脂肪血管基質(zhì)組分獲取方法及臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展

孫思捷 綜述 王克明 馬繼光 審校

【提要】 脂肪血管基質(zhì)組分（Stromal vascular fraction，SVF）是抽脂脂肪去除成熟脂肪細(xì)胞后剩余的多種細(xì)胞及基質(zhì)成分的組合，主要包含脂肪來源干細(xì)胞（Adipose-derived stem cells，ADSCs）、造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。其中，ADSCs具有多向分化潛能，并可分泌多種細(xì)胞因子，在組織再生及修復(fù)中具有重要作用。SVF的獲取方法主要包括酶消化法與機(jī)械乳化法，但獲取標(biāo)準(zhǔn)尚未達(dá)成共識(shí)。SVF已廣泛應(yīng)用于輔助脂肪移植、面部年輕化、瘢痕及脫發(fā)治療等整形外科領(lǐng)域，也可應(yīng)用于放射性損傷、骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病等疾病的治療。目前關(guān)于SVF的安全性及臨床效果仍存爭(zhēng)議，需要基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床研究探索SVF的最佳獲取方法及作用機(jī)制，提高SVF臨床使用的安全性和療效，并進(jìn)一步擴(kuò)大應(yīng)用。

自Coleman等[1]將脂肪移植技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)化后，臨床上脂肪移植的開展日趨廣泛，但移植后脂肪壞死吸收是臨床遇到的關(guān)鍵問題。Zuk 等[2]對(duì)發(fā)現(xiàn)了脂肪來源干細(xì)胞（ADSCs），ADSCs主要分布在脂肪細(xì)胞外基質(zhì)中，是間葉組織來源的成體干細(xì)胞，具有多向分化潛能，并可分泌諸多細(xì)胞因子 （bFGF、IGF-1、PDGF和VEGF等）。但ADSCs在體外分離、純化、擴(kuò)增后再移植，其過程繁瑣、費(fèi)用昂貴，且安全性難以保證。將脂肪組織中的成熟脂肪細(xì)胞去除后可得到基質(zhì)血管組分 （Stromal vascular fraction，SVF），其中除了約2%～10%的ADSCs外，還包含造血干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞等細(xì)胞組分及細(xì)胞外基質(zhì)。SVF保留了ADSCs在組織再生及修復(fù)中的作用。研究認(rèn)為，SVF中包含多種細(xì)胞成分且便于獲取，應(yīng)用效果優(yōu)于ADSCs[3-6]。目前，獲取SVF的方法尚未達(dá)成共識(shí)，主要為酶消化法與機(jī)械乳化法，更加安全、便捷、經(jīng)濟(jì)的方法仍在探索中。近年來，SVF已廣泛應(yīng)用于脂肪移植、皮膚年輕化、促進(jìn)毛發(fā)再生及瘢痕修復(fù)等方面，也應(yīng)用于放射性損傷、骨關(guān)節(jié)炎、糖尿病等疾病的治療，但具體的作用機(jī)制尚未闡明，臨床效果也有待進(jìn)一步證實(shí)。本文就SVF的獲取方法及其臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 SVF獲取方法

1.1 酶消化法

酶消化法是使用蛋白酶消化抽脂獲得的脂肪，破壞細(xì)胞外基質(zhì)中的膠原纖維，得到含有不同細(xì)胞組分的基質(zhì)液，再經(jīng)離心或過濾及靜置，得到的最下層沉淀即為SVF[3，7]。

為了簡(jiǎn)化術(shù)中操作，可自動(dòng)采用酶消化法處理脂肪以獲取SVF[8-9]。Aronowitz等[10]對(duì)比了四種常用儀器的處理效果，發(fā)現(xiàn)其處理時(shí)間都在88～115 min左右，其中Celution System儀器處理抽脂脂肪后得到的SVF中干細(xì)胞數(shù)量最多，殘余的蛋白酶最少，且其自動(dòng)化程度最高。但該設(shè)備較為昂貴，國(guó)內(nèi)目前尚無相關(guān)的應(yīng)用報(bào)道。

近來有研究報(bào)道了另一種酶消化法，并將獲取的SVF稱為納米活性脂肪（Vivo nanofat）[11]：使用濃度為 0.2 mg/mL 的蛋白酶處理脂肪，在37℃孵育15 min，330 r/min離心7 min，將得到的脂肪組織用0.6 mm過濾篩過濾，即得到納米活性脂肪。該方法使用的酶濃度小于分離ADSCs時(shí)的濃度，孵育時(shí)間短于一般的孵育時(shí)間，減少了對(duì)細(xì)胞的損傷，除了能保留干細(xì)胞外，較小的早期分化的脂肪細(xì)胞也得到保護(hù)，只破壞了終末分化的較大的成熟脂肪細(xì)胞。有研究證實(shí)，已分化的脂肪細(xì)胞可促進(jìn)脂肪干細(xì)胞的分化或增殖，并刺激其分泌細(xì)胞因子，進(jìn)而提高移植脂肪組織的成活率[12]。

