升麻增效口腔潰瘍散治療口腔潰瘍大鼠模型的研究?

金 釗，鄭 濤，嚴(yán) 航，艾黃萍，左渝陵

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 610075； 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610075； 3. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610075)

【實(shí)驗(yàn)研究】

升麻增效口腔潰瘍散治療口腔潰瘍大鼠模型的研究?

金 釗1，鄭 濤2，嚴(yán) 航2，艾黃萍2，左渝陵3△

(1. 成都中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，成都 610075； 2. 成都中醫(yī)藥大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，成都 610075； 3. 成都中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，成都 610075)

目的：研究升麻對(duì)口腔潰瘍散治療口腔潰瘍大鼠增效作用及機(jī)制。方法：將大鼠分為空白組、模型組、潰瘍散組、潰瘍散+升麻組，除空白組外，以NaOH晶體化學(xué)燒灼法建立潰瘍模型，檢測(cè)各組潰瘍面積、愈合率，HE染色法觀察組織病理學(xué)變化，ELISA法檢測(cè)IFN-γ 和IL-6含量，Western-blot檢測(cè)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)。結(jié)果：造模大鼠潰瘍明顯，周圍組織紅腫；給藥后潰瘍面積縮小，其中口腔潰瘍散聯(lián)合升麻組在潰瘍面積、IFN-γ、IL-6和MMP-2、MMP-9表達(dá)水平上較單獨(dú)用藥組均顯著降低。結(jié)論：升麻增效口腔潰瘍散發(fā)揮治療作用，其機(jī)制可能與抑制炎性介質(zhì)的釋放以及下調(diào)MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)有關(guān)。

口腔潰瘍散；升麻；口腔潰瘍；協(xié)同；炎性介質(zhì)；MMPs

口腔潰瘍又名口瘡，不定期或周期性在口腔黏膜任何部位孤立或多發(fā)出現(xiàn)[1]，疼痛明顯反復(fù)，給生活帶來極大不便[2]，臨床治療以補(bǔ)充維生素和微量元素、對(duì)癥處理為主，但依從性差?？谇粷兩⒛苡行コ凉儔乃澜M織，減輕炎癥程度，促進(jìn)潰瘍及糜爛面愈合[3]，是治療復(fù)發(fā)性和皰疹性口腔潰瘍的要藥[4]?，F(xiàn)代研究顯示，升麻具有殺菌活性，可治療腫脹、炎癥等癥狀[5]，對(duì)口舌生瘡及咽喉腫痛療效極佳[6]。基于此，本研究建立口腔潰瘍大鼠模型，在口腔潰瘍散的基礎(chǔ)上聯(lián)合風(fēng)藥升麻，從組織形態(tài)學(xué)、細(xì)胞因子水平以及MMPs蛋白的表達(dá)探討升麻是否增效口腔潰瘍散的治療作用，為臨床提供參考。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SD 大鼠44只，體質(zhì)量(180～220) g，雌雄各半，由成都中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)SCXK(川) 2011-11)。實(shí)驗(yàn)溫度(22～25) ℃，相對(duì)濕度55%～70%。

1.2 主要試劑與儀器

口腔潰瘍散(內(nèi)蒙古蒙藥股份有限公司)散劑，升麻(三九醫(yī)藥)顆粒劑，左旋咪唑(科倫藥業(yè))；腫瘤生長(zhǎng)因子-α(TNF-α)、白介素-6 (IL-6)ELISA試劑盒、β-acting購(gòu)自武漢博士德，考馬斯亮藍(lán)蛋白測(cè)定試劑盒、顯色劑 DAB購(gòu)自南京建成生物，MMP-2、MMP-9單克隆抗體(北京中杉)，ECL發(fā)光液(上海碧云天)。

酶標(biāo)定量測(cè)定儀(Thermo Multiskan AsCant公司)；離心機(jī)5415D(Eppendorf 公司，德國(guó))；超薄石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡)；多功能照相顯微鏡(日本 Olympus)；垂直電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(北京六一)。

