花生半矮化突變體sdm1的表型分析與赤霉素響應(yīng)研究

李歡倪+仇靜靜+馬俊杰+李長生+侯蕾

摘要：本研究利用快中子輻照花生山花13號的干種子，獲得了一個性狀穩(wěn)定遺傳的花生半矮化突變體sdm1（semi-dwarf mutant 1），繼而對其矮化形態(tài)、經(jīng)濟性狀指標及赤霉素響應(yīng)特性進行了分析。結(jié)果表明，與山花13號相比，該突變體植株半矮化、枝較粗，種仁較大、種皮色澤較深，種子成分中含油量提高、粗蛋白含量下降。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定了突變體葉片中赤霉素的含量，發(fā)現(xiàn)突變體赤霉素含量明顯低于山花13號，用 GA3處理突變體能夠恢復(fù)突變體的株高。利用qRT-PCR方法分析赤霉素代謝和信號傳導(dǎo)途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)AhGA2ox、AhGA3ox、AhGA20ox、AhDella2、AhDella3等基因的表達均發(fā)生明顯變化。以上結(jié)果表明，突變體內(nèi)赤霉素合成途徑關(guān)鍵酶基因的表達水平發(fā)生變化，使赤霉素合成能力下降，導(dǎo)致植株內(nèi)赤霉素水平降低，從而出現(xiàn)矮化表型。

關(guān)鍵詞：花生；半矮化；突變體；赤霉素；基因表達

中圖分類號：S565.2文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2017）12-0001-05

Abstract One semi-dwarf mutant sdm1 with stable inheritance was isolated from peanut cultivar Shanhua 13 induced by fast neutron irradiation. Its dwarf morphology， economic traits and response to gibberellin were analyzed. The results showed that compared with Shanhua 13， sdm1 showed semi-dwarf in plant height， thicker branches， larger seeds and darker seed coat color. The seed oil content of the mutant was increased and the protein content was decreased. The GA3 content in the leaves of sdm1 mutant was determined using enzyme-linked immunosorbent assay （ELISA）， and we found that its gibberellin content was significantly lower than that in Shanhua 13. Treated with exogenous GA3 could restore the dwarf phenotype of mutant. The qRT-PCR was used to analyze the transcriptional level of genes related to GA biosynthesis pathway and signal transduction pathway， and the results showed that the expression level of AhGA2ox， AhGA3ox， AhGA20ox， AhDella2 and AhDella3 changed significantly. The changed expression of these key enzyme genes led to the decrease of gibberellin content in mutant plants and caused dwarf phenotype.

Keywords Peanut； Semi-dwarf； Mutant； Gibberellins； Gene expression

矮化突變體是改善作物株型、培育抗倒高產(chǎn)新品種的基礎(chǔ)，也是鑒定植物矮化基因、研究株型調(diào)控分子機理的重要材料。然而，極端矮化往往會導(dǎo)致植物生物量下降，產(chǎn)量降低；而半矮化是一種優(yōu)良的農(nóng)藝性狀，可在保證產(chǎn)量的前提下改善植物株型，減少生產(chǎn)過程中的化控，降低藥劑使用對環(huán)境的污染，同時也減少了人工成本。創(chuàng)建優(yōu)良株型，可通過改善種植密度使個體和群體協(xié)調(diào)發(fā)展，提高光能和土地資源利用率，從而提高作物產(chǎn)量[1]。

