靈敏度及能夠提供相對分子質(zhì)量與結(jié)構(gòu)信息的優(yōu)點(diǎn)，實(shí)現(xiàn)了色譜與質(zhì)譜的優(yōu)勢互補(bǔ)。液質(zhì)聯(lián)用能夠推斷藥物中雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)［1］，確證同分異構(gòu)體雜質(zhì)［2］，確認(rèn)差向異構(gòu)體雜質(zhì)［3］，同時(shí)能夠快速發(fā)現(xiàn)藥物中的痕量雜質(zhì)，在化學(xué)藥雜質(zhì)研究中被廣泛應(yīng)用。人用藥品注冊技術(shù)要求國際協(xié)調(diào)會(huì)（International Conference on Harmonization of Technical Requirements for Registration of Pharmamceuticals for Human Use，ICH）制定了一些雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則，這些指導(dǎo)原則有《原料藥、制劑雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則》、《殘留溶劑研究指導(dǎo)原則》、《元素雜質(zhì)研究指導(dǎo)原則》?！睹绹幍洹贰ⅰ稓W洲藥典》、《英國藥典》均在附錄中設(shè)有雜質(zhì)檢查通則，現(xiàn)行版《中國藥典》2015年版第四部也收載了《藥品雜質(zhì)分析指導(dǎo)原則》，并且在2005年我國也頒布了《化學(xué)藥物質(zhì)量控制方法驗(yàn)證技術(shù)指導(dǎo)原則》［4］，這些指導(dǎo)原則對雜質(zhì)分析及毒理學(xué)評價(jià)做了宏觀上的技術(shù)規(guī)范［5］。而雜質(zhì)譜研究強(qiáng)調(diào)對雜質(zhì)研究與控制的全面性、整體性，對各個(gè)雜質(zhì)明確其來源、結(jié)構(gòu)、含量以及生物活性等，根據(jù)以上信息制定合理的限度。本文探討了基于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)的化學(xué)藥雜質(zhì)譜研究，以期為雜質(zhì)譜研究提供參考。

1 化學(xué)藥雜質(zhì)譜控制

化學(xué)藥品中的雜質(zhì)與藥品的安全息息相關(guān)，少數(shù)情況下，雜質(zhì)也與藥品效能有關(guān)，化學(xué)藥品的雜質(zhì)不可能完全消除，但是當(dāng)雜質(zhì)達(dá)到一定量時(shí)便會(huì)產(chǎn)生毒副作用，對人體健康造成損害，因此必須在總體水平上對化學(xué)藥品中的雜質(zhì)進(jìn)行確切評價(jià)，明確其來源、成分結(jié)構(gòu)、毒副作用及其限量，以保證臨床用藥安全有效，保障人民生命健康安全。雜質(zhì)的來源主要包括［6］：藥品生產(chǎn)過程中使用的溶劑、催化劑；藥物合成過程中反應(yīng)不完全而遺留的反應(yīng)原料，初始反應(yīng)物，合成中間體、合成副產(chǎn)物，合成過程中產(chǎn)生的相關(guān)物質(zhì)；藥品貯存、運(yùn)輸過程中的氧化、水解、分解產(chǎn)物；手性化合物中的光學(xué)異構(gòu)體；藥物的多晶型；使用的金屬工具或不耐酸、不耐堿的器皿引入的重金屬及無機(jī)鹽?；瘜W(xué)藥品雜質(zhì)控制是化學(xué)藥品研發(fā)、生產(chǎn)工作的重要組成部分，常見的雜質(zhì)控制方法分為定性和定量方法。定性方法主要有熔點(diǎn)、TLC、旋光度、HPLC、HPLC?MS、NMR 等；定量方法主要有容量法、HPLC、GC、UV、IR、HPCE、HPLC?MS 等。 追溯雜質(zhì)控制理念的變遷，可分為三個(gè)階段：純度控制階段、限度控制階段和雜質(zhì)譜控制階段。早期的雜質(zhì)控制主要依靠化學(xué)分析方法，如容量法、分光光度法。后來，隨著色譜技術(shù)及其他檢測技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用，色譜技術(shù)或者色譜技術(shù)與其他技術(shù)聯(lián)用成為化學(xué)藥雜質(zhì)控制分析的重要分析方法，同時(shí)藥品雜質(zhì)控制是在雜質(zhì)生物學(xué)特性的基礎(chǔ)上得到的雜質(zhì)限量［7］。雜質(zhì)譜控制是雜質(zhì)控制的一個(gè)總體原則，包括藥品中所有雜質(zhì)的種類、來源、含量及結(jié)構(gòu)等信息，通過雜質(zhì)譜分析能夠較為全面地掌握藥品中雜質(zhì)的種類、來源、含量、結(jié)構(gòu)，根據(jù)特定雜質(zhì)選擇合適的分析方法，確保雜質(zhì)能夠有效檢出與定量，同時(shí)根據(jù)雜質(zhì)安全性試驗(yàn)或臨床試驗(yàn)結(jié)構(gòu)評估雜質(zhì)可接受水平，它強(qiáng)調(diào)結(jié)合具體工藝與產(chǎn)品特點(diǎn)以及綜合藥學(xué)、藥理毒理、臨床研究結(jié)果對藥品中所存在的雜質(zhì)進(jìn)行全面地控制，從而保證藥品質(zhì)量的安全性［5］。

