過敏性休克猝死者IgE、IL-4、IL-13在組織中的表達及法醫(yī)學意義

王玉丹，張忠慶，亓開元，崔光來，丁憲國，劉 勇

(1.遵義醫(yī)學院 法醫(yī)學院法醫(yī)病理學教研室，貴州 遵義 563099 2.遵義醫(yī)學院 法醫(yī)學院2014級，貴州 遵義 563099)

臨床醫(yī)學研究

過敏性休克猝死者IgE、IL-4、IL-13在組織中的表達及法醫(yī)學意義

王玉丹1，張忠慶1，亓開元2，崔光來2，丁憲國2，劉 勇1

(1.遵義醫(yī)學院 法醫(yī)學院法醫(yī)病理學教研室，貴州 遵義 563099 2.遵義醫(yī)學院 法醫(yī)學院2014級，貴州 遵義 563099)

目的觀察過敏性休克猝死者組織中IgE、IL-4、IL-13的表達，探討其在法醫(yī)學中的作用。方法過敏性休克猝死組為遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院司法醫(yī)學鑒定中心2010～2016年臨床高度懷疑，經(jīng)尸檢明確診斷為過敏性休克猝死病例15例，對照組為機械性損傷死亡病例20例。取兩組病例的肺、氣管、喉、脾、腸組織塊經(jīng)福爾馬林固定，HE染色觀察組織的病理學變化，免疫組化(Immunohistochemistry，IHC)法檢測組織中IgE、IL-4、IL-13的表達水平。結果與對照組比較，過敏性休克猝死組見較多嗜酸性粒細胞浸潤伴不同程度水腫，組織中IgE、IL-4、IL-13的表達明顯增強。結論過敏性休克猝死者組織中IgE、IL-4、IL-13在肺、氣管、喉、脾、腸中的表達增強，提示其參與了過敏性休克的發(fā)生，可作為鑒定過敏性休克猝死的實驗室診斷參考輔助指標之一。

過敏性休克；白細胞介素4；白細胞介素13；免疫球蛋白E；猝死

在法醫(yī)鑒定中過敏性休克死亡病例常見，但過敏反應發(fā)生在死亡前還是死亡后的診斷依據(jù)目前尚未解決，且致病因素和病理生理學過程的復雜性，法醫(yī)診斷往往得不到肯定的結論，在常規(guī)案件中過敏性死亡的死后診斷仍然基于排除其他診斷和間接證據(jù)診斷。血清總免疫球蛋白E(Immunoglobulin E，IgE)、肥大細胞類胰蛋白酶目前被作為過敏性休克診斷的實驗室參考指標，但肥大細胞類胰蛋白酶正常參考值范圍國際還未統(tǒng)一，并且在各組織的分布及含量不明確。而IgE的血清含量與死后凝血、溶血、年齡、某些IgE寄生蟲病、遺傳性過敏癥患者有關，單一檢測IgE并不能客觀反映死者死因[1]。故死者體內IgE含量升高或正常并不能說明死者生前是否發(fā)生過敏反應，應聯(lián)合其他指標共同檢測判斷。目前已知的IgE調節(jié)因子IL-4( Interleukin-4，IL-4)和IL-13( Interleukin -13，IL-13)，在非IgE介導及IgE介導的過敏反應中表達均增加，在過敏反應中起重要作用[2]。前期在豚鼠過敏性休克模型中用ELISA法檢測到過敏性休克組豚鼠血清中IgE、IL-4和IL-13含量較對照組均明顯升高，結果具有統(tǒng)計學差異[3]。本實驗通過回顧研究15例臨床高度懷疑且經(jīng)尸檢明確診斷為過敏性休克猝死病例，采用IHC法檢測死者肺、氣管、喉、脾、腸組織中IgE、IL-4、IL-13的表達情況，以探討IgE、IL-4、IL-13在法醫(yī)學診斷過敏性休克中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 臨床高度懷疑且經(jīng)尸檢明確診斷為過敏性休克猝死病例15例及機械性損傷死亡病例20例均來自遵義醫(yī)學院附屬醫(yī)院司法醫(yī)學鑒定中心2010～2016年的病例，其中過敏性休克猝死組在尸檢時抽血檢測其IgE血清含量，均經(jīng)過系統(tǒng)的尸體檢驗(死后6～72 h)，尸檢時臟器組織固定于10%中性福爾馬林緩沖液中。