植物激素合成或信號傳導(dǎo)通路上的基因發(fā)生突變往往會造成植株矮化。赤霉素（gibberellins，GAs）與植物植株高矮密切相關(guān)，在植物的生長和發(fā)育過程中起著重要的調(diào)節(jié)作用，如促進莖伸長、葉片延展、促進種子發(fā)育和誘導(dǎo)種子萌發(fā)等過程。赤霉素合成和信號傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因的突變產(chǎn)生了水稻半矮稈突變體，這些突變體在肥水充足的條件下植株生長正常，降低了因營養(yǎng)生長過度造成倒伏的可能性，從而獲得高產(chǎn)[2]。20世紀60—70年代，多個國家大面積推廣利用水稻、小麥等半矮化品種，大幅度提高了糧食產(chǎn)量。張達等[3]用NaN3處理大豆獲得了矮化突變體東澤11號，檢測植物體內(nèi)GA3含量發(fā)現(xiàn)，突變體不同生育期的赤霉素含量都低于對照材料。胡召杉等[4]研究了四倍體矮稈小麥拔節(jié)期赤霉素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因及其與植株矮化的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)赤霉素合成通路關(guān)鍵基因GA20ox和調(diào)控因子GA-MYB等的低水平表達影響了小麥拔節(jié)期赤霉素的合成，從而導(dǎo)致矮化性狀的產(chǎn)生。

花生（Arachis hypogaea L.）是我國最重要的油料作物之一，在國民食品安全和進出口貿(mào)易中占據(jù)重要位置。在一個生長季內(nèi)，為防止花生植株生長過旺，一般要噴施兩次多效唑、烯效唑等生長抑制物質(zhì)，不僅增加生產(chǎn)成本，同時也對環(huán)境和食品安全造成影響。本研究利用快中子輻照山花13號干種子，從M2代篩選到一個半矮化突變體，從農(nóng)藝性狀、經(jīng)濟性狀和植株對赤霉素的響應(yīng)等方面對其進行分析，為闡明產(chǎn)生該突變性狀的分子機理以及進一步利用該突變體培育花生新品種奠定了基礎(chǔ)。endprint

1 材料與方法

1.1 研究材料

用于選育突變體的原始材料為生產(chǎn)上廣泛種植的花生優(yōu)良品種山花13號，用輻照能量為14.0 MeV、輻照劑量為14.0 Gy的快中子射線輻照花生干種子。輻照處理在中國原子能科學(xué)研究院進行，材料由山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心保存。

2015年5月初在大田播種花生突變體庫M2代種子，當年7月份從中篩選到一個株系出現(xiàn)株高正常和半矮化的表型分離。2016年4月下旬將該突變體M3代種子單株播種，觀察每個株系的表型并記錄。2017年4月25日將對照山花13號與M4代突變體花生種子種植在山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究中心試驗基地，株距20 cm，行距50 cm，單粒播種。

1.2 試驗方法

1.2.1 花生半矮化突變體的表型分析 播種130 d后收獲花生，對其株高、側(cè)枝長、主莖節(jié)數(shù)等農(nóng)藝性狀進行測定，并對單株結(jié)果數(shù)、飽果率、雙仁果率、百果重、百仁重和出仁率等經(jīng)濟性狀進行分析。

1.2.2 種子營養(yǎng)成分含量測定 利用定氮儀、氣象色譜儀對花生種子粗蛋白、脂肪酸含量等進行檢測，以未誘變山花13號為對照進行比較。該試驗在中國科學(xué)院油料研究所完成。

1.2.3 內(nèi)源赤霉素含量測定 對大田生長90 d的成熟期花生葉片進行取樣，采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定內(nèi)源赤霉素的含量。

1.2.4 赤霉素處理 試驗在溫棚內(nèi)進行。赤霉素處理組與水處理對照組的突變體與山花13號分別種植在兩個小區(qū)。小區(qū)行長3 m，行距50 cm，株距20 cm。肥水管理措施同一般大田。于出苗后30 d開始處理，選取長勢一致的植株，以50 mg/L GA3溶液為處理液，每天下午用噴壺噴施1次，使處理液充分而均勻地分布于整個植株表面，對照組噴水，連續(xù)噴施30 d。分別于處理前、處理30 d時對植株高度進行測定。

