雙氫青蒿素含藥血清抗血管生成活性的研究?

王 武，盛慶壽

(1.海南省中醫(yī)院肝病科，?？?570203; 2.廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院，南寧 530021；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院肝病科，南寧 530011)

【方藥研究】

雙氫青蒿素含藥血清抗血管生成活性的研究?

王 武1，盛慶壽2△

(1.海南省中醫(yī)院肝病科，?？?570203; 2.廣西醫(yī)科大學(xué)研究生院，南寧 530021；3.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院肝病科，南寧 530011)

目的：研究不同劑量組雙氫青蒿素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移抑制作用和作用機(jī)制。方法：制備空白對(duì)照組、雙氫青蒿素15 mg/kg組、30 mg/kg組和60 mg/kg組4個(gè)劑量組含藥血清，以貝伐單抗為對(duì)照藥作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，噻唑藍(lán)法檢測(cè)細(xì)胞增殖，劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞VEGF表達(dá)，放射配體受體結(jié)合分析法檢測(cè)細(xì)胞VEGFR最大結(jié)合容量和解離常數(shù)。結(jié)果：相對(duì)于空白對(duì)照組，雙氫青蒿素30 mg/kg組和60 mg/kg組可明顯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖且能降低細(xì)胞的遷移能力；RT-qPCR結(jié)果顯示，這2個(gè)劑量組的VEGF表達(dá)出現(xiàn)明顯降低；VEGFR最大結(jié)合容量出現(xiàn)明顯降低，解離常數(shù)明顯升高，結(jié)果均具有顯著性意義。結(jié)論：30 mg/kg劑量以上的雙氫青蒿素含藥血清可顯著抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖和遷移，作用機(jī)制可能與抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)并阻斷其與受體的結(jié)合相關(guān)。

雙氫青蒿素；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；增殖；遷移；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子

青蒿素是我國(guó)科研人員首次從黃花蒿中提取的有效抗瘧成分，為一種生物堿蓓半萜內(nèi)酯化合物，當(dāng)前合成了多種青蒿素衍生物包括雙氫青蒿素、青蒿琥酯、蒿甲醚等。臨床上廣泛用于各類瘧疾的治療，具有低毒、高效、廉價(jià)的優(yōu)點(diǎn)。近年研究發(fā)現(xiàn)，除外其抗瘧活性，青蒿素類藥物在抗腫瘤方面發(fā)現(xiàn)具有巨大價(jià)值[1-2]。筆者在前期研究中也發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素可抑制原發(fā)性肝癌大鼠的腫瘤生長(zhǎng)，改善肝功能，延長(zhǎng)大鼠生存時(shí)間[3]。體外實(shí)驗(yàn)則發(fā)現(xiàn)，雙氫青蒿素可抑制肝癌細(xì)胞增殖活性，對(duì)細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表達(dá)也表現(xiàn)出明顯抑制作用[4]，提示雙氫青蒿素的抗肝癌機(jī)制可能與其抑制腫瘤血管生成作用有關(guān)。為進(jìn)一步驗(yàn)證雙氫青蒿素的抗血管生成作用，本研究設(shè)計(jì)了雙氫青蒿素含藥血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的活性抑制實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)一步檢測(cè)細(xì)胞的VEGF表達(dá)和VEGF/VEGFR結(jié)合力變化，為雙氫青蒿素的抗肝癌機(jī)制提供更多的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

圖1顯示，雙氫青蒿素由廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院農(nóng)慧博士饋贈(zèng)，粉劑，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%，批號(hào)070711，鑒定人林海,雙氫青蒿素在溶液中以α和β 2種異構(gòu)體存在，形成α峰和β峰)。使用時(shí)以5%羧甲基纖維素鈉按所需濃度混勻，4 ℃保存；貝伐珠單抗注射液100 mg/4ml/支，美國(guó)羅氏公司(商品名：安維汀，批號(hào)N3539)。

圖1 雙氫青蒿素樣品液相圖譜注：1. α峰；2. β峰

1.2 細(xì)胞與動(dòng)物

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)購(gòu)買)、SPF級(jí)雄性SD大鼠20只，6周齡，體質(zhì)量均≥200 g，購(gòu)于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(許可證號(hào)SCXK桂2003-0003)。大鼠飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(SPF級(jí))，飼養(yǎng)環(huán)境12 h采光，12 h黑暗，恒溫24 ℃，相對(duì)濕度50%～60%。實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵守動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室有關(guān)條例。

1.3 試劑

引物合成(VEGF上游引物：5’-CATGTACGAACCGCCAG-3’，下游引物: 5’-TTGGCTGTTTGGTCATTGGC-3’，由上海拜力生物公司合成)；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)invitrogen 公司，批號(hào)31245)；SYBR Green試劑盒(美國(guó)羅氏公司，批號(hào)Z587690)；重組人VEGF165(美國(guó)PeproTech公司，批號(hào)GZ654565)；125IVEGF試劑盒(美國(guó)perkinelmer公司，批號(hào)1000551)；內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基(美國(guó)Scien Cell公司，批號(hào)3145905)。

