miR-222通過MMP1對增生性瘢痕成纖維細胞的調(diào)控機制研究

張誼 張璃 張啟瑜 洪煒龍 林孝華

●論 著

miR-222通過MMP1對增生性瘢痕成纖維細胞的調(diào)控機制研究

張誼 張璃 張啟瑜 洪煒龍 林孝華

目的 觀察成纖維膠原酶1（MMP1）和miR-222在增生性瘢痕（HS）成纖維細胞中的表達水平，探討miR-222對HS發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控機制。方法 選取36例HS患者的HS組織，并各留取HS旁正常組織作為對照。分離培養(yǎng)出HS組織與正常組織的成纖維細胞；采用RT-PCR法檢測成纖維細胞MMP1 mRNA和miR-222表達水平；采用Western blot法檢測成纖維細胞MMP1蛋白表達水平；采用MTT法檢測成纖維細胞增殖情況；采用雙熒光素酶報告實驗檢測miR-222是否可調(diào)控MMP1基因。結(jié)果 與正常組織比較，HS組織成纖維細胞MMP1 mRNA、蛋白表達水平均下調(diào)（均P＜0.05），miR-222表達水平上調(diào)（P＜0.05）。與空白對照成纖維細胞比較，HS組織轉(zhuǎn)染MMP1過表達質(zhì)粒后的成纖維細胞MMP1 mRNA、蛋白表達水平均上調(diào)（均P＜0.05），增殖速度明顯減慢（P＜0.05）；轉(zhuǎn)染antagomiR-222質(zhì)粒后的成纖維細胞miR-222表達水平下調(diào)（P＜0.05），MMP1 mRNA表達水平上調(diào)（P＜0.05），增殖速度明顯減慢（P＜0.05）。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果表明miR-222能與MMP1基因的3′-UTR區(qū)相結(jié)合，從而調(diào)控其表達。結(jié)論 miR-222在HS組織中存在過表達，miR-222或通過負調(diào)控其靶基因MMP1的表達而發(fā)揮其調(diào)控成纖維細胞增殖和凋亡的作用。

增生性瘢痕 microRNA-222 基質(zhì)金屬蛋白酶1

皮膚創(chuàng)傷后常因膠原沉積和降解失衡形成增生性瘢痕（hypertrophic scar，HS）?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）可降解細胞外基質(zhì)（ECM）和膠原，在細胞對外環(huán)境刺激的反應(yīng)中起重要作用。MMPs不僅可以水解蛋白質(zhì)，阻斷ECM的合成，還能調(diào)控細胞間或細胞與外環(huán)境間的相互作用[1]。MMP1又稱成纖維膠原酶1，是皮膚膠原降解的關(guān)鍵酶，在HS的形成中起重要作用[2]。microRNA（miR）是一類由內(nèi)源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，上調(diào)相應(yīng)microRNAs抑制MMP1表達可影響皮膚的纖維化[3]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-222的作用靶點為MMP1，可調(diào)控舌鱗狀癌細胞的生物功能[4]。目前，miR-222在HS組織成纖維細胞中的調(diào)控作用報道少見。本研究旨在觀察MMP1和miR-222在HS組織成纖維細胞中的表達水平，探討miR-222對HS發(fā)生、發(fā)展的調(diào)控機制，現(xiàn)報道如下。

1 對象和方法

1.1 對象 選取2013年8月至2016年5月在本院確診的HS患者36例，其中男20例，女16例；年齡17～61歲，中位年齡45.6歲。患者均無激素、中藥使用史及放、化療史；HS均由燒傷所致，符合POSAS標準[5]。

1.2 試劑和儀器 miRcute miRNA分離/熒光定量試劑盒（TIANGEN公司），miRcute miRNA cDNA/TIANScriptⅡcDNA第一鏈合成試劑盒（TIANGEN公司）；qRTPCR儀（美國Bio-Rad公司），GloMax 20/20光度計（Promega公司），Dual-Luciferase Reporter Assay System（Promega公司），MMP1一抗（Abcam 公司），β-actin（Abcam公司），二抗（Abcam公司），Trizol試劑（翊圣生物公司），BCA蛋白濃度測定試劑盒（中科瑞泰公司），細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒（MTT法）（基爾頓生物公司），質(zhì)粒/siRNA/agomiR（上海生工生物科技公司）。