1.2.5 qRT-PCR法檢測基因表達水平 取生長90 d的花生葉片，提取RNA之后用DNaseⅠ降解殘存的DNA，以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行qRT-PCR，檢測相關(guān)基因表達水平，以組成型表達的花生AhActin 基因作為內(nèi)參。qRT-PCR采用FastStart SYBR Green 試劑盒（Roche）按說明書進行操作。PCR反應(yīng)程序及計算方法參照王成祥等[5]所述方法。引物名稱及序列見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 半矮化突變體sdm1的篩選

從M2代開始，在大田單粒播種花生突變體庫種子，并對特異表型植株進行篩選，發(fā)現(xiàn)其中一個株系在M2代出現(xiàn)株高正常和半矮化的表型分離。故從M2代開始，連續(xù)播種該株系3個世代，并對其單株表型遺傳性進行分析。發(fā)現(xiàn)在M2代呈現(xiàn)半矮化性狀的植株后代全為半矮化植株，到M4代仍可穩(wěn)定遺傳；而在M2代表型正常的植株其后代出現(xiàn)正常植株和半矮化植株的分離。該株系即為性狀穩(wěn)定遺傳的半矮化花生突變體，將其命名為sdm1（semi-dwarf mutant 1）。

2.2 半矮化突變體sdm1的植株生長特性分析

從圖1A看出，與山花13號相比，半矮化花生突變體sdm1最明顯的表型是株高變矮。收獲期時突變體sdm1的主莖高為42.34 cm，而山花13號主莖高為62.95 cm，株高降低32.7%（圖1B）。另外，突變體還表現(xiàn)出莖節(jié)間長度變短、枝變粗、種仁略大、種皮色澤較深等（圖1A、C）。突變體植株直立，不易倒伏，葉片則與山花13號無明顯差異。山花13號和sdm1突變體的全生育期日數(shù)接近，在本試驗條件下均在130 d左右。

于收獲期對sdm1突變體與山花13 號進行部分農(nóng)藝性狀的調(diào)查（表2），對比發(fā)現(xiàn)，sdm1的側(cè)枝長明顯低于山花13號，sdm1的平均側(cè)枝長為57.85 cm，山花13號為91.42 cm；sdm1的分枝數(shù)明顯高于山花13號，其中sdm1的平均分枝數(shù)為14.12個，山花13號為9.80個；主莖節(jié)數(shù)無明顯差異；突變體sdm1的果針數(shù)則多于山花13號。

從影響產(chǎn)量構(gòu)成的單株生產(chǎn)力、飽果率、雙仁果率、百果重、百仁重和出仁率等經(jīng)濟性狀（表3）來看，突變體sdm1的單株結(jié)果數(shù)、單株生產(chǎn)力、飽果率、雙仁果百果重和百仁重均高于對照品種，如突變體sdm1的單株結(jié)果數(shù)為39.16個，而山花13號是31.05個，平均每個單株比對照多結(jié)8.11個果；突變體sdm1的單株生產(chǎn)力為53.58 g，而山花13號是47.01 g，平均每個單株比對照增產(chǎn)13.98%。而幼果數(shù)和秕果率均低于對照品種，突變體sdm1分別是10.36和11.03%，山花13號分別是14.31和12.92%。突變體sdm1雙仁果率為57.96%，比山花13號雙仁果率（77.84%）低約20個百分點。兩個品系之間出仁率則沒有明顯差異。

2.3 半矮化突變體sdm1的種子營養(yǎng)成分分析

對突變體和對照品種的種子粗蛋白、含油量、脂肪酸等成分含量進行測定（表4），結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變體含油量升高，為57.35%，比山花13號高10.0%；粗蛋白含量則明顯降低，比山花13號低20.6%。脂肪酸成分中，棕櫚酸、棕櫚一烯酸、硬脂酸、花生酸的含量略有上升，而十七碳烷酸、十七碳一烯酸、油酸、亞油酸、花生一烯酸、山崳酸、二十四碳烷酸的含量均下降。

