同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量蛋白組學(xué)技術(shù)篩選兒童哮喘不同病情控制水平血清差異蛋白

劉姬艷，王 瑛，王遠(yuǎn)照，朱佳文，戴芳甸

1杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，杭州 310036 2浙江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第一醫(yī)院兒科，杭州 310006

·論著·

同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量蛋白組學(xué)技術(shù)篩選兒童哮喘不同病情控制水平血清差異蛋白

劉姬艷1，王 瑛1，王遠(yuǎn)照2，朱佳文2，戴芳甸1

1杭州師范大學(xué) 生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，杭州 3100362浙江中醫(yī)藥大學(xué) 附屬第一醫(yī)院兒科，杭州 310006

目的從整體蛋白水平研究不同控制水平兒童哮喘患者血清的差異性蛋白，為防治兒童哮喘提供依據(jù)。方法采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量標(biāo)記結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜定量蛋白組學(xué)技術(shù)篩選鑒定控制、部分控制和未控制兒童哮喘患者血清中差異表達(dá)蛋白，通過酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法進(jìn)行差異蛋白驗(yàn)證。結(jié)果共鑒定蛋白260種，篩選出不同控制水平兒童哮喘間兩兩比較均有差異的蛋白57種(變化倍數(shù)<0.8或變化倍數(shù)>1.2)，主要參與21種生物過程，主要具有8種分子功能類型，主要為17種細(xì)胞成分類型。酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定結(jié)果顯示控制組的玻連蛋白含量(573.92±412.43)μg/ml高于未控制組的(382.27±238.64)μg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.0399)。結(jié)論發(fā)現(xiàn)不同病情控制水平兒童哮喘患者血清中的差異性蛋白57種，這些差異蛋白可作為控制兒童哮喘的潛在生物學(xué)靶點(diǎn)。

兒童哮喘；定量蛋白組學(xué)；差異性蛋白；質(zhì)譜

支氣管哮喘(以下簡稱哮喘)是嚴(yán)重影響人類健康的慢性氣道炎癥性疾病，世界衛(wèi)生組織估計(jì)全球由于哮喘喪失的傷殘調(diào)整生命年數(shù)目每年達(dá)到1380萬，約占總傷殘調(diào)整生命年的1.8%[1]，全球哮喘患病率為2.62‰～4‰，其中5歲以下兒童的患病率達(dá)8.1‰～14‰[2]。哮喘作為兒童期常見的疾病，嚴(yán)重威脅兒童的身心健康和成長，及時(shí)有效地控制哮喘需要在臨床上正確評(píng)估病情控制水平，才能選擇合適的治療方案。目前全球哮喘防治創(chuàng)議根據(jù)哮喘的控制程度將疾病嚴(yán)重度分為控制、部分控制和未控制[3- 4]。對(duì)于病情控制程度的評(píng)估主要基于臨床癥狀的評(píng)估和肺功能等體格檢查，但臨床癥狀缺乏指標(biāo)的金標(biāo)準(zhǔn)，而肺功能測(cè)定及支氣管激發(fā)試驗(yàn)在幼齡兒童也并不可靠[5]，因此，目前臨床對(duì)于兒童哮喘病情控制程度的評(píng)估尚缺乏更為精準(zhǔn)和敏感的客觀指標(biāo)，以動(dòng)態(tài)地監(jiān)測(cè)疾病進(jìn)展。本研究采用同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量標(biāo)記結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù) (isobaric tags for relative and absolute quantification，two-dimensional liquid chromatography，nanoelectrospray ionization and high-resolution tandem mass spectrometry using the hybrid quadrupole time-of-flight platform，iTRAQ- 2DLC-MS/MS)尋找鑒定不同控制水平兒童哮喘患者血清中差異表達(dá)的蛋白，試圖從整體蛋白水平研究兒童哮喘不同病情控制水平的差異蛋白質(zhì)，以獲得能反映兒童哮喘病情控制水平的蛋白標(biāo)志物。

