天山花楸葉中多糖的含量測定及抑菌作用研究*

李樂，遲峰麗，唐輝

(1.石河子大學(xué)藥學(xué)院，石河子 832000;2.新疆獨山子石化醫(yī)院內(nèi)分泌科，克拉瑪依 833600)

天山花楸為薔薇科(Roseceae)花楸屬(Sorbus)植物，主要產(chǎn)自新疆各地，為維吾爾族民間用藥，1980年載入新疆藥品標(biāo)準(zhǔn)。《新疆中草藥手冊》記載，“果實:味甘苦，性平，無毒。嫩枝和皮:味苦，性寒，無毒。清肺止咳，補(bǔ)脾生津。治肺結(jié)核，哮喘咳嗽”[1]。本課題組成員曾對天山花楸的枝葉及果實進(jìn)行了化學(xué)成分研究和藥效學(xué)篩選，藥理學(xué)研究表明黃酮類化合物為天山花楸活性成分，槲皮素和山奈素為其中兩種成分[2]。目前筆者未見有關(guān)天山花楸枝葉中多糖含量及藥理作用的文獻(xiàn)報道，為此本實驗對天山花楸枝葉中多糖的含量進(jìn)行測定，并考察其抑菌活性，為天山花楸枝葉的藥理學(xué)活性及其他相關(guān)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 UV-2401分光光譜儀(日本島津)、TG16-WS臺式高速離心機(jī)(長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司)、BP211D型電子天平(德國賽多利斯，感量:0.01 mg)。

1.2 試藥 天山花楸葉采自瑪納斯林場，經(jīng)石河子大學(xué)藥學(xué)院李鵬副教授鑒定為天山花楸;葡萄糖對照品(天津市盛奧化學(xué)試劑有限公司，批號:145322)，大腸埃希菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌由獨山子醫(yī)院檢驗科提供，實驗所用試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結(jié)果

2.1 天山花楸多糖的含量測定

2.1.1 多糖的提取 稱取天山花楸葉粉末(過內(nèi)徑0.150 mm目篩)10.0 g，置于索氏提取器中，用石油醚脫脂2 h，再用80%乙醇120mL回流3 h，取藥渣揮干溶劑后，用純化水 200mL煮 2 h，冷卻至室溫，以4000 r·min－1離心 10 min(有效離心半徑 8.5 cm)，取上清液抽濾，濾液減壓濃縮至約30mL，加三氯甲烷∶正丁醇(4∶1)溶液8mL，置于具塞試管中，充分振搖30 min后，以 4000 r·min－1離心 5 min，取上層液體再加入相當(dāng)于其體積1/4的三氯甲烷∶正丁醇(4∶1)溶液，重復(fù)上述操作10次，直到界面無白色沉淀為止[3]。取上層液體，邊攪拌邊加入無水乙醇至乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%，靜置12 h，減壓抽濾，反復(fù)醇沉3次，依次用無水乙醇、丙酮、無水乙醚洗滌，干燥后得粗多糖，稱定質(zhì)量[4]。

2.1.2 對照品溶液的制備 精密稱取干燥至恒重的葡萄糖對照品100.00 mg，置于100mL量瓶中，用去離子水溶解并定容，搖勻。精密量取10mL置于100mL量瓶中，用去離子水稀釋至刻度，搖勻，配成0.1 mg·mL－1的對照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取天山花楸多糖10.00 mg置于100mL量瓶中，用去離子水稀釋并定容，即為待測的供試品溶液[5]。

2.1.4 5%苯酚溶液的制備 稱取苯酚5.0 g，用少量水溶解，移于100mL量瓶中，加水稀釋并定容，搖勻，配成5%苯酚溶液。

2.1.5 檢測波長的確定 取對照品溶液1mL置于試管中，分別加入新配的5%苯酚溶液1.0mL、濃硫酸溶液 3.0mL，搖勻，沸水浴 30 min，放至室溫，于400～700nm處掃描[6]，選擇最大吸收波長490nm為檢測波長。

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密量取“2.1.2”項葡萄糖對照品溶液 0.2，0.4，0.5，0.6，0.8mL 置于10mL 具塞試管中，補(bǔ)加去離子水至1mL，依次加入5%苯酚溶液1mL和濃硫酸3mL，搖勻，沸水浴30 min，放至室溫;另以去離子水1mL，同上操作為空白對照[7]。在波長490nm處測定吸光度(A)，以溶液質(zhì)量濃度(X，mg·mL－1)對吸光度(A)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程:A=49.111X+0.0276，r=0.9995。結(jié)果表明葡萄糖在質(zhì)量濃度 0.004～0.016 mg·mL－1范圍內(nèi)與吸光度呈良好線性關(guān)系。

