秀麗莓中鞣花酸的含量測(cè)定和抗氧化活性評(píng)測(cè)及對(duì)接研究

刁玉林,朱冬青,劉 斌

(1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院,北京 100102；2.國(guó)家手性制藥工程技術(shù)研究中心,山東魯南制藥股份有限公司,臨沂 273400)

近年來,人們對(duì)鞣花酸的抗突變、抗癌變作用及其對(duì)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)癌變的抑制作用進(jìn)行了大量研究。在對(duì)鼠和人體組織移植所做的體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中,鞣花酸對(duì)化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)的癌變及其他多種癌變,特別是對(duì)結(jié)腸癌、食管癌、肝癌[1]、肺癌、舌及皮膚腫瘤、乳腺癌[2]及鼻咽癌[3]等有很好的抑制作用。除抗癌作用外,鞣花酸還有抗病毒[4]、抗菌[5]、增強(qiáng)免疫活性[6]、抗增殖活性[7]、DNA損傷活性[8]及抗氧化活性[9]。目前,已有一些鞣花酸的初級(jí)產(chǎn)品面世,效果較好。近年來,互聯(lián)網(wǎng)上廣泛流傳的Graviola因含有鞣花酸,能以104倍的效率殺死癌細(xì)胞,對(duì)乳癌、腸癌、肺癌、前列腺癌、食道癌、宮頸癌、皮膚癌和胰腺癌的治療有明顯效果。已有中國(guó)公司生產(chǎn)Graviola萃取物,產(chǎn)品銷往歐美國(guó)家。值得注意的是,Cozaa G等[10]以Casein kinase 2(CK2)為靶酶,與2 000種天然藥物中的活性成分進(jìn)行分子對(duì)接,發(fā)現(xiàn)鞣花酸是CK2目前已知最強(qiáng)的抑制劑。綜上所述,鞣花酸是一種活性極強(qiáng)的有效成分,研究表明其為某些藥材的主要有效成分,而秀麗莓水煎液中含有大量鞣花酸,提示可將鞣花酸視為秀麗莓指標(biāo)性成分進(jìn)行研究。因此,本實(shí)驗(yàn)開展了秀麗莓中鞣花酸的含量測(cè)定實(shí)驗(yàn),建立了一種高效、準(zhǔn)確的鞣花酸定量方法,可為秀麗莓的進(jìn)一步開發(fā)利用及質(zhì)量控制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。值得注意的是,在原核和真核生物中廣泛存在著一類屬抗氧化蛋白超家族的過氧化物酶(Peroxidase)—Peroxiredoxin (Prx),該抗氧化蛋白在過氧化氫介導(dǎo)的信號(hào)通路調(diào)節(jié)中起重要作用。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中,Prx家族成員能催化細(xì)胞內(nèi)的過氧化氫還原,將其烷化成水和乙醇而清除[11-12]。因此,本研究首次采用計(jì)算機(jī)分子模擬的方法,選取與人類抗氧化活性相關(guān)的蛋白為受體研究對(duì)象,鞣花酸為配體,通過分子對(duì)接模擬,在分子水平上闡述其可能的作用機(jī)制并通過DPPH·抗氧化實(shí)驗(yàn)對(duì)其結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)。

1 含量測(cè)定

1.1儀器與試藥

1.1.1儀器 Waters高效液相色譜儀,配置為：1525型二元高壓梯度泵系統(tǒng),2998型PDA檢測(cè)器,2414型柱溫控制系統(tǒng)和2707型自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)(美國(guó)Waters公司)；BT 25S型1/100 000電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司)；KQ-500DE型超聲波清洗器(昆山超聲儀器有限公司)；龍尼柯UV-2000型紫外分光光度計(jì)(上海龍尼柯儀器有限公司)。

1.1.2試藥 鞣花酸對(duì)照品(南京奧多福尼生物科技有限公司,批號(hào)130412,質(zhì)量分?jǐn)?shù)>99.8%)。乙腈,色譜純(德國(guó)Merck公司)；蒸餾水購(gòu)買于屈臣氏；DPPH·(東京化成公司)；其他試劑為分析純,購(gòu)自北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司。秀麗莓采自青?；ブ鄙?經(jīng)青海省藥品檢驗(yàn)所藏藥室主任羅桂法副主任藥師和北京中醫(yī)藥大學(xué)劉春生教授鑒定為薔薇科懸鉤子屬秀麗莓(RubusamabilisFocke)的干燥莖。

