太子參通過(guò)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖

林少兵 ，蔣宗勝 ，阮君山 ，2，王少明 ，2

（1.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州350001；2.福建省立醫(yī)院中醫(yī)藥分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350001；3.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

太子參通過(guò)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖

林少兵1，蔣宗勝3，阮君山1，2，王少明1，2

（1.福建醫(yī)科大學(xué)省立臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州350001；2.福建省立醫(yī)院中醫(yī)藥分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350001；3.福建醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州350122）

目的 通過(guò)太子參及主要成分環(huán)肽B（HB）對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖的影響，研究其相關(guān)作用機(jī)制。 方法 CAM雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)測(cè)定太子參對(duì)血管生成的影響；CCK8檢測(cè)法檢測(cè)HB對(duì)HUVEC的增殖和毒性；劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HB對(duì)HUVEC增殖和遷移的影響；ELISA檢測(cè)HB通過(guò)影響哪種細(xì)胞生長(zhǎng)因子影響HUVEC的生長(zhǎng)發(fā)育；Western Blot測(cè)定MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各蛋白的表達(dá)，分析其相關(guān)作用機(jī)制。結(jié)果 太子參具有促進(jìn)血管生成的作用；0～100 μg／mL HB可促進(jìn)HUVEC增殖；隨著時(shí)間推移，HUVEC快速地向劃痕中間遷移，并且隨著HB濃度的增加，HUVEC遷移的速度和強(qiáng)度也隨著增強(qiáng)；HB通過(guò)影響VEGF的表達(dá)促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖；HB通過(guò)激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖。 結(jié)論 太子參具有促進(jìn)血管生成的作用，作用機(jī)制與激活MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，促進(jìn)細(xì)胞的增殖有關(guān)。

太子參；環(huán)肽B；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；血管生成

血管生成是指從已有毛細(xì)血管或毛細(xì)血管后靜脈發(fā)展而形成新血管［1］，主要包括：血管基底膜降解；血管內(nèi)皮細(xì)胞的激活、增殖、遷移；重建形成新血管和血管網(wǎng)，是一個(gè)涉及多種細(xì)胞的復(fù)雜過(guò)程。血管生成是目前研究熱點(diǎn)，涵蓋幾乎所有臨床學(xué)科，尤其是心血管和腫瘤領(lǐng)域的研究較為突出［2］。

太子參為石竹科太子參屬植物，主要成分為太子參多糖、多種氨基酸和微量元素。有研究表明：太子參具有抗氧化的特性［3］，且對(duì)心肌細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用［4］，但當(dāng)前作用機(jī)制尚未明朗。本研究以環(huán)肽B（HB）促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）增殖為切入點(diǎn)，進(jìn)一步研究太子參促進(jìn)血管生成的作用機(jī)制，為太子參在血管生成領(lǐng)域提供更合理的用藥依據(jù)。

1 材 料

1.1 試劑 SPF種雞蛋（福建省大北農(nóng)生物技術(shù)有限公司）；重組人血管內(nèi)皮抑制素（商品名：恩度，山東先聲麥得津生物制藥有限公司）；重組牛堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（商品名：貝復(fù)舒，珠海億勝生物制藥有限公司）；HUVEC（上海漢博生物科技有限公司）；HB（成都普瑞法科技開(kāi)發(fā)有限公司）；DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清、雙抗（青霉素-鏈霉素溶液，美國(guó)通用醫(yī)療生命科學(xué)有限公司）；CCKB試劑、Westem Blot試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；VEGF165試劑盒（武漢云克隆有限公司）；FGF2試劑盒（武漢云克隆有限公司）；Erk1／2、Mek1 ／2、Raf-1（上海斯信生物科技有限公司）；β-actin、IgG（H＋L）（北京麥爾泰克科技有限公司）。太子參水提物由福建省立醫(yī)院制劑室自制。

1.2 培養(yǎng)條件 HUVEC于36.9℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基加15%血清和1%雙抗。