1.3 方法

1.3.1 標本收集 在患者瘢痕切除手術(shù)后，從術(shù)中切除標本中切取HS組織和HS旁正常組織，液氮保存。檢測時將組織轉(zhuǎn)入裝有液氮的研缽中，磨成粉末，收集到EP管用于提取mRNA和蛋白。

1.3.2 成纖維細胞分離培養(yǎng) 0.1mol/L PBS沖洗HS組織及正常組織3次，剪除碎屑和表皮；0.25%Dispase過夜消化，分離表皮。剪碎組織至肉泥狀，0.1%Ⅰ型膠原酶溶液37℃振蕩消化180min。以等量體積含10%FBS的 LG-DMEM培養(yǎng)液終止消化，1 200rpm離心10min，棄去上清液，獲得細胞團，高糖培養(yǎng)液重懸，以4×104個/cm2密度接種于培養(yǎng)皿，37℃、5%二氧化碳、100%濕度條件下培養(yǎng)，24h后第1次換液，以后隔日換1次，待細胞長成單層后消化傳代。

1.3.3 RT-PCR法檢測MMP1 mRNA和miR-222表達水平 每100mg組織加入1ml Trizol裂解，酚氯仿法抽取總RNA，凝膠電泳檢測RNA條帶的完整性，測量RNA 260/280的比值檢測RNA純度，取總RNA 1μg進行逆轉(zhuǎn)錄，模板cDNA-20℃保存。MMP1上游引物：5′-ATTCTACTGATATCGGGGCTT TGA-3′，下游引物：5′-ATGTCCTTGGGGTATCCGTGTAG-3′。miR-222 上游引物：5′-CGCAGCTACATCTGGCTACTG-3′，下游引物：5′-GTGCAGGGT CCGAGGT-3′。GAPDH 上游引物：5′-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3′， 下 游 引 物 ：5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。采用 2-ΔΔCt法計算，與GAPDH比值作為mRNA表達水平。

1.3.4 Western blot法檢測MMP1蛋白表達水平 每100mg組織加200μl蛋白裂解液，冰上裂解30min。12 000rpm，4℃離心15min，取上清液。用BCA蛋白濃度檢測試劑盒測定蛋白樣品濃度后，加SDS-PAGE上樣緩沖液煮沸5min。取20μg蛋白質(zhì)，10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，冰浴下100V恒壓轉(zhuǎn)膜2h，5%脫脂牛奶室溫封閉 1h，加 MMP1 一抗（1∶500），β-actin（1∶5 000）4℃孵育過夜，二抗（1∶3 000）室溫孵育 1h。將膜置于ECL發(fā)光液中反應(yīng)，于凝膠成像系統(tǒng)中曝光，用image lab 3.0軟件獲取圖像并分析，用目的蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參β-actin條帶的灰度值之比為作為目的蛋白的表達水平。

1.3.5 MTT法檢測成纖維細胞的增殖情況 采用脂質(zhì)體法為成纖維細胞轉(zhuǎn)染MMP1過表達質(zhì)粒pcdna，并設(shè)置空白對照。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后將待檢測細胞按2×103/孔密度種在96孔板上，每孔設(shè)3個復(fù)孔，分別在24、48、72h加入20μl濃度5g/L MTT，最后1d加入150μl DMSO溶解紫色結(jié)晶，37℃孵育4h后在490nm波長處測吸光度，繪制細胞增殖曲線。

1.3.6 雙熒光素酶報告實驗用miRanda、TargetScan、PiTa、RNAhybrid和PICTA等靶基因預(yù)測軟件檢索調(diào)控MMP1的基因，發(fā)現(xiàn)miR-222可能調(diào)控MMP1基因，見圖1。合成MMP1基因的3′-UTR區(qū)的miR-222正常種子區(qū)，在兩端加上Spe-1及HindⅢ酶切位點，將DNA片段克隆至pMIR-REPORT熒光素酶報告質(zhì)粒上。用脂質(zhì)體法將帶有3′-UTR DNA序列的0.8μg的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染原代成纖維細胞，然后轉(zhuǎn)染antagomiR-222（100nmol/L）培養(yǎng)24h，裂解細胞，測熒光值。以Renilla熒光活性為內(nèi)參。