2 基于液質(zhì)聯(lián)用的化學(xué)藥雜質(zhì)譜研究思路

雜質(zhì)研究是貫穿于藥品研發(fā)始終的一項(xiàng)重要內(nèi)容。雜質(zhì)譜分析是藥品質(zhì)量控制的重要工作?；陔s質(zhì)譜分析的雜質(zhì)控制是“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”的基本理念在雜質(zhì)研究與控制中的一種具體實(shí)踐［8］。應(yīng)用各國藥典及相關(guān)的雜質(zhì)研究技術(shù)指導(dǎo)原則在具體雜質(zhì)譜研究過程中，應(yīng)充分體現(xiàn)雜質(zhì)的源頭控制、過程控制、終點(diǎn)控制理念，根據(jù)藥品生產(chǎn)過程中的原料、輔料、工藝等要素，探究藥物制劑中可能存在的雜質(zhì)，并對雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進(jìn)行確證，根據(jù)毒理實(shí)驗(yàn)和藥品安全進(jìn)行雜質(zhì)限度確認(rèn)［9］。國家藥品審評中心（center for drug evaluation，CDE）要求新藥、仿制藥申報(bào)時(shí)，必須提供雜質(zhì)譜研究資料。在通用技術(shù)文件（common techni?cal document，CTD）中，整體性雜質(zhì)研究方面，要求申報(bào)單位必須包含以下內(nèi)容：產(chǎn)品中可能存在的雜質(zhì)及來源；對已知雜質(zhì)能給出結(jié)構(gòu)并提供結(jié)構(gòu)確證圖譜；雜質(zhì)名稱、結(jié)構(gòu)、來源、控制限度以及是否定入質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?；谝嘿|(zhì)聯(lián)用的化學(xué)藥雜質(zhì)譜研究，應(yīng)不僅能檢出樣品中已有的雜質(zhì)，還能有效檢出潛在的雜質(zhì)，并能對雜質(zhì)進(jìn)行定性，最終根據(jù)不同雜質(zhì)的來源及生物活性、毒理等方面特性制定相應(yīng)的質(zhì)控限度。