對(duì)象和方法

對(duì)象選取2014年12月至2015年5月浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院兒科就診的哮喘兒童患者165例。哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2014年全球哮喘防治創(chuàng)議[6]，不同病情控制水平的兒童哮喘組按全球哮喘防治創(chuàng)議方案評(píng)估病情控制水平[4]，分為控制組、部分控制組、未控制組。排除同時(shí)合并有除呼吸系統(tǒng)疾病以外的其他疾病診斷者；懷疑或已經(jīng)診斷為活動(dòng)性肺結(jié)核、肺膿腫等呼吸系統(tǒng)疾病者；近4周內(nèi)患有呼吸道感染者，如咽炎、支氣管炎、肺炎等患者。本研究經(jīng)杭州師范大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所選患者均簽署知情同意書。

材料和儀器Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；iTRAQ標(biāo)記試劑- 8 plex購自AB sciex公司；Spin-X 0.22 μm超濾管購自Corning公司；VIVACON 500 10K Da超濾管購自Sartorius公司，人玻連蛋白酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA)試劑盒購自Raybiotech公司。人14 多重親和去除系統(tǒng)色譜柱購自Agilent公司；LTQ Velos質(zhì)譜儀購自Thermo公司；Q-Exactive 質(zhì)譜儀購自Thermo公司；EASY色譜柱購自Thermo scientific公司；AKTA Purifier 100色譜購自GE Healthcare公司；超聲波系統(tǒng)150- 96購自Biosafer公司；真空離心濃縮儀購自Eppendorf公司；小膠電泳系統(tǒng)Mini-PROTEAN Tetr購自BioRad公司，酶標(biāo)儀購自Thermo公司。

樣本收集抽取空腹患者周圍靜脈全血3 ml，4℃垂直放置1～2 h，使血液凝結(jié)，4000×g離心10 min，取血清儲(chǔ)存于-80℃冰箱備用，避免反復(fù)凍融。

去除血清高豐度蛋白控制組、部分控制組和未控制組患者各15例的血清樣本分別混合后使用人14多重親和去除系統(tǒng)色譜柱去除各組血清中14種高豐度蛋白質(zhì)，去除高豐度蛋白后的各組樣本收集低豐度洗脫峰并合并，使用15 ml 5K Da超濾管進(jìn)行超濾濃縮，并用25 mmol/L碳酸氫銨溶液進(jìn)行置換，保持最后的總體積為40 μl。向各組樣本中加入40 μl裂解液(4% 十二烷基硫酸鈉，pH 8.0 100 mmol/L Tris HCl，100 mmol/L二硫蘇糖醇)，充分混勻，100℃加熱5 min，BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量后用聚丙烯酰氨凝膠電泳分離，觀察高豐度蛋白去除效果。

樣品酶解3組樣品各取300 μg，每份樣品加入200 μl 蛋白水化液(8 mol/L尿素、150 mmol/L Tris-HCl pH 8.5)混勻，轉(zhuǎn)移至30K Da超濾管中，14 000×g室溫離心30 min，棄濾出液，重復(fù)3次。加入100 μl 碘乙酰胺(iodoacetamide，IAA)(50 mmol/L IAA 于尿素中)，于恒溫混勻儀上600 r/min振蕩混勻1 min，避光室溫 300 r/min孵育30 min，14 000×g 室溫離心 30 min。加入100 μl蛋白水化液室溫14 000×g離心30 min，重復(fù)3次。加入100 μl 1/10溶解緩沖液(500 mmol/L 三乙基碳酸氫銨)，室溫14 000×g離心30 min，重復(fù)3次。最后棄濾出液并加入40 μl 胰酶溶液(2 μg 胰酶置于40 μl 1/10 溶解緩沖液中)，放置恒溫混勻儀上(300 r/min，18 h，37 ℃)。室溫14 000×g離心30 min，收集濾出液，換新收集管，加入40 μl 25 mmol/L 1/10 溶解緩沖液，室溫14 000×g離心30 min，取濾液，光密度280肽段定量。