圖1 miR-222可能是調(diào)控MMP1基因

1.4 統(tǒng)計學處理 應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計軟件；計量資料以表示，組間比較采用配對t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HS組織與正常組織成纖維細胞MMP1 mRNA、蛋白表達水平比較 見圖2。

圖2 HS組織與正常組織成纖維細胞MMP1 mRNA、蛋白表達水平比較（a∶mRNA；b∶蛋白；與正常組織比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖2可見，HS組織與正常組織成纖維細胞MMP1 mRNA 表達水平分別為 0.31±0.12、1.00±0.19，MMP1 蛋白表達水平分別為 0.48±0.02、1.00±0.12。與正常組織比較，HS組織成纖維細胞MMP1 mRNA、蛋白表達水平均下調(diào)（均P＜0.05）。

2.2 HS組織成纖維細胞轉(zhuǎn)染MMP1過表達質(zhì)粒pcdna后的MMP1 mRNA、蛋白表達水平及增殖速度與空白對照成纖維細胞比較 見圖3、4。

圖3 HS組織成纖維細胞轉(zhuǎn)染MMP1過表達質(zhì)粒pcdna后的MMP1 mRNA、蛋白表達水平與空白對照成纖維細胞比較（a∶mRNA；b∶蛋白；與空白對照比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

由圖3可見，HS組織成纖維細胞轉(zhuǎn)染MMP1過表達質(zhì)粒pcdna后的MMP1 mRNA、蛋白表達水平分別為3.81±0.32、2.04±0.26，空白對照成纖維細胞的 MMP1mRNA、蛋白表達水平分別為 1.00±0.10、1.00±0.17。與空白對照成纖維細胞比較，HS組織轉(zhuǎn)染MMP1過表達質(zhì)粒pcdna后的成纖維細胞MMP1 mRNA、蛋白表達水平均上調(diào)（均P＜0.05）。由圖4可見，與空白對照成纖維細胞比較，HS組織轉(zhuǎn)染MMP1過表達質(zhì)粒pcdna后的成纖維細胞48、72h的增殖速度均明顯減慢（均P＜0.05）。

2.3 HS組織與正常組織成纖維細胞miR-222表達水平比較 見圖5。

圖4 HS組織成纖維細胞轉(zhuǎn)染MMP1過表達質(zhì)粒pcdna后的增殖速度與空白對照成纖維細胞比較（與空白對照比較，*P＜0.05）

圖5 HS組織與正常組織成纖維細胞miR-222表達水平比較（與正常組織比較，*P＜0.05）

由圖5可見，HS組織與正常組織成纖維細胞miR-222 表達水平分別為 2.51±0.22、1.00±0.09。與正常組織比較，HS組織成纖維細胞miR-222表達水平明顯上調(diào)（P＜0.05）。

2.4 雙熒光素酶報告實驗結(jié)果 共轉(zhuǎn)染antagomiR-222和pMIR-REPORT質(zhì)粒后的成纖維細胞熒光值低于與空白對照的成纖維細胞（P＜0.05），表明miR-222能與MMP1基因的3′-UTR區(qū)相結(jié)合，從而調(diào)控其表達。

2.5 HS組織成纖維細胞轉(zhuǎn)染antagomiR-222質(zhì)粒后miR-222、MMP1 mRNA表達水平及增殖速度與空白對照成纖維細胞比較 見圖6、7。

由圖6可見，HS組織成纖維細胞轉(zhuǎn)染antagomiR-222質(zhì)粒后miR-222、MMP1 mRNA表達水平分別為0.40±0.22、1.86±0.59，空白對照成纖維細胞 miR-222、MMP1 mRNA 表達水平分別為 1.00±0.09、1.02±0.07。與空白對照成纖維細胞比較，HS組織轉(zhuǎn)染antagomiR-222質(zhì)粒后的成纖維細胞miR-222表達水平下調(diào)（P＜0.05），MMP1 mRNA 表達水平上調(diào)（P＜0.05）。由圖 7可見，與空白對照成纖維細胞比較，HS組織轉(zhuǎn)染antagomiR-222質(zhì)粒后的成纖維細胞48、72h的增殖速度均明顯減慢（均 P＜0.05）。