1.2方法與結(jié)果

1.2.1色譜條件與系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 色譜柱：SunFireTMC18色譜柱(150 mm×4.6 mm,5 μm)；流動(dòng)相：乙腈-4 mL·L-1磷酸水溶液(20∶80)；流速：1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：35 ℃。依照上述色譜條件,精密吸取鞣花酸對(duì)照品溶液與供試品溶液各20 μL,進(jìn)樣。色譜圖見圖1。由圖1可知，對(duì)照品溶液和供試品溶液所得色譜圖相應(yīng)位置上,有tR(min)相同的色譜峰,且樣品中主成分色譜峰與其他干擾峰分離良好,無干擾,該方法適用于秀麗莓提取液中鞣花酸的含量測(cè)定。

1.2.2對(duì)照品溶液的制備 精密稱取鞣花酸對(duì)照品適量,加少量DMSO溶解后,加體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇配制成鞣花酸質(zhì)量濃度為20.48 μg·mL-1的溶液,即得。

1.2.3供試品溶液的制備 取秀麗莓細(xì)粉0.4 g,過40目篩,精密稱定,置于100 mL錐形瓶中,精密加入體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇25 mL,稱定質(zhì)量,超聲45 min,靜置,放冷至室溫,再稱定質(zhì)量,用體積分?jǐn)?shù)為60%的甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量,搖勻,以0.45 μm微孔濾膜濾過,得藥材提取液,備用[13]。

圖1HPLC圖

A.對(duì)照品；B.樣品；1.鞣花酸。

Fig.1 HPLC chromatograms

A.reference；B.sample；1.ellagic acid.

1.2.4線性關(guān)系考察 分別精密吸取鞣花酸對(duì)照品溶液4,8,12,16,18和20 μL，注入液相色譜儀,按照1.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定色譜峰峰面積。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)(x)、色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)(y),進(jìn)行線性擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算得鞣花酸回歸方程為：y=4.798 6×106x+163 838.771 9(r=0.999 7,n=6),結(jié)果表明,鞣花酸質(zhì)量在0.081 92～0.409 60 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.5精密度考察 分別精確移取供試品溶液20 μL,連續(xù)進(jìn)樣6次,測(cè)定色譜峰峰面積,計(jì)算得色譜峰峰面積RSD值為0.99%(n=6),結(jié)果表明,該方法精密度良好。

1.2.6重復(fù)性考察 精密稱取同一秀麗莓細(xì)粉6份,每份0.4 g,按照1.2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液,精確移取各樣品提取液20 μL,注入液相色譜儀,測(cè)定每份藥材中的鞣花酸的色譜峰峰面積,最終計(jì)算得鞣花酸的平均含量為0.080 98%(RSD值為0.92 %),結(jié)果表明,該方法重復(fù)性良好。

1.2.7穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取1.2.3項(xiàng)下制備的試品溶液,室溫下靜置,分別于制備后0,2,4,6和8 h精確取樣20 μL,注入液相色譜儀,測(cè)定各時(shí)間點(diǎn)處對(duì)應(yīng)的鞣花酸色譜峰峰面積,計(jì)算RSD值為1.18%。結(jié)果表明,供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.2.8加樣回收率實(shí)驗(yàn) 精密稱取已知含量的秀麗莓細(xì)粉(鞣花酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.080 98%)6份,每份0.2 g,分別置于25 mL錐形瓶中,加入7.5 mL質(zhì)量濃度為20.48 μg·mL-1的鞣花酸對(duì)照品溶液。按照1.2.3項(xiàng)下方法制得加樣回收率測(cè)定溶液,精密吸取上述溶液20 μL,注入液相色譜儀,測(cè)定色譜峰峰面積并計(jì)算鞣花酸的含量和加樣回收率。最終計(jì)算得鞣花酸的平均回收率為99.51%,RSD值為2.00%。結(jié)果見表1。

表1鞣花酸回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

Tab.1 Results of the recovery test of ellagic acid

樣品稱樣量/mg樣品鞣花酸含量/μg添加鞣花酸量/μg測(cè)得鞣花酸總量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%215.2174.269153.569320.84397.8799.512.00216.1174.998153.569323.63598.50214.6173.783153.569325.03999.29206.6167.305153.569328.580102.40204.8165.847153.569324.005101.44222.8180.423153.569325.75397.53

