金水寶片對(duì)順鉑所致大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用及機(jī)制

劉學(xué)武，周志敏，姜德建*，龍 利

（1湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心，長(zhǎng)沙410331；2新藥藥效與安全性評(píng)價(jià)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)沙410331；3湖北省第三人民醫(yī)院腎病科，武漢430033

藥物性腎損傷在臨床用藥時(shí)十分常見(jiàn)，約占急性腎損傷的20%左右。能引起急性腎損傷的藥物有很多，常見(jiàn)的有化療藥物、抗生素、非甾體抗炎藥（nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑等。臨床上發(fā)生藥物性腎損傷時(shí)，通常在停藥以及糾正酸堿度的同時(shí)，給予腎功能保護(hù)藥，以加速腎功能的恢復(fù)。對(duì)已知有腎臟損傷的藥物，通?？陕?lián)合腎功能保護(hù)藥物一起服用，以減少急性腎損傷的發(fā)生和發(fā)展。金水寶片主要用于各種病因所致的急性腎臟損傷的預(yù)防和治療［1-2］，其療效顯著，但作用機(jī)制不甚明確。本研究采用順鉑誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷模型，通過(guò)預(yù)防和治療性給予金水寶片，以評(píng)價(jià)其療效，并探索金水寶片治療急性腎損傷的作用機(jī)制［3］。

1 材 料

1.1 試 劑

金水寶片（江西濟(jì)民可信金水寶制藥有限公司）；地塞米松片（廣東南國(guó)藥業(yè)有限公司）；順鉑注射液（山東仁和堂藥業(yè)有限公司）；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELSIA試劑盒、大鼠活性氧簇（ROS）ELISA試劑盒（武漢貝茵萊生物科技有限公司）；大鼠Caspase 3活性檢測(cè)試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司）；Anti-p38抗體、Anti-p-p38抗體、Anti-Bax抗體、Anti-Bcl-2抗體（英國(guó) Abcam公司）；Anti-β-actin抗體（美國(guó) Proteintech公司）。

1.2 儀 器

TP1020型全自動(dòng)脫水機(jī)、ASP300S型全自動(dòng)組織脫水機(jī)、RM2235型石蠟切片機(jī)、EG1150H＋C型組織包埋（德國(guó)Leica公司）；BX43型生物顯微鏡＋MD50型數(shù)碼成像系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）；LABOSPECT003型自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）；SpectraMax i3x型多功能酶標(biāo)儀（上海美谷分子儀器有限公司）；164-5050電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；DYCZ-40A轉(zhuǎn)膜儀（北京六一儀器廠）。

1.3 動(dòng) 物

SD大鼠144只，SPF級(jí)，雄性，（200±20）g，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK（湘）2016-0002；在湖南省藥物安全評(píng)價(jià)研究中心屏障環(huán)境飼養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SYXK（湘）2015-0016。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方 法

分別進(jìn)行金水寶片預(yù)防性給藥和治療性給藥實(shí)驗(yàn)，其中預(yù)防性給藥實(shí)驗(yàn)采用大劑量的順鉑經(jīng)腹腔注射誘導(dǎo)急性腎損傷模型；治療性給藥采用小劑量的順鉑經(jīng)靜脈注射誘導(dǎo)急性腎損傷模型。腹腔注射順鉑和靜脈注射順鉑分別模擬臨床大劑量或小劑量的順鉑進(jìn)行化療給藥。

2.1 預(yù)防性給藥對(duì)順鉑腹腔注射所致急性腎損傷的作用

雄性SD大鼠66只，按體質(zhì)量隨機(jī)分為正常組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（地塞米松，2 mg／kg）、金水寶片低、中、高劑量組（0.135、0.270、0.540 g／kg），其中正常組6只，其余各組均為12只。各組大鼠按10 mL／kg灌胃給予相應(yīng)劑量金水寶片（研磨成粉末，用蒸餾水配制成相應(yīng)濃度的藥液），每日1次，連續(xù)13 d，正常組、模型組灌胃給予等體積蒸餾水。于給藥7 d后，各組大鼠按5 mL／kg一次性腹腔注射順鉑5 mg／kg誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷模型，正常組腹腔注射給予等體積0.9%氯化鈉注射液。