圖6 6 HS組織成纖維細胞轉(zhuǎn)染antagomiR-222質(zhì)粒后miR-222、MMP1 mRNA表達水平與空白對照成纖維細胞比較（與空白對照比較，*P＜0.05，**P＜0.01）

圖7 HS組織成纖維細胞轉(zhuǎn)染antagomiR-222質(zhì)粒后增殖速度與空白對照成纖維細胞比較（與空白對照比較，*P＜0.05）

3 討論

瘢痕攣縮可影響肢體或器官的功能。目前臨床對傷口的處理主要是促進傷口愈合和抑制瘢痕過度形成，尚無既可促進傷口愈合又可阻止瘢痕過度形成的有效處理方法。HS的病理特征是成纖維細胞過度增生和細胞外膠原過度沉積。HS發(fā)病機制尚不清楚，其形成的主要原因是細胞外膠原合成和分解平衡紊亂。MMPs是降解ECM的主要蛋白酶，抑制MMPs的活性和表達會導致一系列以ECM沉積為主要特點的疾病，如結(jié)締組織病，器官纖維化和動脈硬化等。MMP1是皮膚膠原蛋白降解的關(guān)鍵蛋白酶[6]。MMP1的激活受多種因子的調(diào)控，使ECM處于動態(tài)平衡中，MMPs活性增強或降低都會破壞ECM的動態(tài)平衡，當這一動態(tài)平衡打亂將導致膠原降解不足和ECM過度沉積，從而導致纖維化[7]。本研究結(jié)果顯示，MMP1 mRNA、蛋白在HS組織成纖維細胞中表達下調(diào)，轉(zhuǎn)染MMP1過表達質(zhì)粒后成纖維細胞增殖能力顯著下降。

microRNAs在纖維化疾病中發(fā)揮重要作用，并有可能成為治療纖維化疾病的靶點[8]。有研究通過對比HS組織與正常皮膚組織中的microRNAs的表達，證實有百余種microRNAs存在差異性表達[9]。這提示microRNAs在瘢痕的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。根據(jù)靶基因預(yù)測軟件檢索結(jié)果，發(fā)現(xiàn)miR-222是可能調(diào)控MMP1的基因。miR-222在多種疾病及多種組織中存在異常表達。然而miR-222在HS組織的表達情況報道少見。本研究首次發(fā)現(xiàn)HS組織成纖維細胞miR-222表達水平較正常組織成纖維細胞顯著上調(diào)，提示miR-222在HS中可能發(fā)揮了一定的調(diào)控作用。然后，本研究通過雙熒光素酶報告實驗發(fā)現(xiàn)，miR-222確實是調(diào)控MMP1的基因，miR-222能與MMP1的3′-UTR區(qū)相結(jié)合，從而調(diào)控其表達。

目前有關(guān)miR-222的研究主要集中于腫瘤領(lǐng)域，miR-222發(fā)揮促癌作用或抑癌作用[10-11]。miR-222在HS組織中的功能尚不明確。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miR-222起促進成纖維細胞的增殖的作用；抑制miR-222的表達，MMP1表達水平上調(diào)，成纖維細胞增殖速度下降，證實miR-222可通過調(diào)控MMP1的表達，進而發(fā)揮調(diào)控成纖維細胞增殖和凋亡的作用。

綜上所述，本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-222在HS組織存在過表達，miR-222或通過負調(diào)控其靶基因MMP1的表達而發(fā)揮其調(diào)控成纖維細胞增殖和凋亡的作用。本研究為miR-222/MMP1信號通路可能為HS診斷和治療新的生物標記物和治療靶點提供參考。

[1] Zhu Z,Ding J,Shankowsky H A,et al.The molecular mechanism of hypertrophic scar[J].Journal of cell communication and signaling,2013,7(4):239-252.

[2] Thum T,Chau N,Bhat B,et al.Comparison of different miR-21 inhibitor chemistries in a cardiac disease model[J].The Journal of clinicalinvestigation,2011,121(2):461-462.