1.2.9樣品測(cè)定 精密稱取秀麗莓細(xì)粉3份,每份0.45 g,分別置于25 mL錐形瓶中,按照1.2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液。分別精密吸取上述待測(cè)樣品溶液和對(duì)照品溶液20和10 μL,注入液相色譜儀,測(cè)定色譜峰峰面積,采用外標(biāo)一點(diǎn)法計(jì)算鞣花酸的含量,測(cè)得3批藥材中鞣花酸的含量分別為0.802 7‰(RSD=0.99%),0.783 8‰(RSD=0.82%)和0.785 9‰(RSD=2.25%),平均含量為0.790 8‰,提示該藥材中含有大量的鞣花酸。

2 分子模擬

2.1軟件與算法 Discovery Studio 3.5軟件,首先以LigandFit算法初步篩選適合該化合物的受體蛋白,再以CDOCKER算法分析其可能的作用機(jī)制,最終以TOPTAK模塊計(jì)算化合物的毒理學(xué)數(shù)據(jù),對(duì)化合物進(jìn)行全面評(píng)估。

2.2方法與結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)選取在Protein Data Base

(PDB)數(shù)據(jù)庫(kù)中全部與人體內(nèi)抗氧化活性相關(guān)的PrxⅠ、PrxⅡ(包括屬于Ahpc/TSA系的Alkyl hydroperoxide reductase subunit C與同屬于Ahpc/TSA系,TDXH亞系的Probable peroxiredoxin)、Prx Ⅳ及PrxⅤ下的若干蛋白為受體研究對(duì)象,見表2。以鞣花酸為配體,通過LigandFit法對(duì)以上受體進(jìn)行活性初篩。

表2受體選擇結(jié)果

Tab.2 Selected results of receptors

蛋白系PDB蛋白圖庫(kù)編碼PrxⅠ1QQ2,2RⅡ,2Z9S,3HY2Alkylhydroper-oxidereductasesubunitC1N8J,1TP9,1YEP,1YEX,1YF0,1YF1,2BMX,3EMP,4G2EProbableperox-iredoxin1X0R,1ZOF,2CV4,2E2G,2E2M,2NVL,2ZCT,3A2V,3A2W,3A2X,3A5WPrxⅣ2pn8,3TJB,3TJF,3TJG,3TJJ,3TJK,3TKP,3TKQ,3TKR,3TKS,3VWU,3VWV,3W8JPrxⅤ1H4O,1HD2,1OC3,1URM,2VL2,2VL3,2VL9,3MNG

在LigandFit實(shí)驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上,對(duì)各蛋白與配體集中化合物的結(jié)合情況進(jìn)行打分評(píng)價(jià),根據(jù)一致性評(píng)分(Concensus percentage)由高至低排列篩選,最終確定結(jié)合最優(yōu)的受體蛋白為1URM(Concensus percentage=100),選取維生素C為陽性對(duì)照藥物,以Prx Ⅳ系中的1URM蛋白為受體,進(jìn)行模擬計(jì)算后所得結(jié)果見圖2。

圖2分子模擬結(jié)果示意圖

A.1URM蛋白結(jié)構(gòu)及作用空腔位置；B.陽性藥維生素C與蛋白結(jié)構(gòu)堿基空間作用；C.鞣花酸與蛋白結(jié)構(gòu)堿基空間作用。

Fig.2 The sketch map of the results of molecular simulation

A.the structure of protein 1URM and the effective cavity position；B.the dimensional effects between positive drug,vitamin C and basic groups of protein；C.the dimensional effects between ellagic acid and basic groups of protein.

分析發(fā)現(xiàn),受體蛋白A鏈上的Arg86堿基的HH21位點(diǎn)與陽性藥維生素C通過1位羰基上的氧原子間(XYZ：22.956,45.244,18.544；鍵長(zhǎng)1.991 74 ?；Donator Hydrogen Acceptor(DHA)角141.869°；Hydrogen Acceptor Y-axis(HAY)角117.172°)；2位-OH上的氫原子與A鏈上Glu91堿基的OE1位點(diǎn)間(XYZ：22.714,41.389,15.748；鍵長(zhǎng)2.262 86 ?；DHA角 127.198°；HAY角106.207°)；3位-OH上的氫原子與A鏈上Glu91堿基的OE1位點(diǎn)間(XYZ：21.934,40.794,15.855；鍵長(zhǎng)2.121 26 ?；DHA角 118.012°；HAY角101.376°)及6位-OH上的氫原子與A鏈上82位甘氨酸骨架酰胺上的氧原子間(XYZ：21.555,43.157,22.052；鍵長(zhǎng)2.192 49 ?；DHA角 144.639°；HAY角124.388°)之間形成共4個(gè)氫鍵而與受體蛋白相結(jié)合,最終起相應(yīng)的抗氧化作用。