1.4 儀器

酶標(biāo)儀(美國(guó)伯樂(lè)公司 680型)，熒光定量PCR儀(ABI7500型)，液體閃爍測(cè)量?jī)x(西安262廠，F(xiàn)J-2105p)。

1.5 方法

1.5.1 雙氫青蒿素含藥血清制備 將20只SD大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組和雙氫青蒿素15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg劑量組4組各5只，雙氫青蒿素各劑量組的大鼠分別按照相應(yīng)藥物濃度灌胃?？瞻讓?duì)照組給予等體積生理鹽水，連續(xù)7 d，于末次灌胃2 h后腹主動(dòng)脈取血，離心分離血清，滅活、過(guò)濾除菌后置于-80 ℃冰箱備用。

1.5.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外培養(yǎng)和藥物干預(yù) HUVEC在含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，分空白對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組、雙氫青蒿素15 mg/kg、30 mg/kg和60 mg/kg劑量組。貼壁后換成5%血清培養(yǎng)4 h，雙氫青蒿素各組換用10%雙氫青蒿素含藥血清，空白對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組換用10%小牛血清，陽(yáng)性對(duì)照組另加入10 mg/L濃度貝伐單抗溶液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.5.3 MTT(噻唑藍(lán))法檢測(cè)細(xì)胞增殖 細(xì)胞接種于96孔板中，接種濃度2×104個(gè)/ml，每孔加入100 μL，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，余步驟同上。分別培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入5 μL MTT，搖勻后再孵育4 h；吸去上清液，每孔加入二甲基亞砜 200 μL，振蕩器震蕩10 min；酶標(biāo)儀設(shè)置490 nm波長(zhǎng)，檢測(cè)吸光度(A值)，以計(jì)算細(xì)胞抑制率。抑制率=[(對(duì)照組A490-空白A490)-(藥物處理組A490-空白組A490)]/(對(duì)照組A490-空白A490)。

1.5.4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力 6孔板先以記號(hào)筆在底部做“井”字形標(biāo)記。細(xì)胞接種于6孔板中，接種濃度1.2×106個(gè)/ml，每孔加入2 ml。細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，以200 μL槍頭在標(biāo)記處做直線劃痕；分別更換含貝伐單抗和各劑量雙氫青蒿素的培養(yǎng)液后，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h；分別于0 h和24 h在倒置顯微鏡下觀察劃痕寬度變化并拍照記錄。

1.5.5 RT-qPCR法檢測(cè)細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá) 細(xì)胞接種于6孔板中，接種濃度1.2×106個(gè)/ml，每孔加入2 ml，設(shè)5個(gè)復(fù)孔，余步驟同上。培養(yǎng)48 h后PBS洗滌2次，以TRIZOL法提取總RNA，PCR擴(kuò)增采用SYBR Green法。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 3min(1循環(huán))，變性95 ℃ 10 s，退火60 ℃ 20 s(40循環(huán))。擴(kuò)增結(jié)束獲取溶解曲線和擴(kuò)增曲線進(jìn)行定量分析，得到ΔΔCT值(comparative ct method od quantitation)，應(yīng)用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。

1.5.6 放射配體受體結(jié)合分析法檢測(cè)細(xì)胞的血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體最大結(jié)合容量和解離常數(shù) 參考文獻(xiàn)[5]，取藥物干預(yù)后的各組細(xì)胞，以結(jié)合緩沖液將細(xì)胞密度調(diào)整至6×105個(gè)/ml,分別添加150 μm細(xì)胞懸液至1～24號(hào)檢測(cè)管后PBS浸泡過(guò)夜。采用復(fù)管法，1～16號(hào)管分別按50、80、100、150、200、350、500、700 pmol/L加入VEGF165；17～24號(hào)管分別按50、100、350、700 pmol/L加入VEGF165后，再加入100倍量的非標(biāo)記VEGF，記為非特異結(jié)合管。各管中加入結(jié)合緩沖液至總體積300 μm，置于4 ℃冰箱，孵育3 h。加入1 ml pbs終止反應(yīng)，離心棄上清，再以PBS洗3次，置入γ計(jì)數(shù)器中檢測(cè)放射性。以總結(jié)合減去對(duì)應(yīng)濃度點(diǎn)非特異性結(jié)合得出特異性結(jié)合的cpm值，再經(jīng)BRA數(shù)據(jù)分析軟件處理后獲得受體最大結(jié)合容量(Bmax)和解離常數(shù)(Kd)。Bmax為配體與受體最大結(jié)合容量，目的基因表達(dá)增強(qiáng)時(shí)可檢測(cè)到更高Bmax值；Kd值提示受體配體親和力，Kd值越小表示最大效應(yīng)所需配體濃度越低則親和力越大，最后繪制飽和曲線并進(jìn)行scatchard繪圖。