iTRAQ試劑標(biāo)記各組樣品分別取約100 μg，按照AB公司iTRAQ Reagent- 8plex Multiplex Kit(AB SCIEX)試劑盒說明書進(jìn)行標(biāo)記，其中控制組報(bào)告標(biāo)簽為116、部分控制組報(bào)告標(biāo)簽為115、未控制組報(bào)告標(biāo)簽為114。將標(biāo)記后的所有肽段分別混合，進(jìn)行強(qiáng)陽離子交換色譜柱預(yù)分級(jí)。采用蛋白純化系統(tǒng)AKTA Purifier 100 (GE Healthcare)，色譜柱：肽陽離子交換色譜柱Polysulfoethyl 4.6 mm×100 mm(5 μm，200?) (PolyLCInc，Maryland，USA)；緩沖液：緩沖液A 為10 mmol/L KH2PO4pH 3.0，25%乙腈；緩沖液 B 為10 mmol/L KH2PO4pH 3.0，500 mmol/L KCl，25% 乙腈。每次強(qiáng)陽離子交換色譜柱分級(jí)后，收集穿流及洗脫片段約40份，根據(jù)色譜圖合并成6份，凍干后C18 墨盒(Sigma)脫鹽。

高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用每份分級(jí)樣品采用納升級(jí)液相色譜系統(tǒng)Easy nLC進(jìn)行分離。緩沖液：A液為0.1%甲酸水溶液，B液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%)。色譜柱以95%的A液平衡。樣品由自動(dòng)進(jìn)樣器上樣到上樣柱Thermo scientific EASY column(2 cm×100 μm 5 μm-C18)，再經(jīng)分析柱Thermo scientific EASY column(75 μm×100 mm 3 μm-C18)分離，流速為250 nl/min。樣品分離后用Obitrap-Elite質(zhì)譜儀(Thermo Finnigan)進(jìn)行質(zhì)譜分析。分析時(shí)長：120 min，檢測(cè)方式：正離子，母離子掃描范圍：300～1800 m/z，一級(jí)質(zhì)譜200 m/z處分辨率為70 000，自動(dòng)增益控制值為3e6，一級(jí)離子注入時(shí)間為10 ms，掃描范圍數(shù)目：1，動(dòng)態(tài)排除：40.0 s。多肽和多肽碎片的質(zhì)量電荷比按照下列方法采集：每次全掃描后采集10個(gè)碎片圖譜，二級(jí)質(zhì)譜激活類型為：HCD，隔離窗口：2 m/z，二級(jí)質(zhì)譜在200 m/z處分辨率為17 500，二級(jí)離子注入時(shí)間為60 ms，碰撞能量歸一：30 eV，填充率：0.1 %。

蛋白的鑒定與定量質(zhì)譜分析原始數(shù)據(jù)為RAW文件，用軟件Protein Discovery 1.4進(jìn)行查庫鑒定、定量和數(shù)據(jù)分析。本次使用數(shù)據(jù)庫：Uniprot_human_20150723_147897.fasta(蛋白質(zhì)序列共147 897條，下載日期為20150723)。搜庫參數(shù)如下：單一同位素峰檢測(cè)、胰酶酶切、允許最大兩個(gè)漏切位點(diǎn)、固定修飾為半胱氨酸脲甲基化、可變修飾為蛋氨酸的氧化、iTRAQ- 8plex(K)、iTRAQ- 8plex(N-Term)。肽段價(jià)態(tài)為：2+、3+和4+，母離子誤差：20 ppm，MS/MS 誤差 0.1 Da。軟件抽提肽段報(bào)告離子峰強(qiáng)度值信息，肽段定量結(jié)果為參考樣品所在標(biāo)簽的信號(hào)強(qiáng)度值與內(nèi)標(biāo)的信號(hào)強(qiáng)度值的比值。蛋白質(zhì)定量結(jié)果為鑒定肽段定量結(jié)果的中位數(shù)。檢索結(jié)果使用Protein FDR≤0.01，PSM FDR≤0.01篩選過濾，變化倍數(shù)<0.8為下調(diào)蛋白，變化倍數(shù)>1.2為上調(diào)蛋白。