2.1.7 精密度實驗 取葡萄糖對照品溶液0.4mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下的方法操作，測定吸光度，連續(xù)測定5次，RSD為0.53%，表明儀器精密度良好。

2.1.8 重復(fù)性實驗 精密稱取同一批天山花楸多糖樣品 5份，按照“2.1.3”項制備供試品溶液，按照“2.1.6”項方法測定溶液的吸光度，結(jié)果 RSD 為1.53%，表明重復(fù)性良好。

2.1.9 穩(wěn)定性實驗 取同一份供試品溶液1mL，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備項下方法操作，每隔10 min測定吸光度，間隔測定6次。結(jié)果表明在60 min內(nèi)測定，RSD為1.98%，穩(wěn)定性良好。

2.1.10 換算因子測定 取天山花楸枝葉粗粉5 g，精密稱定，照“2.1.1”項制得干燥恒重的多糖，精密稱取15 mg，置100mL量瓶中，用去離子水溶解定容后搖勻，吸取 1mL 于試管中，按照“2.1.3”項操作，于490nm處測定吸光度，根據(jù)公式 f=W/CV[8]，其中 W為天山花楸多糖質(zhì)量濃度(mg)，C為多糖溶液中葡萄糖質(zhì)量(mg·mL－1)，V為多糖的稀釋體積(mL)，計算出換算因子 f=2.016(n=5，RSD 為 1.32%)。

2.1.11 加樣回收率實驗 精密稱取天山花揪葉粗粉6份，每份約 0.1 g，分別加入對照品溶液 20mL，按“2.1.6”項下方法操作，測定吸光度，平均回收率為96.7%，RSD 為 1.73%。

2.1.12 樣品多糖含量測定 取天山花楸葉3批，每批5份，按樣品制備和測定方法操作，測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算質(zhì)量濃度。

樣品中多糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)=C×V×f/W×100%。C為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計算得到的樣品溶液中單糖的質(zhì)量濃度(mg·mL－1)，V為樣品的稀釋體積(mL)，f為換算因子，W為樣品的質(zhì)量(mg)。結(jié)果見表1，多糖含量為2.56%。

表1 3批天山花楸中多糖含量Tab.1 Polysaccharides content of three batches of Sorbus tianschanica Rupr. %，n=5

2.2 天山花楸多糖的抑菌作用

2.2.1 實驗菌液的制備 凍干菌種用0.9%氯化鈉溶液0.5mL溶解，加入液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液中，置37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h，用接種環(huán)分別蘸取3種不同的實驗細(xì)菌，于固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液上畫線，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h;用接種環(huán)挑取單個菌落移入盛有液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液20mL的錐形瓶內(nèi)，置37℃震蕩培養(yǎng)18 h得到純菌液。放置冰箱冷藏備用。

2.2.2 藥敏紙片制備 用打孔鉗制作直徑6 mm濾紙片，將濾紙片浸入濃度為51.2 mg·mL－1天山花楸多糖水溶液3 h，取出置于無菌的培養(yǎng)皿中，37℃干燥備用。

2.2.3 固體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液制備 分別稱取胰蛋白胨5 g、牛肉膏、氯化鈉各2.5 g置于適宜燒杯中，加入純化水500 g，用玻璃棒攪拌均勻，加熱煮沸，待充分溶解后加入瓊脂粉10 g，繼續(xù)攪拌，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值為7～8，滅菌，即制得。

2.2.4 液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液制備 分別稱取胰蛋白胨5 g、牛肉膏、氯化鈉各2.5 g置于適宜燒杯中，加入純化水500 g，玻璃棒充分?jǐn)嚢杈鶆?，加熱煮沸，充分溶解，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH值在7～8之間，滅菌，即得[9]。

2.2.5 天山花楸多糖的抑菌效果 向無菌的直徑100 mm培養(yǎng)皿中倒入牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)液，厚度約5 mm，制成3個培養(yǎng)液，待充分凝固后依次分別加大腸埃希菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌的菌液100μL，涂布均勻。每個培養(yǎng)皿內(nèi)放置3枚藥敏紙片(陽性片、陰性片、藥敏紙片)，每個處理重復(fù)2次。置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，測量并記錄藥敏紙片的抑菌圈直徑。結(jié)果顯示:天山花楸多糖水溶液對枯草桿菌的抑菌作用最明顯，對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌幾乎沒有抑菌作用，結(jié)果見表2。