1.3 方法

1.3.1 口腔潰瘍大鼠造模方法與處理 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)，將大鼠分為空白組、模型組、給藥組1(口腔潰瘍散)、給藥組2(口腔潰瘍散+升麻)，采用化學(xué)燒灼法建立口腔潰瘍動(dòng)物模型，空白組不做任何處理。以1%戊巴比妥鈉(0. 025 g /kg) 麻醉，將大鼠固定，以蘸有NaOH晶體的濾紙(直徑3 mm)在下唇靠口角黏膜處燒灼5～8 s，生理鹽水沖洗，1 d后形成潰瘍。給藥組1(敷口腔潰瘍散3次/d)給藥以覆蓋創(chuàng)面為度，給藥組2在給藥組1的基礎(chǔ)上以1 g/kg灌胃2 mL升麻藥液，空白組與模型組灌胃相應(yīng)體積生理鹽水，治療10 d。每組11只大鼠，1只用于HE染色，5只用于第6天ELISA試劑盒檢測(cè)IFN-γ、IL-6含量，剩余5只用于觀察整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中潰瘍面積的變化，以及第10天檢測(cè)MMP-2、MMP-9蛋白。

1.3.2 HE染色 給藥后第6天，各組隨機(jī)選取1只大鼠頸部脫臼法處死，以眼科剪剪下0.5×0.5×0.1 cm的潰瘍面黏膜組織，PBS沖洗，置入4%多聚甲醛固定24 h，后置入自動(dòng)組織脫水機(jī)中梯度酒精脫水，二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋。經(jīng)組織切片、攤片、撈片、烤片后脫蠟至水，蘇木精染色、鹽酸分化、流水沖洗后酒精脫水，伊紅溶液染色。最后梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并拍照[1]。

1.3.3 潰瘍的形成及愈合情況 實(shí)驗(yàn)期間，隔天記錄潰瘍從發(fā)生至愈合的時(shí)間，治療完成后用游標(biāo)卡尺測(cè)量潰瘍的直徑并計(jì)算其面積。

1.3.4 ELISA法檢測(cè)組織中IFN-γ、IL-6含量的變化 給藥6 d后收集各組大鼠潰瘍組織，4℃PBS中漂洗，除去血液濾紙拭干，放入5 mL含有勻漿介質(zhì)的小燒杯內(nèi)，剪碎組織塊，用組織搗碎機(jī)以(10000～15000)r/min上下研磨制成10%組織勻漿，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度。按照ELISA試劑盒說明書操作，反應(yīng)終止后450 nm波長(zhǎng)處測(cè)量光密度(OD值)。

1.3.5 Western-blot檢測(cè)MMP-2、9蛋白的表達(dá) 給藥第10天收集潰瘍組織，組織勻漿樣品制備同1.3.4，將制備好的組織勻漿100 mg加入500 μL裂解液，4 ℃持續(xù)振蕩30 min，離心10000 r/min 10 min后，將上清轉(zhuǎn)入預(yù)冷的離心管，考馬斯亮藍(lán)測(cè)定蛋白濃度，樣品以上樣緩沖液稀釋后煮沸5 min使蛋白變性備用。灌制80 g/L SDS-PAGE凝膠，取已制備好的蛋白，每孔上樣量20 μL，150 V穩(wěn)壓電場(chǎng)中電泳，約90 min后轉(zhuǎn)膜，濾膜經(jīng)脫脂奶粉封閉過夜，剪膜根據(jù)分子量分開后分別加以1∶1000稀釋的一抗(MMP-2、MMP-9)及內(nèi)參抗體(β-actin，1∶3000)室溫孵育3 h，洗膜3次，以1∶3000稀釋的HRP標(biāo)記二抗孵育1 h后，洗膜3次，ECL發(fā)光液發(fā)光后X光片曝光，掃描記錄結(jié)果，Gel-analyze分析軟件分析條帶灰度進(jìn)行半定量比較分析，以目的基因的條帶灰度與內(nèi)參β-actin的灰度比值表示蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 HE染色結(jié)果

圖1顯示，空白組口腔黏膜組織上皮完整連續(xù)，細(xì)胞排列有序，胞核胞漿無異型性。模型組潰瘍呈圓形或橢圓形，邊緣充血，周圍組織紅腫，表面覆有灰黃或灰白色膜。給藥組1、2在給藥5 d后，潰瘍面積逐漸縮小，充血癥狀減輕，滲出物減少，給藥組2潰瘍癥狀減輕程度大于給藥組1。

圖1 大鼠口腔黏膜組織病理染色(HE ×100)