1.2 主要試劑與儀器 Rabbit Anti-IgE[RM122](ab195 580)、Rabbit Anti-IL-4(ab9 622)、Rabbit Anti-IL-13(ab106 732)、MaxvisonTMHRP(Mouse/Rabbit)IHC Kit(KIT-5 020)、UltraDAB顯色試劑盒(DAB-4 032)均購于Abcam有限公司。組織包埋儀(德國LEICA公司)、石蠟切片機(德國LEICA公司)、光學顯微鏡(日本OLYMPUS公司)、圖像采集系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)。

1.3 方法 各組經(jīng)10%甲醛固定后的肺、氣管、喉、脾、腸，取材修剪、沖洗、酒精脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片。

1.3.1 HE染色 切片烘烤、脫蠟、染色、封片、鏡檢。

1.3.2 免疫組化 二步法，切片常規(guī)脫蠟至水，高壓鍋熱修復法修復抗原，一抗4 ℃過夜( Rabbit Anti-IgE、Rabbit Anti-IL-4、Rabbit Anti-IL-13，抗體濃度均為1:150)，按照免疫組織化學染色試劑盒(abcam公司)說明書進行操作。陰性對照以PBS代替一抗。

1.3.3 結果判定 鏡下觀察IgE主要定位于細胞質內，呈棕黃色顆粒，位于嗜酸性粒細胞、肥大細胞、組織細胞、淋巴濾泡、肺泡上皮細胞，血管壁及其周圍組織間隙亦出現(xiàn)淺黃色或棕黃色顆粒；IL-4、IL-13主要定位于細胞質內，呈棕黃色顆粒，位于嗜酸性粒細胞、組織細胞、巨噬細胞、肺上皮細胞，小血管及結締組織出現(xiàn)淺黃色或棕黃色區(qū)域。用IPPWIN32軟件進行分析，計算OD(平均光密度值)=IOD(積分光密度值)/Area(面積)。

2 結果

2.1 15例過敏性休克猝死病例血清IgE含量 、過敏原因及致敏后死亡時間(見表1)。

2.2 HE染色 對照組鏡下各組織見極少量或無嗜酸性粒細胞浸潤，組織無明顯水腫。過敏性休克猝死組肺淤血水腫，支氣管、喉、氣管粘膜層充血水腫；肺泡壁及間質內、支氣管、喉、氣管、腸粘膜層及脾髓索髓竇內見大量嗜酸性粒細胞浸潤(見圖1)。

2.3 組織中IgE的表達 對照組肺泡上皮細胞胞質、肺泡隔及喉個別組織細胞、腸粘膜下呈少量棕黃色顆粒表達，脾、氣管陰性表達。過敏性休克猝死組中2例(198 U/mL、179 U/mL)弱陽性表達，13例(血清IgE均大于333 U/mL)各組織呈陽性或強陽性表達：肺內嗜酸性粒細胞、組織細胞、肺泡上皮細胞胞質及肺泡隔、血管周圍、支氣管周圍呈棕褐色顆粒強陽性表達；喉嗜酸性粒細胞及組織細胞胞質內陽性表達；脾淋巴濾泡、嗜酸性粒細胞胞質陽性表達；腸組織細胞胞質、粘膜固有層陽性表達(見圖2)，其中1例(嬰兒)腸組織中表達強陽性。用IPPWIN32軟件進行分析，過敏性休克猝死組與對照組比較肺、氣管、喉、脾、腸IgE表達明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表2)。