鞣花酸與該蛋白相互作用主要通過氫鍵及π-π相互作用實(shí)現(xiàn)：通過3位的-OH上的氫原子與受體蛋白A鏈上的82位甘氨酸骨架酰胺上的氧原子間(XYZ：21.594,43.24,22.05；鍵長(zhǎng)2.132 29 ?；DHA角 129.146°；HAY角121.32°)；受體蛋白A鏈上的Arg86堿基HH21位與4位的氧原子間(XYZ：22.675,44.841,18.553；鍵長(zhǎng)2.435 69 ?；DHA角145.334°；HAY角114.141°)；受體蛋白A鏈上的Gly92堿基HN位與10位羰基上的氧原子間(XYZ：19.827,38.584,15.479；鍵長(zhǎng)2.285 29 ?；DHA角 143.958°；HAY角108.646°)形成氫鍵。同時(shí),7,8-二羥基所在苯環(huán)與受體蛋白A鏈上的Arg95堿基NE位間(XYZ：18.889,43.08,13.577；鍵長(zhǎng)4.650 74 ?)；10位羰基所在的苯環(huán)與受體蛋白A鏈上的Arg95堿基NE位間(XYZ：18.527,42.183,14.311；鍵長(zhǎng)4.657 09 ?)均存在π-π相互作用,最終共同作用于該蛋白,起相應(yīng)抗氧化效果。鞣花酸可與受體蛋白間形成3個(gè)氫鍵及2個(gè)π-π相互作用鍵。綜合考慮鍵長(zhǎng)、鍵的類型與數(shù)量等因素后認(rèn)為,鞣花酸的抗氧化活性較陽性藥維生素C強(qiáng)。

經(jīng)計(jì)算,鞣花酸在全部模型中的有效可信結(jié)果為：①在NTP數(shù)據(jù)集中的雌性小鼠致癌率為0,即不致癌；②致突變性(Ames Mutagenicity)比例為0；③大鼠口服LD50值：Computed Rat Oral LD50Log (1/Moles)=2.183；Computed Rat Oral LD50=2.0 g·kg-1；Lower 95% Confidence Limits=327.7 mg·kg-1；Upper 95% Confidence Limits=10 g·kg-1；④大鼠長(zhǎng)期口服最低毒性和不良反應(yīng)水平(Lowest Observed Adverse Effect Level,LOAEL)：Computed Chronic LOAEL Log (1/Moles)=3.052；Computed Chronic LOAEL=268.1 mg·kg-1；Lower 95% Confidence Limits=51.0 mg·kg-1；Upper 95% Confidence Limits=1.4 g·kg-1；⑤皮膚刺激性(Skin Irritancy)：可能性為0,即無皮膚刺激性；⑥眼刺激性(Ocular Irritancy SEV vs MOD)可能性為0,即無眼刺激性。

3 抗氧化活性測(cè)定

3.1儀器與試藥 與1.1項(xiàng)下相同。

3.2方法與結(jié)果

3.2.1溶液的配制 DPPH·溶液的配制：取DPPH· 1 mg溶于20 mL無水乙醇中,超聲5 min,充分振搖使混勻，即得。取1 mL DPPH·溶液,在519 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)。該DPPH·溶液避光保存,3.5 h內(nèi)用完。

樣品溶液的配制：樣品以合適的溶劑溶解,為便于計(jì)算,可配成與陽性藥效果近似的質(zhì)量濃度。溶劑根據(jù)樣品的極性進(jìn)行選擇,如不溶可用DMSO助溶。

3.2.2數(shù)值的測(cè)定A0值的測(cè)量：取3.2.1項(xiàng)下制備的DPPH·溶液2 mL,置于小試管或玻璃瓶中,加甲醇1 mL,混勻,在519 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)0(A0多在0.7～0.9之間)。A值的測(cè)量：取3.2.1項(xiàng)下制備的DPPH·溶液2 mL,加入小試管或玻璃瓶中,加樣品溶液xμL,再加(1 000-x)μL甲醇,混勻,靜置30 min后,在519 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值A(chǔ)。

