抗CD137L單抗對再生障礙性貧血T細胞亞群及細胞因子誘生水平的影響及意義

王志敏，潘學霞，李尊昌，王雨存，王立盼

（1. 濱州市人民醫(yī)院血液內(nèi)科；2. 兒科；3. 風濕免疫科，山東 濱州 256600）

檢驗論著

抗CD137L單抗對再生障礙性貧血T細胞亞群及細胞因子誘生水平的影響及意義

王志敏1，潘學霞2，李尊昌1，王雨存3，王立盼1

（1. 濱州市人民醫(yī)院血液內(nèi)科；2. 兒科；3. 風濕免疫科，山東 濱州 256600）

目的探討抗CD137L單克隆抗體阻斷CD137/CD137L信號通路對再生障礙性貧血（aplastic anemia, AA）T淋巴細胞亞群及單個核細胞體外誘生細胞因子水平的影響，及其在AA免疫治療中的作用和意義。方法采用流式細胞術(shù)及ELISA方法，分析AA患者經(jīng)抗CD137L單抗刺激前后骨髓T淋巴細胞亞群及單個核細胞誘生細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10的變化。結(jié)果AA患者經(jīng)抗CD137L單抗誘導后骨髓CD3+、CD4+、CD8+、CD25+ T細胞比值顯著降低（P＜0.05），而對照組T細胞亞群幾無影響?？笴D137L使再障患者骨髓單個核細胞IL-2、IFN-γ水平降低，但較正常對照組升高（P＜0.05），使IL-10水平升高，但較正常對照組仍顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論抗CD137L單抗可使AA患者T細胞亞群恢復(fù)或接近正常，使免疫狀態(tài)得到改善，亦可使體外骨髓單個核細胞（BMMNC）中IL-2、IFN-γ水平下降，IL-10水平提高，具有重要意義。

再生障礙性貧血；T淋巴細胞；抗CD137LmAb；細胞因子

再生障礙性貧血（aplastic anemia, AA）是一種骨髓造血功能衰竭性疾病，其發(fā)病機制復(fù)雜，目前的觀點認為，細胞免疫異常介導的造血組織免疫損傷在AA的發(fā)病機制中起著重要作用。研究[1,2]已發(fā)現(xiàn)，在AA患者中T淋巴細胞活化異常，細胞因子分泌異常。T細胞的活化過程需要抗原信號和共刺激信號分子的雙重作用，如果共刺激信號被阻斷，則可誘導抗原特異性T細胞免疫。CD137/CD137L是除CD28/B7以外的另一對關(guān)鍵的共刺激信號因子，在T細胞的活化、增殖方面發(fā)揮重要作用[3]?？笴D137L單克隆抗體與活化T細胞表面的CD137L分子結(jié)合，阻斷CD137與CD137L的結(jié)合，從而阻斷CD137-CD137L信號通路，導致T細胞無反應(yīng)性并抑制免疫應(yīng)答[4]。然而，目前國內(nèi)關(guān)于體外阻斷CD137-CD137L通路是否能影響T細胞亞群和細胞因子分泌的報道很少，我們通過流式細胞術(shù)及ELISA方法，測定AA患者經(jīng)抗CD137L單抗作用前后T細胞亞群和骨髓單個核細胞在體外誘導的細胞因子變化可初步判斷阻斷共刺激信號對AA的糾正作用及對細胞免疫的可能作用。

1 對象和方法

1.1 對象 32例AA患者均為2011年4月-2014年11月我院血液科門診及初診住院患者，其中非重型AA（NSAA）22例，重型AA（SAA）10例，男性18例，女性14例，年齡12歲-49歲，中位年齡32歲，經(jīng)血常規(guī)、骨髓細胞學、骨髓活檢等檢查，診斷符合《血液病診斷和療效標準》。正常對照組16例，取自同期住院的非造血系統(tǒng)疾病患者，其中男性9例，女性7例，年齡14歲-52歲，中位年齡34歲。