2 結(jié)果

2.1 雙氫青蒿素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞抑制率的影響

表1顯示，經(jīng)藥物干預(yù)后同空白對(duì)照組比較，雙氫青蒿素15 mg/kg組和30 mg/kg組的樣本細(xì)胞增殖明顯受到抑制(P<0.01，P<0.01)，且隨藥物干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)其抑制率也逐步提高，雙氫青蒿素15 mg/kg組的抑制作用則不明顯(P>0.05)。

表1 雙氫青蒿素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞增殖抑制率的影響

注：與空白對(duì)照組比較：**P<0.01

2.2 雙氫青蒿素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移能力的影響

圖2顯示，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)藥物干預(yù)24 h后，相對(duì)于空白對(duì)照組，雙氫青蒿素30 mg/kg組、60 mg/kg組和陽(yáng)性對(duì)照組的劃痕寬度明顯增寬，提示藥物對(duì)細(xì)胞的遷移能力起到明顯的抑制作用；雙氫青蒿素低劑量組的劃痕寬度相對(duì)于空白對(duì)照組變化不大。

圖2 雙氫青蒿素干預(yù)后細(xì)胞遷移能力變化

2.3 雙氫青蒿素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子mRNA表達(dá)的影響

表2顯示，雙氫青蒿素各個(gè)劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組的VEGF表達(dá)均顯著低于正常組(P<0.05)，表明藥物對(duì)VEGF表達(dá)確實(shí)起到抑制作用。

2.4 雙氫青蒿素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體最大結(jié)合容量和解離常數(shù)的影響

表2圖3、4顯示,雙氫青蒿素30 mg/kg組、60 mg/kg組和陽(yáng)性對(duì)照組的Bmax值較空白對(duì)照組明顯降低(P<0.01)，提示這3組樣本的VEGF表達(dá)出現(xiàn)明顯抑制，雙氫青蒿素15 mg/kg組的Bmax表達(dá)則沒(méi)有明顯變化(P>0.05)；4組樣本的Kd值較空白對(duì)照組均明顯升高(P<0.05)，提示經(jīng)藥物處理后細(xì)胞的VEGF/VEGFR結(jié)合親和力下降。取雙氫青蒿素60 mg/kg劑量組繪制飽和曲線和scatchard 繪圖，飽和曲線可見特異性結(jié)合(specific binding,SB)和總結(jié)合(total binding,TB)呈典型的飽和趨勢(shì)，而非特異性結(jié)合(non-specific binding,NSB)則無(wú)飽和趨勢(shì)為直線圖。

表2 雙氫青蒿素對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞VEGF mRNA表達(dá)和Bmax、Kd值的影響

注：與空白對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01

圖3 雙氫青蒿素60 mg/kg組的飽和曲線

圖4 雙氫青蒿素60 mg/kg組的scatchard分析

3 討論

腫瘤的血管生成一直被認(rèn)為是腫瘤快速增長(zhǎng)、浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移的基礎(chǔ)[6]，通過(guò)抑制腫瘤血管生成而實(shí)現(xiàn)抑瘤活性也是當(dāng)前多種抗癌靶向藥物的抑瘤機(jī)制[7]。血管生成過(guò)程中，內(nèi)皮細(xì)胞活性是血管新生活躍的最關(guān)鍵因素，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞藥物干預(yù)后的活性變化，對(duì)評(píng)估其抗血管生成作用有著重要意義。HUVEC具備人新生血管內(nèi)皮的特點(diǎn)，并兼具原代獲取容易、體外培養(yǎng)代謝穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)[8]，是科研最常用的血管內(nèi)皮細(xì)胞。有研究發(fā)現(xiàn)，青蒿琥酯對(duì)HUVEC的遷移和小管形成可起到抑制作用[9]，作用機(jī)制與青蒿琥酯誘導(dǎo)的鐵依賴性活性氧產(chǎn)生、線粒體凋亡通路[10]以及增大細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度[11]有關(guān)，這些研究提示青蒿素類藥物可能存在抗血管生成作用。