1.2 機(jī)械乳化法

2013年，Tonnard等[14]提出了機(jī)械乳化法：將1 mm孔徑抽脂針抽到的微小顆粒經(jīng)注射器快速對(duì)打30次，即機(jī)械乳化。該過程破壞了脂肪中的成熟脂肪細(xì)胞，再將得到的脂肪乳化液過濾，最終成分被稱為納米脂肪（Nanofat）。與酶消化法相比，該方法可節(jié)約手術(shù)時(shí)間和成本，便于臨床應(yīng)用，目前已在國(guó)內(nèi)外得到推廣。納米脂肪與SVF的成分基本一致，但多了死亡的脂肪細(xì)胞碎片，會(huì)引起局部炎癥反應(yīng)，輕度炎癥反應(yīng)中巨噬細(xì)胞局部浸潤(rùn)，清除細(xì)胞碎片的同時(shí)還分泌bFGF等細(xì)胞生長(zhǎng)因子，刺激脂肪干細(xì)胞增殖分化，有利于血管生成及移植物存活[15]。但大量死亡細(xì)胞碎片是否會(huì)引發(fā)較重的炎癥反應(yīng)，降低移植脂肪成活率，仍存在爭(zhēng)議[16]。去除死亡細(xì)胞碎片需要相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)技術(shù)和設(shè)備，耗時(shí)且昂貴，目前在臨床中難以實(shí)現(xiàn)。

Lo Furno等[17]提出在Tonnard法基礎(chǔ)上，只進(jìn)行機(jī)械乳化而不過濾，得到的樣本稱作nanofat 2.0。該方法減少了過濾對(duì)細(xì)胞的破壞，得到ADSCs濃度更高的SVF，并可減少脂肪污染的風(fēng)險(xiǎn)，保證移植物的安全性。

Raposio等[18]也提出了一種機(jī)械乳化的方法，即在超凈臺(tái)上將注射器中的脂肪注射入10 mL試管中，使用振動(dòng)篩振搖，然后離心，得到的底層基質(zhì)液即為SVF，用自動(dòng)移液管將SVF移回注射器進(jìn)行脂肪移植。Chaput等[19]對(duì)比Raposio法與Tonnard法，發(fā)現(xiàn)Raposio法得到的脂肪乳化液中成纖維細(xì)胞集落形成單位 （Colony forming unit-fibroblast，CFU-F）數(shù)量較少，說明ADSCs的增殖分化能力較差，且Raposio法較繁瑣，轉(zhuǎn)移抽脂脂肪的過程易造成污染；此外，Raposio與Tonnard的機(jī)械乳化法均比酶消化法得到的SVF中的ADSCs數(shù)量少10～12倍，細(xì)胞因子數(shù)量也隨之減少。

Pallua等[20]在Tonnard法的基礎(chǔ)上提出了一種可提高SVF中ADSCs濃度的方法：將脂肪離心，棄去最上層的油脂相及最下層的腫脹液等，將中間的脂肪組織按照Tonnard法進(jìn)行機(jī)械乳化，得到的納米脂肪再離心，棄去最上層的油脂相及最下層的基質(zhì)液等水分，中間的細(xì)胞成分被命名為L(zhǎng)ipoconcentrate，通過流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù)發(fā)現(xiàn)Lipoconcentrate比Tonnard法獲取的Nanofat中的細(xì)胞濃度提高約60%（P＜0.01），其中ADSCs濃度是未經(jīng)處理的脂肪中的4倍。該方法去除了Nanofat中的油脂及水分，減少了移植物量且提高了干細(xì)胞濃度，更適合應(yīng)用于不需要增加組織體積或局部皮膚張力較大的情況，如皮膚年輕化或促進(jìn)毛發(fā)生長(zhǎng)等。

Akgul等[21]認(rèn)為，SVF中由脂肪細(xì)胞破裂釋放出的油脂成分，可以促進(jìn)炎癥反應(yīng)發(fā)生及細(xì)胞因子分泌，為干細(xì)胞分化及膠原纖維生成提供有利環(huán)境。Akgul等按照Tonnard法對(duì)抽脂脂肪進(jìn)行機(jī)械乳化后離心，將得到的上層油脂成分加入到下層SVF中，分別得到含有5%、10%、15%油脂成分的SVF，并移植到裸鼠背部皮下，45 d后對(duì)比移植物組織學(xué)形態(tài)，發(fā)現(xiàn)含有約10%油脂成分的SVF移植效果最好。但該實(shí)驗(yàn)是通過裸鼠完成，當(dāng)油脂成分注射于人體皮下或皮內(nèi)組織時(shí)可能被巨噬細(xì)胞等清除而無法發(fā)揮作用，因此需要相關(guān)臨床實(shí)驗(yàn)證明其作用及術(shù)后效果。