2.1 基于雜質(zhì)研究方面的文獻(xiàn)資料調(diào)研 雜質(zhì)前期研究的信息獲取主要是文獻(xiàn)資料調(diào)研，主要的文獻(xiàn)資料有美國食品藥品監(jiān)督管理局（The Food and Drug Administration，F(xiàn)DA），歐洲藥品管理局（European Medicines Agency，EMA），日本醫(yī)藥品醫(yī)療器械綜合機(jī)構(gòu)（Pharmaceuticals and Medical Divices Agency，PMDA）公開的資料、專利和文章。一般是從原料藥合成路線、主藥的理化性質(zhì)、穩(wěn)定性影響因素、主藥雜質(zhì)產(chǎn)生的原因及主要的降解產(chǎn)物、處方條件和生產(chǎn)工藝、輔料是否影響主要成分的穩(wěn)定性等方面進(jìn)行詳細(xì)的文獻(xiàn)調(diào)研，理論的調(diào)研為其后的整體性、全面性實(shí)踐研究提供指導(dǎo)。

2.2 基于合成路線進(jìn)行工藝雜質(zhì)的分析 藥物在合成過程中，運(yùn)用起始原料、催化劑反應(yīng)得到中間體，也可能會(huì)產(chǎn)生副產(chǎn)物，由中間體與下一個(gè)原料反應(yīng)，得到第二個(gè)中間體，直至得到目標(biāo)化合物。不同的反應(yīng)會(huì)引入不同的雜質(zhì)，或者原料在反應(yīng)過程中反應(yīng)不完全的起始原料、催化劑、起始原料的降解產(chǎn)物、殘留溶劑等，在分離過程中，沒有全部分離干凈，便會(huì)帶入到原料藥中，而用原料藥制備藥物制劑時(shí)，這些雜質(zhì)又會(huì)被帶入藥品中。由于這類雜質(zhì)與藥品活性成分有淵源關(guān)系，因此也通常稱為有關(guān)物質(zhì)，除了降解產(chǎn)物，這些雜質(zhì)也叫工藝雜質(zhì)。分析這一類雜質(zhì)，首先得理解合成反應(yīng)機(jī)理，結(jié)合合成路線推測工藝雜質(zhì)的來源［10］，同時(shí)要注意雜質(zhì)的來源與去向，重點(diǎn)關(guān)注可能引入的潛在雜質(zhì)，由于這類雜質(zhì)與主成分的結(jié)構(gòu)相似，因此其質(zhì)譜裂解規(guī)律與主成分也有相似之處［11］。

2.3 基于結(jié)構(gòu)特征可能產(chǎn)生的降解產(chǎn)物 一個(gè)特定結(jié)構(gòu)的藥物，其對應(yīng)的化學(xué)性質(zhì)行為在一定的外界條件下降解途徑是固定的，如穩(wěn)定性較差或在生產(chǎn)制備過程中容易降解的主藥成分，這類雜質(zhì)通常通過穩(wěn)定性試驗(yàn)和強(qiáng)降解試驗(yàn)手段來確認(rèn)雜質(zhì)，所謂強(qiáng)降解，即將供試品用高溫、高濕、強(qiáng)光照射、酸水解、堿水解以及氧化的方法進(jìn)行破壞，以考察破壞前后雜質(zhì)變化的基本情況。相對于穩(wěn)定性試驗(yàn)，強(qiáng)降解試驗(yàn)?zāi)軌蛟诙虝r(shí)間內(nèi)獲得大量的信息，這類信息主要有降解途徑和降解產(chǎn)物，其為藥品包裝材料和儲(chǔ)藏條件提供依據(jù)，反過來，也指導(dǎo)藥品的生產(chǎn)環(huán)節(jié)。

2.4 基于處方工藝可能引入的雜質(zhì) 處方中涉及輔料有助懸劑、黏合劑、崩解劑、填充劑、著色劑、甜味劑等，在運(yùn)用原料藥和輔料制備藥物制劑的過程中，活性成分、輔料在生產(chǎn)過程以及保存條件下的相容性是處方工藝研究的重要內(nèi)容。如果選擇輔料不慎，也可能加速藥物的降解致使藥物雜質(zhì)增多而影響用藥安全。有時(shí)，輔料對于產(chǎn)品質(zhì)量的影響要比想象的更加嚴(yán)重。另外，某些多晶型的藥物，晶型不穩(wěn)定，在生產(chǎn)過程中，晶型會(huì)發(fā)生變化，導(dǎo)致藥物主成分變質(zhì)，藥效活性降低［12］。