生物信息學(xué)分析利用DAVID(版本：6.8，http：//david.ncifcrf.gov)進(jìn)行基因功能注釋(gene ontology，GO)功能分析，對(duì)蛋白進(jìn)行細(xì)胞成分、分子功能和生物過程的功能分類分析和功能富集分析。利用京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集分析。利用檢索相互作用基因/蛋白質(zhì)的搜索工具軟件(http：//string.embl.de/)進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)分析。

ELISA法驗(yàn)證差異蛋白選取兒童哮喘不同控制水平間差異蛋白玻連蛋白，采用人玻連蛋白ELISA試劑檢測(cè)控制組兒童哮喘患者、部分控制組兒童哮喘患者和未控制組兒童哮喘患者血清中玻連蛋白的含量。根據(jù)ELISA試劑盒(Raybiotech)說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，血清稀釋倍數(shù)為1∶ 10 000。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行單因素方差分析的Tukey post-hoc test法分析ELISA驗(yàn)證結(jié)果。

結(jié) 果

一般資料共收集165例兒童哮喘患者的血清樣本，控制組共55例，其中男28例、女27例，年齡(5.72±1.78)歲；部分控制組共55例，其中男37例、女18例，年齡(5.76±1.79)歲；未控制組共55例，其中男36例，女19例，年齡(5.43±3.03)歲。3組間性別、年齡兩兩比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(控制組比部分控制組：年齡t=0.1175，P=0.9067；性別χ2=3.046，P=0.081；控制組比未控制組：年齡t=0.6120，P=0.5418；性別χ2=2.391，P=0.122；部分控制組比未控制組：年齡t=0.6954，P=0.4883；性別χ2=0.041，P=0.840)。

差異蛋白的篩選通過iTRAQ-2DLC-MS/MS分析，比較控制組、部分控制組、未控制組的iTRAQ報(bào)告離子強(qiáng)度比值被用于計(jì)算蛋白表達(dá)的倍數(shù)變化，獲得這3組的總蛋白有260個(gè)，總肽段有1753個(gè)，唯一性肽段有1379個(gè)。對(duì)控制組、部分控制組、未控制組進(jìn)行兩兩比較，選擇變化倍數(shù)<0.8或>1.2的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)共有57個(gè)蛋白質(zhì)在兒童哮喘不同病情控制水平組之間兩兩比較均有差異性表達(dá)(變化倍數(shù)<0.8或變化倍數(shù)>1.2)(表1)。

表 1 不同病情控制水平兒童哮喘血清iTRAQ結(jié)合二維液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)分析差異蛋白Table 1 Differentially expressed proteins quantified by iTRAQ，two-dimensional liquid chromatography，nanoelectrospray ionization，and high-resolution tandem mass spectrometry using the hybrid quadrupole time-of-flight platform analysis

續(xù)表1

續(xù)表1

iTRAQ:同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量標(biāo)記

iTRAQ：isobaric tags for relative and absolute quantification

差異蛋白的功能聚類和通路富集分析利用GO分析，分別從57個(gè)差異蛋白涉及的生物過程、分子功能及細(xì)胞成分對(duì)差異蛋白進(jìn)行分析。本實(shí)驗(yàn)篩選的差異蛋白中的53個(gè)差異蛋白參與諸多的生物過程，其中包括21個(gè)重要的生物過程，主要涉及代謝過程、定位、響應(yīng)刺激、免疫系統(tǒng)過程、信號(hào)等；根據(jù)分子功能注釋，差異蛋白中的52個(gè)蛋白主要具有8種分子功能，包括轉(zhuǎn)運(yùn)活性、結(jié)合功能、催化活性、分子功能調(diào)節(jié)器等；通過細(xì)胞成分分析，差異蛋白中的53個(gè)蛋白主要定位在17種不同的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，包括胞外區(qū)域、細(xì)胞器、細(xì)胞膜、細(xì)胞連接等(圖1A)。利用通路富集 KEGG分析顯示，57個(gè)差異蛋白中27個(gè)蛋白主要涉及44個(gè)通路，其中參與補(bǔ)體和凝血級(jí)聯(lián)反應(yīng)通路的差異蛋白有15個(gè)(圖1B)，通過蛋白網(wǎng)絡(luò)分析顯示差異蛋白具有緊密的功能聯(lián)系(圖1C)。