2 SVF的臨床應(yīng)用

2.1 SVF應(yīng)用于脂肪移植

移植后的脂肪由于血管尚未形成，相對(duì)缺血，導(dǎo)致脂肪移植物存活能力下降而被吸收[22]。SVF中的ADSCs可增殖并分化為成熟脂肪細(xì)胞，同時(shí)ADSCs分泌的VEGF可促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞分化為內(nèi)皮細(xì)胞，參與新生血管形成，使移植脂肪中血管數(shù)量增加，從而提高移植脂肪成活率[23-24]。

傳統(tǒng)的自體脂肪移植技術(shù)是將抽脂獲得的脂肪組織經(jīng)清洗，或再經(jīng)離心后直接注射入移植處。Matsumoto等[25]首次提出了細(xì)胞輔助脂肪移植 （Cell-assisted lipotransfer，CAL）技術(shù)。CAL技術(shù)將抽脂脂肪分為兩部分，一部分是通過傳統(tǒng)的方法獲取移植脂肪顆粒，另一部分是將抽脂脂肪經(jīng)膠原酶消化并離心后得到SVF，將所得SVF加入脂肪顆粒中共同注射入移植處。他們發(fā)現(xiàn)，CAL組的移植脂肪成活率比對(duì)照組平均高35%。之后，Yoshimura等[26]對(duì)40例采用CAL技術(shù)進(jìn)行乳房脂肪填充的患者進(jìn)行6個(gè)月的術(shù)后隨訪，發(fā)現(xiàn)患者乳頭平面的胸圍平均增加約4～8 cm，且外形自然無硬結(jié)形成，術(shù)后效果滿意。Zhou等[27]系統(tǒng)回顧了387例脂肪移植術(shù)，發(fā)現(xiàn)CAL組的移植脂肪成活率明顯高于對(duì)照組 （60%vs.45%），尤其在面部脂肪移植中，移植脂肪的存活率提高了19%，而乳房脂肪移植存活率僅提高9%。但CAL技術(shù)的臨床效果仍存在爭(zhēng)議，Grabin等[28]對(duì)CAL技術(shù)進(jìn)行了系統(tǒng)回顧，分析認(rèn)為CAL技術(shù)較傳統(tǒng)的脂肪移植效果并無明顯優(yōu)勢(shì)，且在安全性方面值得考慮。目前仍需要更多的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)及臨床研究，以探索SVF中的不同組分在移植脂肪中發(fā)揮作用的機(jī)制。

2.2 SVF應(yīng)用于皮膚年輕化

衰老皮膚中的膠原纖維合成減少、彈性纖維變性以及血管老化，導(dǎo)致皮膚松弛及彈性下降[29]。Mojallal等[30]發(fā)現(xiàn)脂肪移植后的小鼠真皮厚度增加約1倍 ，主要是細(xì)胞外基質(zhì)中增加了大量的Ⅰ型膠原纖維及少量Ⅴ、Ⅵ型膠原纖維。Charlesdes等[31]觀察注射SVF后耳前皮膚的組織形態(tài)學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)真皮乳頭層彈性纖維變性減少，新生彈性纖維及新生血管增加。

色素沉著是皮膚衰老的另一表現(xiàn)。黑素細(xì)胞將酪氨酸轉(zhuǎn)化為黑色素，酪氨酸酶是該過程的主要限速酶，而ADSCs分泌的TGF-β1可下調(diào)該酶的活性，抑制黑色素合成[32]。Chang等[33]將SVF注射到小鼠耳背部皮內(nèi)后使用紫外線照射，可觀察到實(shí)驗(yàn)組相比于對(duì)照組，其皮膚黑色素合成減少。