2.2 治療性給藥對(duì)順鉑靜脈注射所致急性腎損傷的作用

雄性SD大鼠78只，選用其中72只大鼠作為模型組，并按1 mL／kg經(jīng)靜脈注射順鉑2.5 mg／kg，每日1次，連續(xù)5次，誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷模型。另取6只雄性大鼠，采用相同方法注射給予等體積0.9%氯化鈉注射液，作為正常組。各組大鼠于造模結(jié)束后眼眶靜脈叢采血，檢測(cè)腎功能尿素氮（BUN）和肌酐（CRE）水平，選取CRE水平最高的大鼠60只，根據(jù)血清CRE水平兼顧BUN和體重，隨機(jī)分為模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（地塞米松，2 mg／kg）、金水寶片低、中、高劑量組（0.135、0.270、0.540 g／kg），每組12只。每日給藥前將金水寶片（研磨成粉末）用蒸餾水配制成相應(yīng)濃度藥液。各組大鼠均按10 mL／kg灌胃給予相應(yīng)劑量金水寶片，每日1次，連續(xù)9 d，正常組、模型組灌胃給予等體積蒸餾水。

2.3 生理指標(biāo)檢測(cè)

2.3.1 對(duì)腎功能的影響 預(yù)防性給藥和治療性給藥實(shí)驗(yàn)的各組大鼠分別于造模后各時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行眼眶靜脈叢采血，檢測(cè)血清BUN和CRE，以監(jiān)測(cè)腎功能的變化。每次采血前均禁食不禁水6 h，然后眼眶采血約1 mL，3 000 r／min離心10 min，取上層血清，采用自動(dòng)生化儀檢測(cè)血清BUN和CRE。于造模第6天采用代謝籠收集各組大鼠6 h尿量，測(cè)量排尿量，并用自動(dòng)生化儀檢測(cè)尿肌酐水平，并計(jì)算肌酐清除率（mL／min）＝尿肌酐×排尿量／（360×血肌酐）。

2.3.2 對(duì)腎臟組織病理變化的影響 各組大鼠分別于末次給藥后禁食不禁水6 h，CO2麻醉，放血安樂(lè)死，取左側(cè)腎臟，福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光鏡下觀察腎臟組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和腎小管上皮細(xì)胞變性等病理改變，并進(jìn)行病理評(píng)分，具體評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下:腎小管上皮:正常，完好無(wú)損，記“0”分；極少細(xì)胞變性壞死，記“1”分；輕度，記“2”分；中度，記“3”分；重度，記“4”分。透明管型:無(wú)，記“0”分；極少，記“1”分；輕度，記“2”分；中度，記“3”分；重度，記“4”分。炎細(xì)胞浸潤(rùn):無(wú)，記“0”分；極少，記“1”分；輕度，記“2”分；中度，記“3”分；重度，記“4”分。將各類病理改變的評(píng)分進(jìn)行累加，計(jì)算總分作為腎臟損傷的整體病理評(píng)分。

2.3.3 對(duì)細(xì)胞因子的影響 各組大鼠分別于末次給藥后禁食不禁水6 h，取右側(cè)腎臟0.025 g，用冰預(yù)冷PBS洗組織，加入RIPA裂解液200μL于勻漿器中反復(fù)研磨至看不見(jiàn)組織塊，冰上蛋白裂解10 min，4℃，12 000 r／min離心 15 min，取上清液，采用ELISA試劑盒檢測(cè)腎臟組織中 TNF-α、ROS的水平和Caspase 3活性。

2.3.4 對(duì)腎臟凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 取左側(cè)腎臟，福爾馬林固定，石蠟包埋，切片，HE染色，同時(shí)取右側(cè)腎臟0.025 g，用冰預(yù)冷PBS洗組織，加入RIPA裂解液200μL于勻漿器中反復(fù)研磨組織直至看不見(jiàn)組織塊，冰上蛋白裂解10 min，4℃，12 000 r／min離心15 min，將離心后的上清液分裝到0.5 mL的離心管中，并進(jìn)行蛋白定量。分別取總蛋白50μg上樣，進(jìn)行凝膠電泳，半干法轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯（PVDF）膜，以5%的脫脂奶粉封閉1.5 h。用多克隆一抗（兔抗大鼠 t-p38、p-p38、Bax、Bcl-2）與PVDF膜4℃孵育過(guò)夜，TBST洗3次，每次15 min。用HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育90 min，TBST洗3次，每次15 min，ECL化學(xué)發(fā)光法曝光掃描拍照，用Quantity One軟件分析各組大鼠腎臟中t-p38、pp38、Bax、Bcl-2的蛋白相對(duì)表達(dá)量，并計(jì)算各組中相應(yīng)蛋白的表達(dá)與內(nèi)參β-actin的相對(duì)比值。