表1 15例過敏性休克猝死病例尸體血清中IgE含量

序號性別年齡(歲)過敏原因致敏后死亡時間(min)IgE含量(U/mL)1男44青霉素 101270．02男1 頭孢派酮30410．53男8個月奶粉 60520．14男63頭孢克洛40198．05女25頭孢他啶30430．66男40青霉素 30179．07男35頭孢克肟51120．48女49頭孢派酮51230．59男50青霉素 101450．310男38頭孢克肟30987．511女44頭孢替安40656．512男43青霉素 5894．513男32 頭孢呋辛酯60945．714男28頭孢地尼101020．715男56青霉素 30905．5

成人血清IgE水平約在20～200 U/mL，一般認為大于333 U/mL(800 ng/mL)時為異常升高。嬰兒臍帶血IgE水平小于0.5 U/mL，出生后隨年齡增長而逐漸升高，12歲達成人水平。

A-E:分別為過敏性休克猝死組肺、氣管、喉、脾、腸HE染色，各組織見較多嗜酸性粒細胞浸潤;F-J:分別為對照組肺、氣管、喉、脾、腸HE染色，各組織極少量或無嗜酸性粒細胞浸潤。圖1 肺、氣管、脾、腸組織嗜酸性粒細胞浸潤情況(HE×400)

A-E：過敏性休克猝死組肺、氣管、喉、脾、腸IgE免疫組化染色結果;F-J：對照組肺、氣管、喉、脾、腸IgE免疫組化染色結果。圖2 肺、氣管、喉、脾、腸IgE表達(IHC二步法×400)

表2各組織IgE平均光密度

組別例數(shù)IgE平均光密度(x±s)肺氣管喉脾腸實驗150．42±0．03?0．28±0．03?0．38±0．02?0．28±0．01?0．24±0．04?對照200．23±0．010±0 0．11±0．010±0 0．11±0．02

*表示與對照組比較，P<0.05。

2.4 組織中IL-4的表達 對照組肺、氣管、脾表達較多，其中脾組織在脾髓索髓竇內表達，余組織內少量表達。過敏性休克猝死組在脾髓索、髓竇內嗜酸性粒細胞、肥大細胞、巨噬細胞、組織細胞胞質棕褐色顆粒表達較多，淋巴濾泡內無表達；肺嗜酸性粒細胞、肥大細胞、組織細胞、肺上皮細胞胞質、肺泡隔及血管周圍、支氣管周圍呈棕褐色顆粒表達較多；喉淋巴組織內棕褐色顆粒表達；腸淋巴組織、粘膜層、嗜酸性粒細胞胞質棕褐色顆粒表達(見圖3)。用IPPWIN32軟件進行分析，過敏性休克猝死組與對照組比較肺、氣管、喉、脾、腸IL-4表達明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,見表3)。

A-E：過敏性休克猝死組肺、氣管、喉、脾、腸IL-4免疫組化結果，均呈強陽性表達;F-J：對照組IL-4免疫組化結果，肺、氣管、脾陽性表達，喉、腸為弱陽性。圖3 肺、氣管、喉、脾、腸IL-4表達(IHC二步法×400)

表3各組織IL-4平均光密度

組別例數(shù)IL-4平均光密度(x±s)肺氣管喉脾腸實驗150．52±0．06?0．33±0．02?0．34±0．03?0．41±0．02?0．26±0．03?對照200．21±0．010．22±0．030．17±0．010．23±0．020．14±0．01

*表示與對照組比較，P<0.05。

2.5 組織中IL-13的表達 對照組肺、脾表達較多，脾臟在髓索、髓質內少量棕黃色顆粒表達，余組織內少量表達。過敏性休克猝死組在肺泡嗜酸性粒細胞、肥大細胞、組織細胞、上皮細胞胞質及肺泡隔及血管、支氣管周圍呈棕褐色顆粒強陽性表達；喉嗜酸性粒細胞、肥大細胞、組織細胞胞質內棕褐色顆粒強陽性表達；脾髓索、髓竇內嗜酸性粒細胞、肥大細胞、組織細胞、巨噬細胞胞質棕褐色顆粒強陽性，淋巴濾泡無表達；腸淋巴組織細胞胞質、粘膜固有層、嗜酸性粒細胞強陽性表達(見圖4)。用IPPWIN32軟件進行分析，過敏性休克猝死組與對照組比較肺、氣管、喉、脾、腸IL-4表達明顯增強，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，見表4)。