2.3 SVF促進(jìn)毛發(fā)再生

毛發(fā)的生長(zhǎng)呈現(xiàn)周期性，由毛囊周期決定，分為生長(zhǎng)期、退行期及休止期，休止期的毛發(fā)易脫落，正常成年人至少80%的頭皮毛囊處于生長(zhǎng)期，衰老、遺傳、內(nèi)分泌失調(diào)、精神壓力等眾多原因會(huì)導(dǎo)致毛囊從生長(zhǎng)期提前進(jìn)入退行期及休止期，形成脫發(fā)。毛囊干細(xì)胞可調(diào)控毛囊周期使休止期的毛囊重新進(jìn)入生長(zhǎng)期，未成熟脂肪細(xì)胞分泌的PDGF可提高毛囊干細(xì)胞活性，刺激毛囊由休止期進(jìn)入生長(zhǎng)期[34]。研究發(fā)現(xiàn)，皮內(nèi)脂肪細(xì)胞層在毛囊生長(zhǎng)活躍期較厚，而在毛囊生長(zhǎng)休止期較薄，若減少轉(zhuǎn)基因小鼠的皮內(nèi)脂肪組織厚度，會(huì)導(dǎo)致其皮膚結(jié)構(gòu)及功能紊亂，出現(xiàn)毛發(fā)脫落、皮脂腺分泌異常等，進(jìn)而證明脂肪細(xì)胞在調(diào)節(jié)皮膚毛囊功能中發(fā)揮重要作用。由于SVF較傳統(tǒng)的脂肪移植物體積小了許多，且流動(dòng)性與可塑性強(qiáng)，因此更適合注射于頭皮內(nèi)等張力較高的皮膚組織處[35]。Fukuoka等[36]報(bào)道了一項(xiàng)臨床研究，對(duì)22例脫發(fā)患者進(jìn)行頭皮內(nèi)SVF注射，經(jīng)過6個(gè)月的治療，患者頭發(fā)密度明顯提高，鏡下觀察發(fā)現(xiàn)單位視野內(nèi)男性頭發(fā)平均增加29根，女性平均增加15.6根。目前仍需探究SVF針對(duì)不同原因所致脫發(fā)的療效是否一致，以確定SVF治療的適應(yīng)證。

2.4 SVF促進(jìn)瘢痕修復(fù)

SVF中的ADSCs可調(diào)節(jié)血管密度、肉芽組織的形成及膠原纖維的厚度，從而改善瘢痕外觀[37]。Jan等[38]發(fā)現(xiàn)，注射SVF對(duì)減輕瘢痕色素沉著及降低瘢痕硬度最為有效，對(duì)瘢痕厚度及凸起程度改善不明顯。Uyulmaz等[39]對(duì)52名患者進(jìn)行術(shù)后隨訪發(fā)現(xiàn)，注射SVF后的瘢痕明顯變?nèi)彳?，且色素沉著減輕，術(shù)后滿意度高。但因SVF中富含細(xì)胞生長(zhǎng)因子，Vallejo等[40]認(rèn)為其應(yīng)用于惡性腫瘤切除術(shù)后的安全性難以保證，可能導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)。

2.5 其他應(yīng)用

SVF具有促進(jìn)血管生成、增加成纖維細(xì)胞活性及減輕炎癥反應(yīng)的作用，可應(yīng)用于各種組織損傷后修復(fù)，包括皮膚燒傷、皮膚放射性損傷、糖尿病足等[41-44]。基于SVF中ADSCs的多向分化潛能及其調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的作用，已將SVF應(yīng)用于其他領(lǐng)域，包括骨缺損修復(fù)、神經(jīng)損傷修復(fù)[45-47]及炎癥性疾病（如克羅恩病、慢性骨關(guān)節(jié)炎等）[48-49]。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，SVF在臨床已得到廣泛應(yīng)用，其中的ADSCs具有多向分化潛能，并可分泌多種細(xì)胞因子，在組織再生及修復(fù)中具有重要作用，有著良好的應(yīng)用前景。目前，仍存在以下問題有待研究。①需改進(jìn)現(xiàn)有方法并繼續(xù)尋找更為安全、便捷、經(jīng)濟(jì)的SVF獲取方法，提高其中ADSCs數(shù)量及活性[50]。現(xiàn)有方法中，酶消化法獲取的ADSCs數(shù)量較多，但操作繁瑣、花費(fèi)昂貴，殘余的蛋白酶還可能引起機(jī)體免疫排斥，帶來安全隱患[13，51]；機(jī)械乳化法便于操作，但所得ADSCs數(shù)量較少且含有大量死亡細(xì)胞碎片，細(xì)胞碎片及油脂成分可能會(huì)引發(fā)較重的局部炎癥反應(yīng)，降低移植脂肪成活率[16]，關(guān)于死亡細(xì)胞碎片的利弊及去除死亡細(xì)胞的必要性仍有待研究[52]。②SVF中細(xì)胞生長(zhǎng)因子刺激細(xì)胞增殖分化可能導(dǎo)致腫瘤復(fù)發(fā)，應(yīng)用于腫瘤術(shù)后輔助脂肪填充及改善切口瘢痕的安全性有待進(jìn)一步研究[40]。SVF移植注射時(shí)的不當(dāng)操作，還可能引起失明甚至死亡等并發(fā)癥，需進(jìn)一步評(píng)價(jià)SVF的安全性[53]。③已有研究證實(shí)，SVF可應(yīng)用于治療慢性炎癥性疾病，修復(fù)骨和神經(jīng)損傷等[13，41-49]，但作用機(jī)制不明。應(yīng)通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)探究SVF中各組分在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)、組織損傷修復(fù)中的具體作用機(jī)制，以擴(kuò)大其臨床應(yīng)用范圍。