2 方 法

2.1 CAM雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn)測(cè)定太子參對(duì)血管增殖的影響 配制濃度為2、5、10 mg／mL的太子參水提物。選擇表面清潔，蛋殼均質(zhì)的SPF種雞蛋，孵育于5%CO2、36.9℃恒溫箱。孵蛋至第 8天，酒精消毒蛋殼表面，去除蛋殼，剪除卵殼膜（大概1.5 cm×1.5 cm），制備假氣室［5］。將滅菌后的濾紙以1 cm×1 cm的規(guī)格剪取，作為載體置于CAM中。制作成功的 CAM 模型分成空白組、低（2 mg／mL）、中（5 mg／mL）、高（10 mg／mL）劑量組，每組 8 個(gè) CAM 模型，做好標(biāo)記。用微量加樣器將0.06 mL藥物滴到各組載體中，加完藥后用透明膠封閉加藥窗，放入5%CO2、36.9℃恒溫箱中繼續(xù)孵育，連續(xù)加藥3 d。3 d后，由加藥窗滴入甲醛∶丙酮＝1∶1的固定液預(yù)固定 15 min，待CAM的血管完全凝固后，用眼科鑷完整剪下CAM中心待觀察區(qū)域，置于蒸餾水中，吸管吹打CAM，使其舒展開(kāi)來(lái)，立即拍照保存。使用相關(guān)軟件分析圖像，根據(jù)管徑將血管分類：管徑≥0.1 mm為大血管；0.1 mm＞管徑≥0.05 mm為中血管；管徑＜0.05 mm為小血管。

在確定最適合細(xì)胞生長(zhǎng)藥物濃度后，用同樣的方法將制作成功的CAM模型分成空白組、最適合細(xì)胞生長(zhǎng)藥物濃度組、貝復(fù)舒組、恩度組，每組8個(gè)CAM模型，觀察各組藥物對(duì)血管增殖的影響。

2.2 CCK8檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞增殖和毒性 制備HUVEC細(xì)胞懸液并計(jì)數(shù)，稀釋細(xì)胞懸液，以每孔2 000個(gè)HUVEC接種到96孔板中，5%CO2、36.9℃恒溫箱培養(yǎng) 24 h 后，以 8 濃度梯度（0、20、30、50、60、80、100、150、200 μg／mL） 6 個(gè)復(fù)孔的形式加入 HB。 細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，每個(gè)孔加20 μL CCK8試劑，CCK8作用1.5、3、4 h時(shí)，在波長(zhǎng)450 nm下測(cè)各孔吸光度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值［6］。

2.3 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HB對(duì)HUVEC增殖和遷移的影響 用marker筆在6孔板背后劃?rùn)M線，大約每隔0.5～1 cm一道。在6孔板中選4個(gè)孔，每孔加入70 μL（約含 5×105個(gè) HUVEC）細(xì)胞懸液，放入 5%CO2、36.9℃恒溫箱。待細(xì)胞鋪滿板孔，用槍頭比著直尺，垂直于背后的橫線劃痕，用PBS洗去劃下的細(xì)胞，加入 0、30、60、90 μg／mL HB 組的培養(yǎng)基，放入5%CO2、36.9℃恒溫箱。 在 0、6、12、24 h 時(shí)拍照，記下劃痕的間距。做3次實(shí)驗(yàn)，算平均值。

2.4 ELISA檢測(cè) VEGF、FGF2的表達(dá)情況 將HUVEC 分為 4 組，每組含 0、30、60、90 μg／mL HB，設(shè)5個(gè)孔，培養(yǎng)24 h。24 h后，用0.25%胰酶消化，離心收集細(xì)胞，將收集到的細(xì)胞用冷 PBS洗3次，制備PBS細(xì)胞懸液。取適量 PBS重懸細(xì)胞，用一定功率的超聲波處理細(xì)胞懸液，使細(xì)胞急劇震蕩破裂，反復(fù)凍融3次，使細(xì)胞溶脹破碎。于 2～8℃ 500 g離心10 min，收集上清備用。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書的操作檢測(cè)VEGF、FGF2的表達(dá)情況。