2.4 半矮化突變體的內(nèi)源赤霉素含量測定

對成熟期sdm1突變體和山花13號內(nèi)源赤霉素含量進行測定，發(fā)現(xiàn)突變體中GA1/3和GA4/7赤霉素含量均下降（圖2）， sdm1突變體的內(nèi)源GA1/3含量（4.68 ng/gFW）明顯低于山花13號的6.02 ng/gFW；同樣， sdm1突變體的內(nèi)源GA4/7含量（4.28 ng/gFW）也低于山花13號的5.57 ng/gFW。因此，sdm1突變體的內(nèi)源赤霉素含量減少可能是其植株矮化的關(guān)鍵原因。endprint

2.5 赤霉素處理對半矮化突變體株高的影響

為檢測赤霉素對半矮化突變體sdm1植株高度的影響，我們利用外施GA3的方法對sdm1突變體和山花13號進行處理。從圖3看出，出苗30 d時，sdm1突變體株高比山花13號矮，但差異較小。而生長60 d時，對照組sdm1突變體比對照品種明顯矮小，株高大約是山花13號的79%；而外施赤霉素GA3處理組，突變體的株高較對照略矮，但差異不顯著，說明赤霉素能夠恢復(fù)突變體的株高。

2.6 赤霉素合成代謝與信號傳導(dǎo)通路相關(guān)基因的表達分析

通過qRT-PCR方法檢測了半矮化突變體和山花13號中與赤霉素合成和信號傳導(dǎo)通路相關(guān)基因的表達情況（圖4）。AhGA2ox、AhGA3ox和AhGA20ox是赤霉素合成途徑中的關(guān)鍵酶基因，結(jié)果顯示，突變體中AhGA2ox、AhGA3ox的表達水平與對照比明顯升高，分別是山花13號的2.76、1.54倍，而AhGA20ox的表達降低，是對照的65%。DELLA蛋白是赤霉素信號傳導(dǎo)途徑中關(guān)鍵的負調(diào)控因子，結(jié)果表明，AhDella1、AhDella2兩個基因的表達略微升高，升高倍數(shù)分別為1.14、1.78，而AhDella3的表達升高顯著，在突變體sdm1中的表達量是對照中的6.6倍。

3 討論與結(jié)論

植株徒長、倒伏是導(dǎo)致花生減產(chǎn)的突出問題?；ㄉ丶夹g(shù)是在盛花后期至結(jié)莢前期的生長最旺盛時期，為避免植株徒長，通過葉面噴施多效唑、烯效唑等植物生長調(diào)節(jié)劑來控制花生植株高度，防止倒伏[6]。山花13號的高產(chǎn)栽培技術(shù)需在花生植株高度達到35～45 cm時進行化控，一般要化控兩次[7]，不僅對環(huán)境造成污染，且增加人工成本。而在半矮化材料的栽培過程中不需化控，從而降低化學(xué)藥劑對環(huán)境的污染，減少投入。因此，篩選半矮化花生突變體材料具有重要意義。本研究篩選的半矮化花生突變體sdm1主莖高降低，經(jīng)濟性狀指標升高，在改善植物株型的同時可提高花生產(chǎn)量和含油量。該材料在花生生產(chǎn)中應(yīng)用能有效減少化控，降低人工成本，增加經(jīng)濟收益。

經(jīng)ELISA檢測赤霉素的含量發(fā)現(xiàn)，半矮化花生突變體sdm1的內(nèi)源赤霉素含量明顯減少，而苗期噴施赤霉素能使突變體株高恢復(fù)至正常水平，由此推斷突變影響了花生赤霉素的合成從而導(dǎo)致植株矮化。