APOD：載脂蛋白D；APCS：血清淀粉樣P成分；APOE：載脂蛋白E；CA2：碳酸酐酶2；LYVE1：淋巴管內(nèi)皮透明質(zhì)酸受體1；HPX：血紅素結(jié)合蛋白；MBL2：甘露糖結(jié)合蛋白C；CD5L：CD抗原樣蛋白；GC：維生素D結(jié)合蛋白；SERPINA3：1-抗糜蛋白酶；KRT9：角蛋白Ⅰ型細(xì)胞骨架9；KRT10：角蛋白Ⅰ型細(xì)胞骨架10；SERPINF2：2-抗纖溶酶；AHSG：2-HS-糖蛋白；VTN：玻連蛋白；C4B：補(bǔ)體 C4-B；C4A：補(bǔ)體 C4-A；PF4：血小板因子4；SERPINA7：甲狀腺素結(jié)合球蛋白；C5：補(bǔ)體C5；C8A：補(bǔ)體C8α鏈；C8G：補(bǔ)體C8γ鏈；SERPINC1：抗凝血酶Ⅲ；F5：凝血因子Ⅴ；AMBP：AMBP蛋白；HPR：結(jié)合珠蛋白相關(guān)蛋白；HBD：血紅蛋白δ亞基；DPP4：二肽基肽酶4；PGLYRP2：N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酸酰胺酶；SERPIND1：肝素輔因子2；F10：凝血因子X；CPB2：羧肽酶B；BTD：生物素酶；GP5：血小板糖蛋白 V；SERPINA5：血漿絲氨酸蛋白酶抑制劑；HABP2：透明質(zhì)酸結(jié)合蛋白2；ENSG00000224916：載脂蛋白C-Ⅱ；HBA：血紅蛋白α亞基

APOD：apolipoprotein D；APCS：serum amyloid P-component；APOE：apolipoprotein E；CA2：carbonic anhydrase 2；LYVE1：lymphatic vessel endothelial hyaluronic acid receptor 1；HPX：hemopexin；MBL2：mannose-binding protein C；CD5L：CD5 antigen-like；GC：vitamin D-binding protein；SERPINA3：alpha- 1-antichymotrypsin；KRT9：keratin，type Ⅰ cytoskeletal 9；KRT10：keratin，type Ⅰ cytoskeletal 10；SERPINF2：alpha- 2-antiplasmin；AHSG：alpha- 2-HS-glycoprotein；VTN：vitronectin；C4B：complement C4-B；C4A：complement C4-A；PF4：platelet factor 4；SERPINA7：thyroxine-binding globulin；C5：complement C5；C8A：complement component C8 alpha chain；C8G：complement component C8 gamma chain；SERPINC1：antithrombin-Ⅲ；F5：coagulation factor Ⅴ；AMBP：protein AMBP；HPR：haptoglobin-related protein；HBD：hemoglobin subunit delta；DPP4：dipeptidyl peptidase 4；PGLYRP2：N-acetylmuramoyl-L-alanine amidase；SERPIND1：heparin cofactor 2；F10：coagulation factor X；CPB2：carboxypeptidase B2；BTD：biotinidase；GP5：platelet glycoprotein Ⅴ；SERPINA5：plasma serine protease inhibitor；HABP2：hyaluronan-binding protein 2；ENSG00000224916：apolipoprotein C-Ⅱ；HBA：hemoglobin subunit alpha

A. 基因功能注釋富集分析；B. 通路富集分析；C. 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析

A. gene ontology function enrichment analysis；B. pathway enrichment analysis；C. protein-protein interaction network analysis

圖1差異蛋白功能聚類和通路富集分析

Fig1Functional clustering and pathway enrichment analysis of differentially expressed proteins