[3] Kim K H,Jung J Y,Son E D,et al.miR-526b targets 3′UTR of MMP1 mRNA[J].Experimental&Molecular Medicine,2015,47(8):e178.

[4] Liu X,Yu J,Jiang L,et al.MicroRNA-222 regulates cell invasion by targeting matrix metalloproteinase 1 (MMP1)and manganese superoxide dismutase 2 (SOD2)in tongue squamous cell carcinoma cell lines[J].Cancer genomics&proteomics,2009,6(3):131-139.

[5] Hoogewerf C J,van Baar M E,Middelkoop E,et al.Patient reported facial scar assessment:directions for the professional[J].

Burns:Journal of the International Society for Burn Injuries,2014,40(2):347-353.

[6] Scharffetter-Kochanek K,Brenneisen P,Wenk J,et al.Photoaging of the skin from phenotype to mechanisms[J].Experimental gerontology,2000,35(3):307-316.

[7] Agrinier N,Thilly N,Boivin J M,et al.Prognostic value of serum PIIINP,MMP1 and TIMP1 levels in hypertensive patients:a community-based prospective cohort study[J].Fundamental&clinicalpharmacology,2013,27(5):572-580.

[8] Olubukola Babalola,Andrew Mamalis,Hadar Lev-Tov,et al.The Role of MicroRNAs in Skin Fibrosis[J].Arch Dermatol Res,2013,305(9):763-776

[9] Li C,Bai Y,Liu H.Comparative study of MicroRNAs profiling in keloid fibroblast and annotation of differential expressed MicroRNAs[J].Acta Biochim Biophys Sin,2013,45(8):692-699.

[10］Zhang C,Zhang J,Hao J,et al.High levelof miR-221/222 confers increased cell invasion and poor prognosis in glioma[J].J TranslMed,2012,10(6):119.

[11] Ihle M A,Trautmann M,Kuenstlinger H.miRNA-221 and miRNA-222 induce apoptosis via the KIT/AKT signalling pathway in gastrointestinalstromaltumours[J].MolOncol,2015,9(7):1421-1433.

MicroRNA-222 regulates the proliferation of fibroblasts in hypertrophic scar via matrix metalloproteinase 1

ZHANG Yi,ZHANG Li,ZHANG Qiyu,et al.
Department of Dermatology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Objective To determine the expressions of matrix metalloproteinase 1(MMP1)and miR-222 in fibroblasts of hypertrophic scar(HS),and investigate the regulatory mechanism of miR-222 on the occurrence and development of HS.Methods HS tissues and HS-adjacent normal tissues were both collected from 36 HS patients.Primary fibroblasts were obtained.qRT-PCR was used to measure the level of mRNA of MMP1 and miR-222.Western blotting was carried out to determine MMP1 protein expression.MTT assay was employed to detect the proliferation of fibroblasts.Dual luciferase reporter assay was performed to identify the binding of miR-222 with MMP1 mRNA.Results MMP1 mRNA/protien were significantly downregulated and miR-222 was significantly upregulated in HS fibroblasts,compared with control fibroblasts(P＜0.05).The expression of MMP1mRNA/protein were significantly upregulated(P＜0.05),and the cell proliferation abilities was significantly inhibited in HS fibroblasts after transfected with pcDNAMMP1(P＜0.05).miR-222 was downregulated(P＜0.05),MMP1 mRNA was upregulated and the cell proliferation abilities was inhibited(P＜0.05)in HS fibroblasts after transfected with antagomiR-222,Dual-Luciferase Reporter assay showed miR-222 regulated the expression of MMP1 by binding with its 3′-UTR. Conclusion miR-222 overexpressed in HS fibroblasts,miR-222 may regulate the proliferation and apoptosis of fibroblasts in HS via negatively regulating the expression of target gene MMP1.

Hypertrophic scarMicroRNA-222 Matrix metalloproteinase 1

10.12056/j.issn.1006-2785.2017.39.24.2017-823

浙江省醫(yī)藥衛(wèi)生項目（2015KYB244）

325000 溫州醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院皮膚科（張誼、張璃、林孝華），肝膽外科（張啟瑜），外科實驗室（洪煒龍）

林孝華，E-mail：wzlinxiaohua@163.com

2017-04-12）

李媚）