2.5 Western Blot檢測(cè)MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中蛋白表達(dá)情況 取一個(gè)培養(yǎng)瓶的細(xì)胞，用預(yù)冷過(guò)的PBS 洗 3 遍，加裂解液 300 μL（RIPA 裂解液∶PMSF＝100∶1），30 min 后，用槍頭刮下細(xì)胞（此操作在冰上進(jìn)行），12 000 rpm，冷凍離心 10 min，取上清液200 μL，加入 SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液 40 μL，98℃高溫變性10 min，BCA法檢測(cè)蛋白含量。SDSPAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，加一抗，4℃過(guò)夜，TBST洗5次，加二抗，孵育2 h，TBST洗5次，加發(fā)光劑ECL化學(xué)發(fā)光。將膠片掃描存檔，凝膠圖像分析目標(biāo)帶的光密度值。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 以上實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，采用SPSS22.0版本軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料屬正態(tài)分布以（x±s）表示，采用 t檢驗(yàn)。

3 結(jié) 果

3.1 CAM雞胚絨毛尿囊膜實(shí)驗(yàn) 雞胚在5%CO2、36.9℃恒溫箱正常發(fā)育，孵育40個(gè)，成功37個(gè)，制作成功率為92.5%?？瞻捉MCAM膜與載體融合，部分中、小血管貫穿；低劑量組的中、小血管較多，沒(méi)有大血管，血管呈點(diǎn)狀分布，血管增生的范圍主要集中在載體邊緣0.2 cm內(nèi)；中劑量組的血管增生最多，平均每個(gè)雞胚有2.1根大血管，中、小血管的密集，血管呈樹(shù)突狀分布，血管增生的范圍主要集中在載體邊緣0.5 cm內(nèi)；高劑量組的雞胚在加藥后死亡2個(gè)，基本沒(méi)有大、中血管，有大量細(xì)小血管圍繞，細(xì)小血管以載體為中心呈包繞或放射狀分布。因此最適合細(xì)胞生長(zhǎng)藥物濃度組為中劑量組。

貝復(fù)舒組血管增生最多，大、中血管比較多，每個(gè)雞胚有2～4根大血管，呈樹(shù)突狀分布，血管增生的范圍主要集中在載體邊緣0.8 cm內(nèi)；恩度組抑制作用非常明顯，雞胚只存活2個(gè)，且存活雞胚的血管多為零星分布的細(xì)小血管。如表1所示，中劑量組與空白組比較，血管數(shù)有顯著性差異（P＜0.05），說(shuō)明太子參有促進(jìn)血管生成的作用。

表1 各藥物組與空白組血管數(shù)比較（x±s） 根

3.2 CCK8檢測(cè)法檢測(cè)HB對(duì)HUVEC的增殖和毒性 實(shí)驗(yàn)顯示HB影響HUVEC的增殖，如圖1所示：0～100 μg／mL HB 促進(jìn) HUVEC 增殖，150、200 μg／mL HB抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)。

3.3 HB促進(jìn)HUVEC增殖和遷移 如圖2、表2所示，隨著時(shí)間的推移，HUVEC快速地向劃痕中間遷移，并且隨著HB濃度增加，HUVEC遷移的速度和強(qiáng)度也隨著增強(qiáng)，與空白組比較，愈合程度有顯著性差異（P＜0.05）。

3.4 HB通過(guò)增加VEGF的表達(dá)促進(jìn)HUVEC細(xì)胞增殖 如圖3所示：隨著HB濃度的增加，VEGF的表達(dá)隨著增加，不同濃度間VEGF的表達(dá)有顯著性差異（P＜0.05），F(xiàn)GF2的表達(dá)不受環(huán)肽 B濃度影響。