差異蛋白ELISA驗(yàn)證采用ELISA試劑盒檢測(cè)40例控制組兒童哮喘患者、40例部分控制組兒童哮喘患者和40例未控制組兒童哮喘患者血清中玻連蛋白含量。One-way ANOVA 分析顯示，控制組的玻連蛋白含量(573.92±412.43)μg/ml高于未控制組的(382.27±238.64)μg/ml(P=0.0399)(圖2)。

討 論

隨著哮喘的發(fā)病及病情的進(jìn)展，機(jī)體內(nèi)的相關(guān)蛋白水平隨之發(fā)生動(dòng)態(tài)變化。日益完善的蛋白組學(xué)技術(shù)為從整體水平高通量動(dòng)態(tài)地研究哮喘和相關(guān)蛋白之間的關(guān)系，以及蛋白間的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供方法[7]。近年蛋白組學(xué)技術(shù)在哮喘診斷治療、病情評(píng)估監(jiān)測(cè)、致病機(jī)制闡明等應(yīng)用中進(jìn)展快速[8]，盧洪華等[9]采用二維差異凝膠電泳結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜的蛋白組學(xué)技術(shù)研究穩(wěn)定期哮喘兒童和健康兒童血漿中的差異蛋白，結(jié)果顯示穩(wěn)定期哮喘兒童的抗凝血酶Ⅲ表達(dá)高于對(duì)照組，α2-巨球蛋白和補(bǔ)體C3表達(dá)低于健康對(duì)照組。Verrills等[10]采用二維差異凝膠電泳結(jié)合基質(zhì)輔助激光解吸/電離-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)從哮喘患者血漿中篩選了相比健康對(duì)照組，在哮喘組顯著高表達(dá)的結(jié)合珠蛋白、血漿銅藍(lán)蛋白和血紅素結(jié)合蛋白。

iTRAQ- 2DLC-MS/MS技術(shù)是將iTRAQ穩(wěn)定同位素標(biāo)記技術(shù)、二維液相色譜技術(shù)和串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)聯(lián)用的定量蛋白組學(xué)技術(shù)平臺(tái)，具有高通量、高靈敏度、較好的定量效果、較高重復(fù)性等特點(diǎn)[11- 13]。本研究以iTRAQ- 2DLC-MS/MS技術(shù)尋找和鑒定57個(gè)兒童哮喘不同控制

aP=0.0399

圖2不同控制水平兒童哮喘患者血清玻連蛋白表達(dá)水平

Fig2Serum vitronectin levels among childhood asthma patients at different control levels

水平的血清差異蛋白(變化倍數(shù)<0.8或變化倍數(shù)>1.2)，相關(guān)差異表達(dá)蛋白主要參與人體21種重要的生物過程，主要具有8種分子功能類型和17種細(xì)胞成分類型，主要參與44個(gè)通路。iTRAQ- 2DLC-MS/MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異比值和生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示，玻連蛋白在控制組兒童哮喘患者、部分控制組兒童哮喘患者和未控制組兒童哮喘患者血清中的含量呈逐漸降低趨勢(shì)。文獻(xiàn)報(bào)道肺上皮損傷是許多肺部疾病如哮喘的發(fā)病機(jī)制，因此，上皮修復(fù)對(duì)于肺內(nèi)平衡起著至關(guān)重要的作用，同時(shí)可以治療炎癥和防止瘢痕形成[14]。玻連蛋白作為一種主要的細(xì)胞外基質(zhì)成分，在損傷后的上皮修復(fù)中發(fā)揮重要作用。本研究對(duì)玻連蛋白采用ELISA法擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示兒童哮喘控制組的玻連蛋白含量高于未控制組(P<0.05)，玻連蛋白在兒童哮喘控制組、部分控制組和未控制組血清中的含量變化趨勢(shì)與iTRAQ- 2DLC-MS/MS實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符。