表2 天山花楸中多糖抑菌實驗結(jié)果Tab.2 Results of bacteriostasis test on polysaccharides from orbus tianschanica Rupr. mm，n=3

2.2.6 最低抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)的測定 在測定天山花楸多糖MIC實驗中，選取其抑菌效果最好的枯草桿菌作為菌液。取無菌試管10支，分別編號，第1管加液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液3.6mL，第2～第10管分別加液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液2mL;吸取已稀釋好的天山花楸多糖溶液0.4mL加入第1管，混勻后吸取2mL加入第2管中，依次倍比稀釋至第9管，混勻后自第9管棄去2mL，第10管不加多糖溶液，為對照組管;用微量加樣器取濃度為 1×105個·mL－1的枯草桿菌菌液 0.05mL，依次由低濃度至高濃度加入各管中，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后觀察結(jié)果[10]。觀察培養(yǎng)液的渾濁程度，以渾濁試管中多糖最低濃度管為該實驗菌MIC。見表3。結(jié)果顯示，第5～9管均呈現(xiàn)渾濁狀態(tài)，表明試管內(nèi)有細(xì)菌生長，第1～4管未渾濁，表明試管內(nèi)沒有細(xì)菌生長，抑菌效果明顯，其中第4管是最小抑菌和非最小抑菌的臨界值，第4管所對應(yīng)的天山花楸多糖濃度為多糖對枯草桿菌 MIC，其MIC為0.64 mg·mL－1。

3 討論

抑菌實驗要求檢查菌種有革蘭陽性菌、革蘭陰性菌，且在《中華人民共和國藥典》2010年版二部附錄上有抑菌劑效力檢查的指導(dǎo)原則[11]，故本實驗操作選用較為常見的枯草桿菌(革蘭陽性菌)、金黃色葡萄球菌(革蘭陽性菌)和大腸埃希菌(革蘭陰性菌)進(jìn)行抑菌檢查。抑菌實驗表明，天山花楸多糖溶液具有一定的抑菌作用，其中對枯草桿菌的抑菌作用較明顯，而對大腸埃希菌和金黃色葡萄球菌幾乎沒有抑菌作用，本實驗可為該種植物進(jìn)一步的研究開發(fā)提供有益參考。

表3 天山花楸中多糖最小抑菌濃度實驗結(jié)果Tab.3 Results of minimal inhibitory concentraton of polysaccharides from Sorbus tianschanica Rupr.

[1]新疆維吾爾自治區(qū)衛(wèi)生廳.維吾爾藥材標(biāo)準(zhǔn)(上冊)[M].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社，1993:92.

[2]李樂，呂順忠，唐輝.高效液相色譜法測定天山花楸葉中槲皮素和山奈素含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2013，32(7):928－929.

[3]王慶奎，邢克智，趙海運，等.當(dāng)歸多糖除蛋白質(zhì)的方法與條件優(yōu)化[J].時珍國醫(yī)國藥，2011，122(2):525－526.

[4]葉方，楊光義，王剛，等.柴胡多糖的研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2012，31(8):1042－1045.

[5]鐘巖，潘浦群，汪艷紅，等.苯酚－硫酸法測定鮮人參中多糖含量[J].時珍國醫(yī)國藥，2008，19(8):1957－1958.

[6]袁羿，劉濤，馬龍，等.瑣瑣葡萄多糖顆粒劑中多糖的含量測定[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2010，33(5):512－513.

[7]袁榮高，楊留才，劉德軍，等.靈芝多糖對糖尿病大鼠腎臟保護(hù)作用機(jī)制研究[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2014，33(2):144－148.

[8]張薇，周芳，常軍民，等.苯酚-硫酸法測定天山花楸果實中多糖含量[J].新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報，2012，35(9):1187－1188，1192.

[9]沈萍，陳向東.微生物學(xué)實驗[M].北京:高等教育出版社，2007:65.

[10]王斌.湘西北武陵山區(qū)黑石耳提取物抑菌作用的研究[J].中央民族大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2013，22(4):30－33.

[11]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(二部)[M].北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:1027－1029.