2.4 統(tǒng)計(jì)方法

本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，計(jì)量資料采用±s表示。用Leven′s test方法檢驗(yàn)方差齊性。用單因素方差分析（One-Way ANOVA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，用LSD test（參數(shù)法）進(jìn)行兩兩比較分析。

3 結(jié) 果

3.1 對(duì)腎功能的影響

3.1.1 對(duì)血清BUN的影響 如圖1所示，經(jīng)預(yù)防性給藥，金水寶片在造模后第3天起效，且持續(xù)給藥，各給藥組BUN在造模后給藥第5天達(dá)到峰值，其中低劑量組血清BUN在造模后給藥第3天較模型組顯著降低（P＜0.05），中、高劑量組血清BUN在第3～6天均較模型組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），各組大鼠血清BUN在造模后給藥第6天可見(jiàn)恢復(fù)趨勢(shì)。經(jīng)治療性給藥，金水寶片在造模后給藥第5天起效，且持續(xù)給藥，各給藥組BUN在造模后給藥第5天達(dá)到峰值，其中低、中劑量組血清BUN在造模后給藥第7、9天較模型組顯著降低（P＜0.05），高劑量組血清BUN在第5～9天均較模型組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），各給藥組BUN在造模后給藥第7天可見(jiàn)恢復(fù)趨勢(shì)。

Figure 1 Prophylactic effect（A）and therapeutic effect（B）of Jinshuibao tablet on blood urea nitrogen（BUN）level of cisplatin induced acute renal injury model in rats（xˉ±s，n＝6 10）1:Normal；2:Model；3:Positive control；4:Jinshuibao tablet（0.135 g／kg）；5:Jinshuibao tablet（0.270 g／kg）；6:Jinshuibao tablet（0.540 g／kg）＃＃P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

3.1.2 對(duì)血清CRE的影響 如圖2所示，經(jīng)預(yù)防性給藥，金水寶片在造模后第3天起效，且持續(xù)給藥，各給藥組CRE在造模后給藥第5天達(dá)到峰值，其中低劑量組血清CRE在造模后各時(shí)間點(diǎn)均與模型組無(wú)明顯差異；中、高劑量組血清CRE在第3～6天均較模型組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），各組大鼠血清CRE在造模后給藥第6天可見(jiàn)恢復(fù)趨勢(shì)。經(jīng)治療性給藥，金水寶片在造模后給藥第5天起效，且持續(xù)給藥，各給藥組CRE在造模后給藥第5天達(dá)到峰值，其中低、中劑量組血清CRE分別在造模后給藥第7、9天較模型組顯著降低（P＜0.05），高劑量組血清CRE在第5～9天均較模型組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），各給藥組CRE在造模后給藥第7天可見(jiàn)恢復(fù)趨勢(shì)。

Figure 2 Prophylactic effect（A）and therapeutic effect（B）of Jinshuibao tablet on serum creatinine（CRE）level of cisplatin induced acute renal injury model in rats（x±s，n＝6 10）1:Normal；2:Model；3:Positive control；4:Jinshuibao tablet（0.135 g／kg）；5:Jinshuibao tablet（0.270 g／kg）；6:Jinshuibao tablet（0.540 g／kg）＃＃P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

3.1.3 對(duì)肌酐清除率和胱抑素C的影響 如圖3所示，與正常組相比，模型組大鼠肌酐清除率顯著減?。≒＜0.01），血清胱抑素 C水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01）；與模型組比較，金水寶片預(yù)防性給藥和治療性給藥后，金水寶片低、中、高劑量組肌酐清除率均顯著增加（P＜0.05或P＜0.01），血清胱抑素C水平均顯著降低（P＜0.05或 P＜0.01）。

3.2 對(duì)腎臟組織的影響

如圖4所示，正常組腎臟皮質(zhì)、髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，腎單位形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，間質(zhì)未見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組腎臟大量腎小管上皮細(xì)胞變性、壞死，并可見(jiàn)纖維化，大量管內(nèi)可見(jiàn)透明管型，間質(zhì)可見(jiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；經(jīng)預(yù)防性給藥或治療性給藥后，金水寶片各劑量組的腎小管變性、壞死以及炎癥浸潤(rùn)等程度均較模型組有顯著改善，且具有顯著的劑量依賴關(guān)系，其中預(yù)防性給藥的起效劑量為低劑量（0.135 g／kg），治療性給藥的起效劑量為中劑量（0.270 g／kg）。