表4各組織IL-13平均光密度

組別例數(shù)IL-13平均光密度(x±s)肺氣管喉脾腸實驗150．44±0．04?0．35±0．02?0．37±0．01?0．43±0．02?0．27±0．02?對照200．21±0．030．12±0．010．18±0．020．26±0．020．11±0．02

*表示與對照組比較，P<0.05。

A-E:過敏性休克猝死組肺、氣管、喉、脾、腸IL-13免疫組化結果，均為強陽性表達; F-J:對照組IL-13免疫組化結果，肺、脾為陽性表達，氣管、喉、腸為弱陽性。圖4 肺、氣管、喉、脾、腸IL-13表達(IHC二步法×400)

3 討論

過敏反應是一種Ⅰ型超敏反應，癥狀可從輕微到嚴重，甚至在短短幾分鐘內致人死亡，本病例中注射藥物后最快5 min內出現(xiàn)死亡。過敏反應通常是由IgE介導的，其診斷價值已被認可。過敏原首次進入機體可誘導特異性B細胞產(chǎn)生抗體IgE，通過Fc片斷選擇性附著在皮膚、呼吸道或消化道黏膜以及血液中的某些細胞，當抗原再次進入時FCεRI發(fā)生橋聯(lián)使受體細胞激活釋放多種生物活性介質，以血管擴張和血管滲漏為特征，導致持續(xù)性低血壓及心輸出量減少，出現(xiàn)休克癥狀。本實驗HE染色見嗜酸性粒細胞在各組織中表達增加，以喉、肺、脾表達更多，與Edston[4]研究發(fā)現(xiàn)的過敏性死者肺、脾組織中嗜酸性粒細胞增加相似。過敏性休克猝死組中14例死于藥物過敏，特別是抗生素類藥物，1例(嬰兒)死于奶粉過敏。尸檢時檢測血清IgE，13例均大于333 U/mL ，2例在正常范圍(198 U/mL、179 U/mL)，尸檢并未發(fā)現(xiàn)其他嚴重致死性疾病，根據(jù)其過敏原接觸史及臨床表現(xiàn)診斷為過敏性休克猝死。過敏性休克猝死組中血清IgE含量均升高的13例免疫組化顯示肺、氣管、喉、脾、腸均呈陽性至強陽性表達，且大多在肺、氣管、喉、脾(淋巴濾泡)、腸組織細胞、嗜酸性粒細胞胞質內，從統(tǒng)計結果中提示肺組織是反應最強的器官。與謝洪波[5]檢測豚鼠過敏性休克死后肺、氣管、脾、腸組織IgE呈陽性表達結果相似。其中1例(嬰兒)奶粉過敏死亡的腸組織中IgE表達最強，提示食物過敏時胃腸組織可能是反應最強烈的器官。過敏性休克猝死組中2例(IgE濃度198 U/mL、179 U/mL)IgE弱陽性表達，提示某些過敏反應可能不是通過激活IgE發(fā)生，可能是某些抗生素、藥物直接促進體內肥大細胞脫顆?；蚴人嵝粤＜毎尫叛仔越橘|，發(fā)生所謂的過敏樣免疫反應，此時死者體內IgE并不升高，或是受死后各種因素影響，如死后尸體未在短時間內冷凍保存[6]、死后組織自溶等。故單純檢測血清或組織IgE表達在法醫(yī)學鑒定中也只能作為輔助參考指標，應聯(lián)合其他指標共同診斷。