1.2 主要儀器和試劑 流式細胞儀（美國becton-Dickinson公司）；37oC CO2培養(yǎng)箱：gbb-16型，上海heraeus公司；低速自動平衡離心機：ldz 5-2型，北京醫(yī)用離心機廠；臺式高速離心機：tgl-16g型，上海醫(yī)療分析儀器廠；淋巴細胞分層液（中國醫(yī)學科學院生物工程研究所）；抗CD137L單克隆抗體（深圳市景美有限公司）、CD3、CD4、CD8 flow單克隆抗體和絲裂霉素、植物血凝素（PHA）（Sigma）。IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ引物（上海生物工程有限公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 標本采集 無菌條件下抽取AA患者骨髓8 mL-10 mL，抽取正常對照骨髓5 mL，肝素抗凝。

1.3.2 分離骨髓單個核細胞（BMMNCs） 密度-梯度法。

1.3.3 骨髓單個核細胞培養(yǎng) 把再障患者BMMNCs分為抗CD137L組、對照組在體外培養(yǎng)5 d后加入PHA（20 μg/mL），然后培養(yǎng)2 d。正常對照組骨髓單個核細胞體外培養(yǎng)5 d，加入PHA（20 μg/mL）2 d。收集培養(yǎng)的骨髓單個核細胞。離心取上清液，過濾，分裝，于-20oC冷凍。

1.3.4 ELISA方法檢測再障兩組及正常組細胞因子IL-2、IFN-γ、IL-10誘生水平。

1.3.5 免疫熒光標記及流式細胞術(shù)分析 將BMMNC濃度約1×106個/mL，加入20 μL相應(yīng)熒光標記單克隆抗體，混勻，室溫避光孵育30 min，然后離心去上清，懸浮細胞，4oC固定30 min，上機檢測。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 10.0軟件進行數(shù)據(jù)分析處理。計數(shù)資料采用率（%）表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料采用均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 抗CD137L單抗對再障患者骨髓T淋巴細胞亞群分布的影響 再障患者BMMNCS加入抗CD137L單抗后，CD3+、CD4+、CD8+、CD25+細胞的比值較對照組顯著減低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05)，見表1。

2.2 抗CD137LmAb對骨髓MNC誘生細胞因子水平的影響 加入抗CD137LmAb組較未加組SAA、AA患者骨髓MNC誘生IL-2、IFN-γ水平顯著降低（P＜0.05），但顯著高于正常對照組（P＜0.05）。加入抗CD137LmAb組較未加組SAA、AA患者骨髓MNC誘生IL-10水平顯著增高（P＜0.05），但顯著低于正常對照組（P＜0.05）。數(shù)據(jù)見表2。

表1 抗CD137L單抗對再障患者骨髓T淋巴細胞表型的影響（Mean±SD, %）

表2 抗CD137L單抗對再障患者骨髓MNC誘生細胞因子水平的影響（Mean±SD, ng/mL）

3 討論

AA的發(fā)病機制較復(fù)雜，目前觀點認為，造血干細胞、造血微環(huán)境異常、細胞免疫功能紊亂在AA的發(fā)病機制中起著重要作用。其中細胞免疫異常是再障患者免疫發(fā)病機制的主要方面。近年來，對AA細胞免疫異常的研究發(fā)現(xiàn)，包括T細胞亞群及相關(guān)細胞因子水平，提示T細胞異?；罨霸煅撜{(diào)控因子的優(yōu)勢在AA發(fā)病機制中起重要作用。

CD4+ T細胞按其所產(chǎn)生細胞因子譜可分為Th1、Th2細胞，T細胞亞群的變化主要是TH1/TH2的異常，以及由此引起的細胞因子分泌異常。TH1細胞分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等細胞因子，TH2細胞分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13等細胞因子。IL-2可促進T細胞增殖，增強T細胞、NK細胞的活性，除促進IFN-γ的產(chǎn)生外，陳可冀等[5]研究證實，IL-2異常升高與AA患者細胞免疫功能紊亂有關(guān)。IFN-γ是T細胞分泌的一種負性造血調(diào)節(jié)因子，有研究[6]表明微量內(nèi)源性IFN-γ具有較強抑制作用。IL-10，又稱細胞因子產(chǎn)生抑制劑，具有明顯的免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)作用，與AA患者細胞免疫紊亂的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。T細胞的完全活化需要兩個信號：抗原識別信號和共刺激信號，共刺激信號缺乏會導致T細胞無能或免疫耐受[7,8]。AA其實質(zhì)是以骨髓造血組織為靶器官，細胞免疫異常介導的免疫性疾病，其共刺激信號系統(tǒng)的改變也逐漸受到關(guān)注。