植物體內(nèi)赤霉素的生物合成是一個多步驟多種酶參與的過程。GA20ox是赤霉素生物合成最重要的限速酶，GA12、GA53分別在GA20ox的連續(xù)氧化后脫去CO2生成GA9和GA20，然后GA9和GA20在GA3氧化酶（GA3ox）的催化下，經(jīng)過3β-羥基化生成具有生物活性的GA4和GA1[8]，過量表達GA20ox，植物會表現(xiàn)出葉片變淡、節(jié)間伸長的生理性狀[9]。GA20ox是在赤霉素合成途徑中起負調(diào)控作用的一種關(guān)鍵酶，通過2β-羥基化反應(yīng)催化有生物活性的赤霉素或它的前體失活。在擬南芥中過量表達GA2ox可以使植株出現(xiàn)矮化，使開花時間延長，影響種子的育性等[10]。本研究利用qRT-PCR 方法檢測了突變體中AhGA2ox、AhGA3ox和AhGA20ox基因的表達水平變化，結(jié)果表明，相對于對照栽培種山花13號，突變體sdm1中AhGA20ox的表達明顯降低，而AhGA2ox表達量升高1.76倍，推測AhGA20ox和AhGA2ox基因表達水平的變化是赤霉素含量降低的主要原因，這與矮稈小麥中的研究結(jié)果類似[4]。GAI是赤霉素信號途徑負調(diào)控因子DELLA家族的成員之一，GAI基因的表達在小麥矮稈突變體ANW16F、ANW16G和矮稈番麥中的表達量顯著高于高稈品種[11]。本研究得到了類似的結(jié)果，AhDella2和AhDella3的表達量在半矮化突變體中均上升，尤其AhDella3的表達量是對照的6.6倍。本試驗結(jié)果表明，半矮化突變體中赤霉素合成和信號傳導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因的表達水平發(fā)生變化，導(dǎo)致植株中赤霉素含量降低和突變體植株矮化。

參 考 文 獻：

[1] 范小玉， 陳雷， 李可，等. 不同株高化控對大果花生主要性狀和產(chǎn)量的影響[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2017， 45（9）：51-52.

[2] Sasaki A，Ashikari M，Ueguchi-Tanaka M，et al. Green revolution： a mutant gibberellin-synthesis gene in rice[J]. Nature，2002，416（6882）： 701-702.

[3] 張達， 王軍虹， 王豫穎，等. 矮化大豆突變體的GA3調(diào)控[J]. 大豆科學(xué)， 2008， 27（3）：456-460.

[4] 胡召杉， 巫有霞， 楊在君，等. 四倍體矮稈小麥拔節(jié)期赤霉素合成途徑中關(guān)鍵酶基因表達分析[J]. 種子， 2016， 35（1）：1-5.

[5] 王成祥， 李長生， 侯蕾，等. 花生赤霉素2-氧化酶基因的克隆和表達研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2013， 45（1）：14-18.

[6] 齊衛(wèi)，尚濤，黃曉偉，等. 化控藥劑對花生化控效果試驗研究[J]. 花生學(xué)報，2003，32（S1）：457-459.

[7] 杜新， 王玉運， 王志偉，等. 山花13在丘陵旱地的栽培表現(xiàn)及配套高產(chǎn)栽培技術(shù)[J]. 中國農(nóng)技推廣， 2015， 31（12）：31-33.

[8] Yamaguchi S. Gibberellin metabolism and its regulation [J]. Annu. Rev. Plant Biol.， 2008， 59： 225-251.

[9] Huang S S， Raman A S， Ream J E， et al. Overexpression of GA20-oxidase confers a gibberellin-overproduction phenotype in Arabidopsis [J].Plant Physiol.，1998，118：773-781.

[10]Otani M， Yoon J M， Park S H. Screening and characterization of an inhibitory chemical specific to Arabidopsis gibberellin 2-oxidases [J]. Medicinal Chemistry Letters， 2010， 20（14）： 4259-4262.

[11]向小華， 郭會君， 趙林姝，等. 小麥矮稈突變體DC20赤霉素合成及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵基因表達分析[J]. 核農(nóng)學(xué)報， 2014， 28（2）：208-216.endprint