2.5 液質(zhì)聯(lián)用分析方法的驗(yàn)證及雜質(zhì)限度 液質(zhì)聯(lián)用定性定量過程中，影響測定方法的不確定度是多方面的［13］。雜質(zhì)譜分析方法驗(yàn)證的目的是驗(yàn)證所采用的分析方法是否適合相應(yīng)的定性定量要求。驗(yàn)證項(xiàng)目包括精密度、準(zhǔn)確度、檢測限、定量限、專屬性、線性與范圍、耐用性、系統(tǒng)適用性、溶液穩(wěn)定性。一般用于限度試驗(yàn)的方法驗(yàn)證側(cè)重專屬性和檢測限，用于定量試驗(yàn)的方法驗(yàn)證強(qiáng)調(diào)專屬性、準(zhǔn)確度和定量限［14］。人用藥物注冊技術(shù)要求ICH對于每日最大劑量≤2 g的原料藥，雜質(zhì)報(bào)告限度為 0.05%，鑒定限度為0.10%，控制限度為0.15% ；對每日最大劑量＞2 g的原料藥，雜質(zhì)報(bào)告限度為0.03%，鑒定限度為0.05%，控制限度為 0.05%［15］?；瘜W(xué)藥物制劑質(zhì)控限度，每日最大劑量≤10 mg，控制限度為1.0%，每日最大劑量介于10～100 mg，控制限度為0.5%，每日最大劑量為100 mg～2 g，控制限度為 0.2%，每日最大劑量＞2 g，控制限度為 0.15%［16］。 如果雜質(zhì)含量高于ICH的質(zhì)控限度，必須進(jìn)行雜質(zhì)安全性評價(jià)；如果雜質(zhì)含量低于ICH的質(zhì)控限度，首先進(jìn)行構(gòu)效關(guān)系研究，如沒有遺傳毒性警戒結(jié)構(gòu)，符合ICH一般限度就可以，如有遺傳毒性結(jié)構(gòu)，則應(yīng)根據(jù)遺傳毒性試驗(yàn)的結(jié)果確定雜質(zhì)限度。