Figure 3 Prophylactic effect and therapeutic effect of Jinshuibao tablet on creatinine clearance rate（A）and cystatin Clevel（B）of cisplatin induced acute renal injury model in rats（xˉ±s，n＝6 10）1:Normal；2:Model；3:Positive control；4:Jinshuibao tablet（0.135 g／kg）；5:Jinshuibao tablet（0.270 g／kg）；6:Jinshuibao tablet（0.540 g／kg）＃＃P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

Figure 4 Prophylactic effect and therapeutic effect of Jinshuibao tablet on the changes of renal histopathology of cisplatin induced acute renal injury model in rats（xˉ±s，n＝6 10）A:Prophylactic administration；B:Therapeutic administration；C:Renal histopathology scores1:Normal；2:Model；3:Positive control；4:Jinshuibao tablet（0.135 g／kg）；5:Jinshuibao tablet（0.270 g／kg）；6:Jinshuibao tablet（0.540 g／kg）＃＃P＜0.01 vs normal group；**P＜0.01 vs model group

3.3 對(duì)腎臟炎癥和氧化應(yīng)激相關(guān)因子的影響

如圖5所示，與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織中 TNF-α、ROS含量升高（P＜0.05或 P＜0.01）；與模型組比較，金水寶片預(yù)防性給藥和治療性給藥均能顯著降低大鼠急性腎損傷模型腎組織TNF-α和 ROS含量（P＜0.05或 P＜0.01），且其藥效作用具有明顯的劑量依賴關(guān)系。

3.4 對(duì)腎臟細(xì)胞凋亡蛋白的影響

3.4.1 對(duì)腎臟 Caspase 3活性以及 t-p38、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)的影響 如圖6、7所示，與正常組比較，模型組大鼠腎臟組織Caspase 3活性顯著升高（P＜0.05或 P＜0.01），t-p38、p-p38蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，經(jīng)預(yù)防性給藥和治療性給藥后，金水寶片低、中、高劑量組Caspase3活性均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），腎臟組織t-p38和p-p38蛋白的表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01）顯著減少，且均具有明顯的劑量依賴關(guān)系。

3.4.2 對(duì)腎臟Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)以及Bax／Bcl-2比值的影響 如圖7、8所示，與正常組比較，模型組腎臟Bax的蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)顯著減少（P＜0.01），Bcl-2／Bax比值顯著減?。≒＜0.01）；預(yù)防性給藥和治療性給藥均能顯著減少腎臟組織Bax蛋白的表達(dá)（P＜0.05或P＜0.01），增加 Bcl-2的蛋白表達(dá)（P＜0.01），并顯著增大Bcl-2／Bax比值（P＜0.01），且均具有明顯劑量依賴關(guān)系。

Figure 6 Prophylactic effect and therapeutic effect of Jinshuibao tablet on the protein expression of t-p38（A），p-p38（B）and the activity of Caspase 3（C）of cisplatin induced acute renal injury model in rats（xˉ±s，n＝6 10）1:Normal；2:Model；3:Positive control；4:Jinshuibao tablet（0.135 g／kg）；5:Jinshuibao tablet（0.270 g／kg）；6:Jinshuibao tablet（0.540 g／kg）＃＃P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

Figure 7 Prophylactic effect and therapeutic effect of Jinshuibao tablet on the protein expression of Bax（A）、Bcl-2（B）and the ratio of Bcl-2／Bax（C）of cisplatin induced acute renal injury model in rats（xˉ±s，n＝6 10）1:Normal；2:Model；3:Positive control；4:Jinshuibao tablet（0.135 g／kg）；5:Jinshuibao tablet（0.270 g／kg）；6:Jinshuibao tablet（0.540 g／kg）＃＃P＜0.01 vs normal group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs model group

Figure 8 Prophylactic effect（A）and therapeutic effect（B）of Jinshuibao tablet on the protein expression of t-p38，p-p38，Bax and Bcl-2 of cisplatin induced acute renal injury model in rats（xˉ±s，n＝6 10）1:Normal；2:Model；3:Positive control；4:Jinshuibao tablet（0.135 g／kg）；5:Jinshuibao tablet（0.270 g／kg）；6:Jinshuibao tablet（0.540 g／kg）