2.2 潰瘍面積變化

結(jié)果顯示，造模24 h后黏膜形成明顯潰瘍癥狀；分別給藥后，潰瘍面積逐漸縮小，且給藥組2的潰瘍面積較給藥組1明顯縮小，第6天給藥組2的潰瘍面積消失，創(chuàng)面形成瘢痕，8 d以后潰瘍愈合，而模型組基本自愈的時(shí)間大于10 d。

表1顯示，與模型組比較，從第2天起，給藥組1、2的潰瘍面積均顯著縮小，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；且給藥組2的潰瘍面積顯著小于給藥組1，2組第2、4、6、8天比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

表1 各組大鼠潰瘍面積變化

注： 與模型組比較：**P<0.01；給藥組2與給藥組1比較：△P<0.05，△△P<0.01

2.3 各組潰瘍組織中IFN-γ、IL-6含量及MMP-2、MMP-9表達(dá)的變化

表2顯示，在給藥后6 d與空白組比較，模型組與給藥組1、2的IFN-γ、IL-6含量均明顯增加 (P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，給藥組1、2的IFN-γ、IL-6水平顯著降低 (P<0.01)，其中給藥組2均顯著低于給藥組1，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。

表2圖2顯示，在給藥后10 d，模型組的MMP-2、MMP-9表達(dá)量較空白組明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，給藥組1、2的MMP-2、MMP-9表達(dá)量明顯降低(P<0.01)；給藥組組間比較，給藥組2的MMP-2、MMP-9表達(dá)量顯著低于給藥組1(P<0.01)。

表2 各組潰瘍組織IFN-γ、IL-6含量和MMP-2、MMP-9表達(dá)的變化

注： 與空白組比較：☆P<0.05，☆☆P<0.01；與模型組比較:**P<0.01；給藥組2與給藥組1比較:△P<0.05，△△P<0.01

圖2 Western-Blot檢測(cè)MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)A.空白組；B.模型組；C.給藥組1；D.給藥組2

3 討論

口腔潰瘍屬于中醫(yī)口瘡范疇，其病因可以包括由于外感邪熱、心脾積熱或陰虛陽(yáng)亢、虛陽(yáng)浮越等造成的虛火上浮或邪熱上蒸[7]?？谇火つ儎?dòng)物模型的制備方法較多[8]，本研究以化學(xué)灼燒法[9]建立大鼠口腔黏膜潰瘍模型，其方法簡(jiǎn)單，可重復(fù)性強(qiáng)，能形成典型的急性口腔潰瘍，且能保持潰瘍大小、深度、部位一致，避免較大系統(tǒng)誤差。本結(jié)果中，口腔潰瘍散能明顯改善大鼠潰瘍癥狀，聯(lián)合升麻后有效治療和糾正灼燒引起的潰瘍黏膜結(jié)構(gòu)改變，二者產(chǎn)生增效協(xié)同作用，大大縮短了潰瘍愈合時(shí)間，有助于潰瘍創(chuàng)面的加速愈合。

IFN-γ和IL-6是參與口腔潰瘍形成過程中具有代表性的主要炎癥細(xì)胞因子[10]，其含量高低與病情輕重密切相關(guān)，即潰瘍數(shù)目越多、面積越大，IFN-γ和IL-6含量越高[11]。本研究結(jié)果表明，造模后炎癥細(xì)胞因子水平均極顯著升高，升麻及口腔潰瘍散能顯著抑制大鼠口腔潰瘍組織TNF-α、IL-6水平基礎(chǔ)上增強(qiáng)其抑制潰瘍的能力；在潰瘍后期，潰瘍大部分已經(jīng)愈合，機(jī)體炎癥癥狀減輕，不再分泌大量炎性介質(zhì)，升麻聯(lián)合組的潰瘍愈合能力優(yōu)于單獨(dú)口腔潰瘍散組，升麻聯(lián)合組6 d潰瘍面積消失，單獨(dú)口腔潰瘍散的潰瘍面積消失需8 d，而潰瘍自然愈合需10 d以上，說明升麻殺菌、治療炎癥[5]的功效加強(qiáng)了口腔潰瘍散對(duì)口腔潰瘍的治愈能力。提示升麻對(duì)口腔潰瘍散治療大鼠口腔潰瘍具有增效的積極作用，且隨著潰瘍面積的愈合，可明顯降低組織細(xì)胞內(nèi)炎性介質(zhì)IFN-γ和IL-6的釋放，減少炎癥的發(fā)生，進(jìn)一步反饋增強(qiáng)潰瘍的愈合能力。