3 液質(zhì)聯(lián)用在化學(xué)藥雜質(zhì)譜研究中的應(yīng)用進(jìn)展

近幾年，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在化學(xué)藥雜質(zhì)譜分析中的應(yīng)用越來越廣泛，尤其是在原料藥和化學(xué)藥物制劑雜質(zhì)譜分析中，對藥品中存在的已知雜質(zhì)進(jìn)行鑒別，對未知雜質(zhì)進(jìn)行結(jié)構(gòu)推導(dǎo)，然后借助光譜、核磁共振等技術(shù)手段進(jìn)行鑒定。如大環(huán)內(nèi)酯類抗生素是臨床廣泛使用的一類藥物，其組分復(fù)雜，有關(guān)物質(zhì)種類多且化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定，極易產(chǎn)生雜質(zhì)。王明娟等［17］采用串聯(lián)質(zhì)譜法建立了大環(huán)內(nèi)酯類抗生素雜質(zhì)譜的研究思路，并解析了該類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，闡述了基于液質(zhì)聯(lián)用分析方法如何依據(jù)已知組分的質(zhì)譜裂解規(guī)律推導(dǎo)未知化合物的結(jié)構(gòu)。周長朋等［18］基于高效液相色譜?四極桿／線性離子阱質(zhì)譜儀建立了測定鹽酸決奈達(dá)隆中兩種基因毒性雜質(zhì)痕量殘留的分析方法，該方法利用線性離子阱的高分辨質(zhì)譜并結(jié)合對照首次確證了鹽酸決奈達(dá)隆中的兩種導(dǎo)致基因毒性的雜質(zhì)，有利于在鹽酸決奈達(dá)隆合成過程中對該類雜質(zhì)進(jìn)行控制。 楊昊等［19］用 HPLC?ESI?IT?MSn 法研究慶大霉素C1a的雜質(zhì)譜，從慶大霉素C1a原料中檢出13種雜質(zhì)，對其中12種雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了歸屬，結(jié)果顯示，慶大霉素C1a中含有慶大霉素A、B、西索米星、小諾霉素、威達(dá)米星或其同分異構(gòu)體和同系物，并含有慶大霉素C1a和上述雜質(zhì)的降解產(chǎn)物。Zhu等［20］采用LC?MS對多索茶堿藥物中未知雜質(zhì)進(jìn)行研究，推導(dǎo)出其化學(xué)結(jié)構(gòu)，并用高分辨率質(zhì)譜和1D和2D NMR數(shù)據(jù)證實(shí)了該結(jié)構(gòu)。同時(shí)，他們還研究了色甘酸鈉藥物制劑中的相關(guān)物質(zhì)和降解產(chǎn)物，基于質(zhì)譜光譜數(shù)據(jù)和準(zhǔn)確的質(zhì)量測量，對2種未知雜質(zhì)和6種未知降解產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，其中包括歐洲藥典中所列的不純C。此外，還提出了一種合理的降解產(chǎn)物形成機(jī)制［21］。 Kumar等［22］采用高效液相色譜法測定鹽酸異丙烯醇的含量，發(fā)現(xiàn)了一種未知雜質(zhì)，通過LC?MS分析推導(dǎo)這種未知雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，采用半制備液相從雜質(zhì)富集的反應(yīng)粗樣品中分離出這種雜質(zhì)，經(jīng)核磁共振（1H?NMR、13C?NMR、DEPT、HSQC）和紅外光譜（infrared spectroscopy，IR）確證了該雜質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)。Yang等［23］采用液質(zhì)方法確證了輔酶A生產(chǎn)過程產(chǎn)生及主藥降解物產(chǎn)生的10種雜質(zhì)，其中7種雜質(zhì)是首次被發(fā)現(xiàn)的，作者對其中3種未知雜質(zhì)進(jìn)行了合成，并用NMR進(jìn)行了鑒定?？傊?，液質(zhì)聯(lián)用是組分復(fù)雜樣品和微量樣品分離分析的有力研究手段，其對樣品屬性沒有限制，樣品前處理方法簡單，無需化合物有紫外吸收，是化學(xué)藥雜質(zhì)研究的主要方法之一［24］。

4 總結(jié)

藥品中雜質(zhì)是否得到全面準(zhǔn)確的控制直接關(guān)系到藥品的臨床用藥安全性。雜質(zhì)譜分析強(qiáng)調(diào)雜質(zhì)控制的系統(tǒng)性和整體性，通過雜質(zhì)譜分析可以全面掌握雜質(zhì)的種類、結(jié)構(gòu)、來源和限量。雜質(zhì)譜分析遵循“質(zhì)量源于設(shè)計(jì)”，從雜質(zhì)的來源入手，從合成路線工藝、化學(xué)結(jié)構(gòu)、處方工藝等方面進(jìn)行分析，探究藥物中可能存在的副產(chǎn)物、降解物、中間體、溶劑殘留、催化劑殘留等。雜質(zhì)分析方法驗(yàn)證應(yīng)具有針對性和全面性，保證建立的方法能夠全面檢出潛在的雜質(zhì)，防止出現(xiàn)雜質(zhì)漏檢的情況。在應(yīng)用液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行雜質(zhì)譜研究時(shí)，不僅要根據(jù)目標(biāo)化合物的分子量、基質(zhì)、結(jié)構(gòu)等優(yōu)化質(zhì)譜條件，更重要的是有豐富的質(zhì)譜解析知識和經(jīng)驗(yàn)，能夠根據(jù)雜質(zhì)的裂解情況、特征離子推斷雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，并結(jié)合其他檢測方法對雜質(zhì)進(jìn)行鑒定。

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