玻連蛋白是一種相對(duì)分子質(zhì)量75 000的黏附糖蛋白，是整合素家族成員之一，涉及多種生物學(xué)過程，包括凝血途徑的調(diào)節(jié)、膜攻擊復(fù)合物的形成、細(xì)胞黏附和遷移、傷口愈合和組織重塑[15]。在呼吸系統(tǒng)，有研究表明玻連蛋白在呼出氣冷凝液中存在[16]。Salazar-Peláez等[17]采用免疫組織化學(xué)分析和三維激光共聚焦圖像的共定位分析研究哮喘和健康對(duì)照支氣管組織和支氣管上皮細(xì)胞，結(jié)果顯示玻連蛋白在哮喘患者中低表達(dá)。Kadowaki等[18]研究顯示乳腺導(dǎo)管癌患者的血清玻連蛋白水平顯著高于健康對(duì)照，可作為原發(fā)性乳腺癌診斷中的血清標(biāo)志物。舒博等[19]研究顯示，在良性前列腺增生患者的血清中玻連蛋白含量高于前列腺癌未轉(zhuǎn)移患者，而前列腺癌未轉(zhuǎn)移患者血清中的玻連蛋白含量高于前列腺癌轉(zhuǎn)移患者，提示玻連蛋白可能與前列腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)移相關(guān)，血清的玻連蛋白有助于前列腺癌的診斷和疾病進(jìn)展評(píng)估。另外，Koukoulis等[20]研究顯示玻連蛋白可被作為肝臟纖維化的生物標(biāo)志物。

綜上，本研究對(duì)不同病情控制水平的兒童哮喘血清中的玻連蛋白含量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示未控制組兒童哮喘中玻連蛋白低于控制組。玻連蛋白在未控制兒童哮喘血清中的下調(diào)機(jī)制尚不明確，尚需在后續(xù)研究進(jìn)一步闡明，玻連蛋白可能為兒童哮喘評(píng)估不同病情控制水平潛在標(biāo)志物，可在臨床和功能方面進(jìn)一步驗(yàn)證。

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ScreeningSerumDifferentialProteinsforChildhoodAsthmaatDifferentControlLevelsbyIsobaricTagsforRelativeandAbsoluteQuantification-basedProteomicTechnology

LIU Jiyan1，WANG Ying1，WANG Yuanzhao2，ZHU Jiawen2，DAI Fangdian1

1College of Life and Environmental Science，Hangzhou Normal University，Hangzhou 310036，China2Department of Pediatrics，the First Affiliated Hospital of Zhejiang Chinese Medical University，Hangzhou 310006，China

LIU Jiyan Tel：0571- 81316321，E-mail：liujiyan_garce@163.com

ObjectiveTo screen serum differential proteins for childhood asthma at different control levels，which provided the basis for the prevention and treatment of childhood asthma.MethodsIsobaric tags for relative and absolute quantification，two-dimensional liquid chromatography，nanoelectrospray ionization，and high-resolution tandem mass spectrometry using the hybrid quadrupole time-of-flight platform was used to screen the differential proteins in serum samples from pediatric patients with controlled，partly controlled，or uncontrolled childhood asthma. Differential proteins were validated using enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA).ResultsA total of 260 expressed proteins were identified. Among them 57 differentially expressed proteins were found among the different control levels of childhood asthma (fold<0.8 or fold>1.2). The differentially expressed proteins were involved mainly in 21 biological processes and 8 molecular functions and were located in 17 cellular components. ELISA showed that the serum vitronectin level was significantly higher in controlled group [(573.92±412.43) μg/ml] than in uncontrolled group[(382.27±238.64)]μg/ml (P=0.0399).ConclusionWe identified 57 differential proteins for childhood asthma at different control levels，which may be used as potential biological targets for the control of childhood asthma.

childhood asthma；quantitative proteomics；differential proteins；mass spectrometry

ActaAcadMedSin，2017,39(6)：817-826

浙江省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2015C33266)、杭州市科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(20150633B01)和國家自然科學(xué)基金(81403280) Supported by the Science and Technology Plan Project of Zhejiang Province(2015C33266)，Hangzhou Science and Technology Development Plan Project(20150633B01)，and the National Natural Sciences Foundation of China (81403280)

劉姬艷 電話：0571- 81316321，電子郵件：liujiyan_garce@163.com

R562.2

A

1000- 503X(2017)06- 0817- 10

10.3881/j.issn.1000- 503X.2017.06.014

2017- 09- 19)