3.2.3實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果 本實(shí)驗(yàn)選取維生素C為陽性藥物對(duì)照,精密稱定2.0 mg維生素C,以甲醇為溶劑配制成25 mL的儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為80 μg·mL-1),依次取該溶液40,80,120,160,200,240,280和320 μL,加入甲醇分別定容至體積為1 mL后，按照3.2.1和3.2.2項(xiàng)下方法進(jìn)行測(cè)定。各樣品均配制成質(zhì)量濃度為1 mg·mL-1的溶液,以相同方法測(cè)定,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3～4。

表3陽性藥維生素C的DPPH·抗氧化活性

Tab.3 The anti-oxidation effect of the positive drug vitamin C by DPPH· method (n=3)

表4鞣花酸的DPPH·抗氧化活性

Tab.4 The anti-oxidation effect of ellagic acid by DPPH· method (n=3)

根據(jù)以上數(shù)據(jù),計(jì)算維生素C與鞣花酸的IC50值分別為8.881和3.371 μg·mL-1,可見鞣花酸的抗氧化能力為維生素C的2.6倍,與預(yù)測(cè)結(jié)果一致。

4 討論

藏藥秀麗莓為懸鉤子屬植物,該屬植物化學(xué)成分的系統(tǒng)研究始于20世紀(jì)70年代末80年代初,迄今為止,國(guó)內(nèi)外學(xué)者已從該屬30余種植物中分離得到多種化學(xué)成分,主要包括黃酮、萜、鞣質(zhì)、甾以及少量醌、有機(jī)酸、生物堿等[14]。該藥材具有清熱解毒和提高機(jī)體免疫的作用,在藏醫(yī)治療感冒、發(fā)燒、咳嗽、瘟熱病的方中,常單獨(dú)或配伍其他藥組成清熱解毒方使用[15]。目前臨床多用于預(yù)防和治療流感、肺熱咳嗽、氣喘和胃潰瘍等,療效確切可靠[16]。本課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)秀麗莓提取物中含有大量酚酸[17-18]及糖[19]類成分,提示該藥材的臨床療效極有可能與此類物質(zhì)有關(guān)?；谝陨蠈?shí)驗(yàn)結(jié)果,本實(shí)驗(yàn)建立了秀麗莓中鞣花酸的HPLC含量測(cè)定方法及其抗氧化活性研究。

4.1含量測(cè)定 鞣花酸的回歸方程為y=4.798 6×106x+163 838.771 9(r=0.999 7,n=6),在0.081 92～0.409 60 μg質(zhì)量范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,精密度RSD=0.99%(n=6),8 h內(nèi)測(cè)定峰面積RSD值為1.18%,重復(fù)性考察RSD=0.92%(n=6),平均加樣回收率為99.51%(RSD=2.00 %,n=6)。結(jié)果表明,該方法操作簡(jiǎn)便,測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、重復(fù)性好,適用于秀麗莓中該成分含量的測(cè)定。按照該方法對(duì)3份藥材進(jìn)行測(cè)定,最終測(cè)得藥材中鞣花酸的平均含量為0.790 8‰。

4.2分子模擬 本實(shí)驗(yàn)證明秀麗莓水煎液中的鞣花酸可通過結(jié)構(gòu)中的酚羥基以氫鍵、苯環(huán)經(jīng)π-π鍵作用的方法與受體蛋白的氨基結(jié)合起效。結(jié)果顯示,該成分具有較維生素C更強(qiáng)的抗氧化活性,同時(shí)結(jié)合TOPTAK毒性預(yù)測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn),鞣花酸無致癌、致突變性且對(duì)眼無刺激性。結(jié)果表明,開發(fā)秀麗莓的保健活性應(yīng)主要從秀麗莓小分子中的抗氧化活性成分——鞣花酸開展。

4.3抗氧化活性的測(cè)定 經(jīng)檢測(cè)鞣花酸抗氧化活性較陽性藥物維生素C強(qiáng)2.6倍,從而驗(yàn)證了LigandFit初步篩選結(jié)果的準(zhǔn)確性與CDOCKER機(jī)制解釋的可信性,從而證明鞣花酸可能為該植物中最重要的抗氧化活性成分。

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)通過有機(jī)結(jié)合含量測(cè)定、計(jì)算機(jī)分子模擬及體外抗氧化活性評(píng)價(jià),對(duì)秀麗莓水煎液中的鞣花酸進(jìn)行研究,該結(jié)果可為藏藥秀麗莓中抗氧化成分鞣花酸的含量檢測(cè)及質(zhì)量控制提供依據(jù),也可為民族藥物的進(jìn)一步開發(fā)提供新思路。

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