4 討 論

急性腎損傷是一種以短時(shí)間內(nèi)腎小球?yàn)V過(guò)率迅速下降為主要特點(diǎn)的臨床綜合征，是臨床常見(jiàn)的危重病癥之一，發(fā)病后的病死率極高，其病理生理過(guò)程較為復(fù)雜，主要累及腎臟管狀細(xì)胞和血管細(xì)胞的損害，且伴有明顯的炎癥反應(yīng)。本研究分別通過(guò)單次大劑量腹腔注射5 mg／kg的順鉑和連續(xù)5 d小劑量靜脈注射2.0 mg／kg的順鉑誘導(dǎo)大鼠急性腎損傷模型，其中腹腔注射和靜脈注射分別與臨床腹腔灌注給藥和靜脈注射給藥的方式和劑量接近［4-5］。經(jīng)兩種給藥方案造模后，大鼠均表現(xiàn)為典型的急性腎損傷癥狀，如血清CRE、BUN顯著升高，肌酐清除率顯著下降，其中單次大劑量造模的大鼠血清CRE和BUN可升高至小劑量造模的3倍左右，胱抑素C水平可升高至小劑量造模的1.2倍左右，肌酐清除率可下降至小劑量造模的20%左右，組織病理學(xué)結(jié)果也顯示了單次大劑量造模能引更嚴(yán)重的急性腎損傷。分別通過(guò)對(duì)單次大劑量造模大鼠進(jìn)行預(yù)防性給藥以及對(duì)多次小劑量造模的大鼠進(jìn)行治療性給藥后發(fā)現(xiàn)，雖然單次大劑量造模能引起更嚴(yán)重的急性腎損傷，但預(yù)防性給藥仍能較好的改善順鉑所致的急性腎損傷，且其療效較治療性給藥更好，主要表現(xiàn)為血清CRE、BUN指標(biāo)的起效時(shí)間縮短（3 d vs 5 d），且肌酐清除率可恢復(fù)到與治療性給藥方式的相當(dāng)水平，提示在臨床應(yīng)用時(shí)，通過(guò)提前預(yù)防性給藥，能較早的干預(yù)藥物性腎損傷發(fā)生和發(fā)展。

研究表明，順鉑經(jīng)腎臟排泄時(shí)，可損傷腎小管上皮而產(chǎn)生炎癥和氧化等應(yīng)激反應(yīng)，并進(jìn)一步釋放炎癥因子（TNF-α、IL-6、IL-1β等）和氧化產(chǎn)物（ROS）等［6-7］，進(jìn)而引起速腎臟細(xì)胞的變性、凋亡和壞死［8-9］。炎癥和氧化應(yīng)激做為刺激信號(hào)，可誘導(dǎo)p38的表達(dá)和磷酸化激活［10-11］，磷酸化的 p38（p-p38）可進(jìn)一步刺激各種細(xì)胞因子的分泌［12-13］，同時(shí)p-p38還能通過(guò)誘導(dǎo)Bax的轉(zhuǎn)位和Bcl-2的表達(dá)來(lái)調(diào)控 Bax、Bcl-2的變化［14］。Bax和 Bcl-2可作為上游信使和下游底物調(diào)節(jié)Caspase 3的表達(dá)。Caspase 3作為細(xì)胞凋亡的下游執(zhí)行者，其高表達(dá)能加速細(xì)胞凋亡的進(jìn)程［14-16］。本研究結(jié)果顯示，金水寶片均能通過(guò)抑制腎臟中TNF-α和ROS的含量來(lái)達(dá)到抗炎和抗氧化的作用，并通過(guò)降低t-p38、p-p38和Bax的蛋白表達(dá)，升高Bcl-2的蛋白表達(dá)來(lái)抑制p38 MAPK通路的活化、降低Caspase 3的活性，提示金水寶片對(duì)順鉑所致急性腎損傷的保護(hù)作用機(jī)制可能與其減少 TNF-α，抑制 ROS-p38MAPK-Caspase 3通路來(lái)誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān)，且金水寶片預(yù)防性給藥和治療性的作用機(jī)制基本類似。

綜上所述，金水寶片預(yù)防性給藥和治療性給藥均能顯著改善順鉑所致的急性腎損傷模型的腎功能以及腎臟的組織病理變化，提示金水寶片對(duì)順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷具有顯著防治作用，且其作用機(jī)制可能與金水寶片的抑制TNF-α、抑制ROS-p38MAPK-Caspase 3通路，進(jìn)而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。