1989年Kwon等從活化的鼠T細胞中分離出一種新的膜表面抗原，命名為4-1BB（CD137）[9]，此后的許多研究發(fā)現(xiàn)4-1BB屬于腫瘤壞死因子受體超家族，其配體屬于腫瘤壞死因子超家族，二者是除CD28/B7外的另一對重要的協(xié)同刺激信號，在T淋巴細胞的活化過程中起著重要作用。CD137主要通過協(xié)同CD3和CD28發(fā)揮共刺激作用。Pulle及Myers等研究認為CD137共刺激途徑主要促進CD8+ T細胞的增殖與分化，Myers等研究發(fā)現(xiàn)，CD137信號通路具有極化效應(yīng)，表現(xiàn)為I類細胞因子如IFN-γ的分泌增加，II類細胞因子如IL-10的分泌減少。

本研究證實，加入抗CD137L單抗后AA患者骨髓中CD3+、CD4+、CD8+、CD25+細胞比值較對照組明顯降低，表明抗CD137L單抗可使再障患者骨髓T淋巴細胞的增殖及活化受到抑制。用ELISA法測定經(jīng)抗CD137L單抗阻斷后骨髓MNC誘生細胞因子的水平，結(jié)果表明阻斷后IL-2、IFN-γ水平顯著下降，且SAA較NSAA中IL-2、IFN-γ有顯著增高，這與國內(nèi)外諸多研究結(jié)果相一致，IL-10誘生水平較正常對照顯著降低（P＜0.05），SAA患者與NSAA患者之間無統(tǒng)計學差異，說明AA患者存在明顯的細胞免疫及細胞因子網(wǎng)絡(luò)的異常，這可能由于阻斷后T細胞的異?；罨灰种?，原有的Th1/Th2平衡向Th1偏移現(xiàn)象被部分糾正，因此Th1型細胞因子IL-2、IFN-γ水平降低，Th2型細胞因子IL-10水平增高。

目前，免疫抑制是臨床上治療再障的主要方法，但此種治療手段并未使再障的治療有效率有顯著提高，所以探討其他的治療方法顯得十分必要。研究已表明AA有共刺激信號系統(tǒng)的異常，所以探索共刺激信號途徑的變化和干預(yù)有可能為AA的基礎(chǔ)和臨床研究提供新思路和開辟新途徑。

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Effect and significance of anti-CD137L monoclonal antibody on T cell subsets and cytokine induced level in aplastic anemia

Zhimin WANG1, Xuexia PAN2, Zunchang LI1,Yucun WANG3, Lipan WANG1
1. Department of Hematology; 2. Department of Pediatrics; 3. Department of Rheumatism Immunology;Binzhou People's Hospital, Binzhou 256600, China

ObjectiveTo investigate the effect of blocking CD137/CD137L signaling pathway on T lymphocyte subsets and cytokines induced by mononuclear cellsin vitro, and their roles in aplastic anemia (AA) immunotherapy.MethodsThe changes of bone marrow T lymphocyte subsets and mononuclear cells inducing cytokines (IL-2,IFN-γ, and IL-10) in AA patients before and after stimulation with anti-CD137L monoclonal antibody were analyzed by flow cytometry and ELISA.ResultsIn patients with AA, the ratio of CD3+, CD4+, CD8+ and CD25+ T cells decreased significantly after the induction of anti CD137L monoclonal antibody (P＜0.05), while the T cell subsets in control group almost had no effect. Anti-CD137L to patients with aplastic anemia bone marrow mononuclear cells of IL-2, IFN-γ levels decreased, but increased compared to normal control group (P＜0.05), which elevated IL-10 levels, but still significantly lower than the normal control group (P＜0.05).ConclusionAnti-CD137L monoclonal antibody can make T cell subsets of AA patients recover or near normal, improve the immune state, and also decrease the level of IL-2 and IFN-γ in bone marrow mononuclear cell (BMMNC), and improve IL-10 level.

Aplastic anemia; T cell; Anti-CD137LmAb; Cytokines