在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，我們將其作用靶點(diǎn)定位于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子及其受體。血管生成因子是一類由細(xì)胞分泌，可促進(jìn)血管形成的肽類物質(zhì)，其種類非常多，各種血管生成因子之間相互作用，共同主導(dǎo)新血管生成[12]。VEGF是其中一類作用最直接、特異質(zhì)最強(qiáng)的血管生成因子，組織血管生成旺盛時(shí)可檢測(cè)到VEGF表達(dá)明顯增強(qiáng)[13]，是評(píng)估血管生成的重要檢測(cè)指標(biāo)。VEGF與受體的結(jié)合是其發(fā)揮生物學(xué)特性的基礎(chǔ)，當(dāng)血管生成被抑制時(shí)，不僅表現(xiàn)為VEGF自身表達(dá)下降，VEGF與受體的結(jié)合也會(huì)受到抑制[14]。目前VEGF受體發(fā)現(xiàn)有3種，即VEGFR-1(flt-1)、VEGFR-2(KDR/flk-1)和VEGFR-3(flt-4)，三者均屬酪氨酸激酶受體。VEGF通過(guò)與VEGFR的特異性結(jié)合發(fā)生自身磷酸化，并使VEGFR二聚體化而啟動(dòng)信號(hào)傳導(dǎo)，通過(guò)促進(jìn)基質(zhì)金屬蛋白酶分泌，增強(qiáng)NO合酶表達(dá)等途徑，加速血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和分化而調(diào)控血管新生[14-15]。故進(jìn)一步對(duì)雙氫青蒿素干預(yù)HUVEC后其VEGF表達(dá)、VEGF/VEGFR親和力變化進(jìn)行驗(yàn)證，也能更好地支持雙氫青蒿素抑制血管生成理論。本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)雙氫青蒿素干預(yù)后，RT-qPCR結(jié)果顯示，30 mg/kg和60 mg/kg組的雙氫青蒿素對(duì)HUVEC的VEGF表達(dá)明顯抑制。進(jìn)一步用RBA法檢測(cè)VEGF表達(dá)與VEGF/VEGFR結(jié)合親和力變化，也發(fā)現(xiàn)適宜的雙氫青蒿素劑量不僅可明顯抑制VEGF表達(dá)，還能明顯降低VEGF與VEGFR的結(jié)合力。結(jié)合前期的雙氫青蒿素抗癌實(shí)驗(yàn)提示，雙氫青蒿素的抗血管生成作用或許是其抗癌效應(yīng)的其中一項(xiàng)機(jī)制。

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TheResearchonTheAnti-angiogenicActivityofDihydroartemisininContainedSerum

WANG Wu1, SHENG Qing-shou2△

(1.DepartmentofLiverDisease,HainanProvincialHospitalofTraditionalChineseMedicine，Haikou570203,China；2.Guangximedicaluniversitygraduateschool，Nanning530021,China;3.DepartmentofLiverDisease,RuikangHospitalAffiliatedtoGuangxiUniversityofChineseMedicine，Nanning530011,China)

Objective: To study the proliferation and migration ability impact of dihydroartemisinin of different dosage group on human umbilical vein endothelial cell (HUVEC) and its mechanism. Methods:Prepared four dosage groups of drug serum, i.e. blank control group, dihydroartemisinin 15mg/kg group, dihydroartemisinin 30 mg/kg group and dihydroartemisinin 60 mg/kg group and then used them to HUVEC. Detected the cell proliferation with MTT method; The scratch test was used to analyze the cell migration ability; detected the VEGF expression with RT-qPCR method and detected VEGF receptors’ Bmax and dissociation constant with RBA method.Results: Compared with blank control group, the dihydroartemisinin 30 mg/kg group and dihydroartemisinin 60 mg/kg group obviously inhibited cell proliferation and reduce the ability of cell to migrate; RT-qPCR results show that the expression of dihydroartemisinin 30 mg/kg group and dihydroartemisinin 60 mg/kg group has significantly decrease; VEGF receptors Bmax in these two groups decreased clearly while the dissociation constant increased obviously. The results all have statistical significance.Conclusion: More than 30 mg/kg dose of dihydroartemisinin can remarkably inhibit HUVEC proliferation and migration ability. The inhibition mechanism may be related with the inhibition of VEGF and its function to block the combination with VEGFR.

Dihydroarteannuin; HUVEC; Proliferation; Migration; VEGF

廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2012GXNSFAA053115)-雙氫青蒿素介導(dǎo)VEGF/VEGFR信號(hào)通路調(diào)控肝癌血管生成的分子機(jī)制研究;廣西衛(wèi)生廳課題(Z2013239)-雙氫青蒿素介導(dǎo)肝癌VEGF/VEGFR信號(hào)通路研究;八桂學(xué)者建設(shè)工程專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目

王 武(1988-)，男，海南?？谌?，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)碩士，從事急慢性肝病的中西醫(yī)結(jié)合臨床與研究。

△通訊作者：盛慶壽(1976-)，男，江西人，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事慢性肝病的臨床與研究，Tel：13707715487，E-mail:675249679@qq.com。

R289.5

B

1006-3250(2017)11-1635-04

2017-03-23