圖1 不同濃度HB作用后測(cè)得的HUVEC吸光度值

表2 不同濃度HB在不同時(shí)間劃痕的愈合程度（x±s）%

圖2 不同濃度HB在不同時(shí)間劃痕的愈合程度

圖3 ELISA檢測(cè)VEGF、FGF2的表達(dá)情況

3.5 HB 激活 MAPK（Ras／Raf／Mek／Erk）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn) HUVEC細(xì)胞增殖 Ras／Raf／Mek／Erk信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路作為MAPK眾多信號(hào)通路中的一個(gè)，是細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育最重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，參與HUVEC細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移等過(guò)程。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了HUVEC 細(xì) 胞 中 Kras、Raf-1、Mek1 ／2、Erk1／2 的 表達(dá)水平，結(jié)果如圖4所示：隨著HB濃度的增加，HUVEC 細(xì)胞中 Kras、Raf-1、Mek1／2、Erk1／2 蛋白的表達(dá)水平顯著增加，與空白組比較，有顯著性差異（P＜0.05）。

圖 4 HUVEC 細(xì)胞中 Kras、Raf-1、Mek1／2、Erk1／2 蛋白的表達(dá)情況

4 討 論

應(yīng)用藥物刺激小血管生長(zhǎng)，促進(jìn)血管生成，已成為目前心血管領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。CAM是雞胚外的一層膜，主要功能是提供氣體交換的表面，其功能依賴于致密的血管網(wǎng)支撐，正是由于雞胚發(fā)育過(guò)程中大量尿囊膜血管的形成，為研究血管發(fā)生和形成提供了良好的模型［7］。本研究表明：太子參能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移，且作用比較緩和，此結(jié)果為太子參治療相關(guān)疾病提供新的依據(jù)。

血管生成過(guò)程復(fù)雜，與多種細(xì)胞因子有關(guān)。目前，對(duì)促進(jìn)血管生成的血管生成因子研究最多的為FGF和VEGF。本研究利用ELISA的敏感性、高特異性檢測(cè)HB對(duì)HUVEC中FGF和VEGF的影響情況，證明HB是通過(guò)影響VEGF的表達(dá)促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。

目前已知，所有真核細(xì)胞中均存在Ras／Raf／Mek／Erk這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，VEGF、源生長(zhǎng)因子（PDGF）等與其受體結(jié)合后，可通過(guò)刺激 Ras-二磷酸鳥苷（GDP）轉(zhuǎn)換為 Ras-三磷酸鳥苷（GTP），從而導(dǎo)致Ras激酶過(guò)度活化，進(jìn)而以這種自體磷酸化方式激活 Ras／Raf／Mek ／Erk 信號(hào)通路［8］，啟動(dòng)相應(yīng)轉(zhuǎn)錄子的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞的增殖分化。本文通過(guò)測(cè)定 Ras／Raf／Mek／Erk 這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中各蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示：隨著HB濃度的增加，各蛋白的表達(dá)水平也隨著增加，說(shuō)明HB通過(guò)Ras／Raf／Mek／Erk這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖。但各蛋白的表達(dá)水平并不呈規(guī)則的趨勢(shì)上升，考慮其不只是影響 Ras／Raf／Mek／Erk 這一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，還通過(guò)其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖，這需要更多的研究予以證實(shí)。

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R285.5

A

1000-338X（2017）06-0016-04

2017-09-18

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81273647）；福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（2013J01365）；福建省衛(wèi)生系統(tǒng)中青年骨干人才重點(diǎn)項(xiàng)目（2015-ZQN-ZD-2）；國(guó)家衛(wèi)計(jì)委共建科學(xué)研究基金項(xiàng)目（WKJ-FJ-19）

林少兵（1983—），男，主管藥師，主要從事藥學(xué)工作。

王少明（1958—），男，主任藥師，碩士研究生導(dǎo)師。E-mail：cnfjwsm@163.com