MMPs參與如胚胎發(fā)育、器官形態(tài)發(fā)生、骨重建、傷口愈合、細(xì)胞凋亡等生理過程，還與炎癥、心血管疾病、牙周病、潰瘍、腫瘤的侵襲及轉(zhuǎn)移等病理過程有關(guān)[12]。MMP-2、MMP-9屬于明膠酶，主要降解Ⅳ型膠原和層黏連蛋白(基底膜的骨架)，作為屏障能阻止炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和炎癥擴(kuò)散[1]。造模后，大鼠口腔潰瘍創(chuàng)面組織MMP-2、MMP-9表達(dá)水平明顯升高，說明炎性細(xì)胞浸潤(rùn)使基質(zhì)金屬蛋白酶活性增加，參與整個(gè)炎癥過程，給藥后MMP-2、MMP-9表達(dá)水平明顯降低，且升麻+口腔潰瘍散組的表達(dá)量顯著低于單獨(dú)口腔潰瘍散組，升麻+口腔潰瘍散組MMP-2、MMP-9的表達(dá)水平更加趨近于未造模的空白組，說明升麻聯(lián)合口腔潰瘍散具有增效的作用，作用機(jī)制可能與下調(diào)MMP-2、MMP-9的表達(dá)、減少炎性介質(zhì)的釋放有關(guān)，從而降低炎性癥狀，增加潰瘍愈合能力。

綜上所述，風(fēng)藥升麻能達(dá)到增效口腔潰瘍散治療大鼠口腔潰瘍模型的作用，減輕癥狀，縮短病程，加速愈合潰瘍創(chuàng)面，其抗?jié)兊膶?shí)驗(yàn)機(jī)制可能與降低炎性介質(zhì)的合成和釋放、下調(diào)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2、MMP-9的表達(dá)有關(guān)。

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CimicifugaSynergisticUlcerPowderCurativeEffectandItsMechanisminTheTreatmentofOralMucosalUlcerModelofRats

JIN Zhao1, ZHENG Tao2, YAN Hang2, AI huang-ping2, ZUO Yu-ling3△

(1.CollegeofbasicmedicineofChengduUniversityofTCM,Chengdu610075,China; 2.CollegeofclinicalmedicineofChengduUniversityofTCM,Chengdu610075,China; 3.AffiliatedHospitalofChengduUniversityofTCM,Chengdu610075,China)

Objective: To study the treatment of oral ulcer powder Cimicifuga experimental oral ulcer in rats and its partly mechanisms of synergistic effect. Methods: The rats were divided into blank group, oral ulcer film group, ulcer powder group, ulcer powder combined + cohosh group. Those groups were established by film NaOH crystal chemical cauterization except the blank group. Then HE method for oral mucosal tissue staining to observe the pathological changes, the detection area rats of group size, healing rate changes. ELISA method was used to detect the changes of IFN-γ and IL-6 detection. Western-blot method was used to detect the expression of MMP-2,9. Results：After modeling, ulcer in the rats of model group was round or oval, the surrounding tissue swelling; the ulcer area was gradually reduced after administration. In the ulcer area, IFN-γ, the levels of IL-6 and MMP-2, MMP-9 expression level, the oral ulcers scattered combined with cohosh group were significantly lower than the single drug group. Conclusion: Oral ulcer powder combined with Rhizoma Cimicifugae synergy in the treatment of oral ulcer, and its mechanism may release and inhibition of inflammatory mediators and down regulated the expression of MMP-2, MMP-9.

Oral ulcer powder; Cimicifuga; Oral ulcer; Synergy; Inflammatory mediators; MMPs

國(guó)家自然基金面上基金項(xiàng)目(81574035);四川省科技廳項(xiàng)目(2015SZ0195)

金 釗(1978-)，男，講師，醫(yī)學(xué)博士，從事中醫(yī)歷代醫(yī)家學(xué)術(shù)思想及臨床應(yīng)用與口腔黏膜疾病的臨床與研究。

△通訊作者：左渝陵(1975-)，男，副主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事口腔臨床醫(yī)學(xué)研究，E-mail: 2279025416@qq.com。

R781.5+1

B

1006-3250(2017)11-1569-04

2017-03-15