IL-4在1982年被Howard發(fā)現(xiàn)并命名為B細胞生長因子-1(B cell growth factor-1，BCGF-1)，因其在T細胞培養(yǎng)上清液中能促進B細胞的增殖。IL-4是Ⅱ型輔助T細胞分泌的細胞因子，嗜堿性粒細胞、嗜酸性粒細胞、肥大細胞、NK細胞也能分泌。本實驗過敏性休克猝死組中IL-4主要位于肺嗜酸性粒細胞、組織細胞、肺上皮細胞胞質，喉及脾髓索、髓竇內嗜酸性粒細胞、組織細胞胞質，腸淋巴組織、粘膜層、嗜酸性粒細胞胞質，且各組織強陽性表達。過敏性休克猝死組IL-4不僅在上述細胞內高表達，其分泌顆粒在組織中也被檢測到，提示IL-4參與了過敏性休克的發(fā)生。本實驗IL-4多表達在嗜酸性粒細胞胞質中，與Gessner[7]等通過小鼠模型發(fā)現(xiàn)IL-4在嗜堿性粒細胞中激活后產(chǎn)生表達不一致，提示在動物和人體內過敏性反應發(fā)生時IL-4產(chǎn)生機制可能有差別，或基于對嗜堿性粒細胞檢測的難度。

研究發(fā)現(xiàn)在缺乏IL-4基因，表達IL-13的轉基因小鼠淋巴組織中IL-13能誘導IgE產(chǎn)生[8]。故IL-4不是使類別抗體轉向IgE的唯一途徑，提示IL-13也起著重要作用。IL-13是一種由CD4+Th2細胞分泌的多效性細胞因子，也能誘導人類B細胞類抗體轉向IgE，對IgE有上調作用。IL-13與IL-4的基因序列上有四分之一的同源性，兩者在功能上重疊，被認為是IgE類轉換與過敏性疾病發(fā)展的核心。IgE激活的肥大細胞表達IL-13mRNA，持續(xù)時間長達72h[9]。IL-13可刺激和活化B細胞生長，誘導IgE合成，在B細胞產(chǎn)生IgE過程中IL-13是除IL-4以外的另一個重要的B細胞刺激因子[10]。本實驗過敏性休克猝死組中IL-13主要在各組織嗜酸性粒細胞及組織細胞胞質中表達，IL-13不僅在上述細胞內高表達，其分泌顆粒在組織中也被檢測到，故IL-13和IL-4一樣參與了過敏性反應的發(fā)生。

綜上所述，本實驗過敏性休克猝死組均表達IL-4、IL-13，且與對照組比較有明顯統(tǒng)計學差異，過敏性休克猝死組肺、氣管、喉、脾呈強陽性表達，腸呈陽性表達，大多表達在嗜酸性粒細胞、肥大細胞、組織細胞、巨噬細胞內，少量在細胞外組織內被檢測到，分析上述細胞在過敏反應時分泌進入組織發(fā)揮作用，提示IL-4、IL-13與IgE一樣參與了過敏性休克發(fā)生，證實它們在組織中的高表達。結果與豚鼠過敏性休克模型研究中IgE、IL-4、IL-13在血清中含量升高一樣[3]，也與McGwire等[11]報道過敏性疾病中肺、氣管、脾、腸中均表達IL-4、IL-13一致。IgE在脾中的表達位置與IL-4、IL-13不同，IgE主要表達在脾濾泡中心淋巴組織內，而IL-4、IL-13主要表達在脾髓索髓竇內，與其產(chǎn)生細胞分布相符合。Gaspard等[12]報道青霉素過敏者中特異性IgE抗體陽性與IL-4、IL-13和IFN-r升高及IL-10降低有關，IL-4與IL-13在血清中水平存在正相關。實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計提示本實驗過敏性休克猝死組IL-4、IL-13在各組織中的表達均強于IgE，提示在過敏性反應中發(fā)揮重要作用，但本實驗IL-13的表達與IL-4的表達差異不明顯，仍需進一步研究。且IL-4、IL-13在正常組織內表達較多，提示其除參與過敏反應外，可能還參與其他的發(fā)病機制。總之，在IgE和非IgE介導的過敏性反應中，IL-4和IL-13都參與其發(fā)生，聯(lián)合檢測IgE、IL-4、IL-13有望作為過敏性休克猝死的診斷參考輔助指標之一。

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[收稿2017-08-04;修回2017-10-19]

(編輯：王福軍)

TheexpressionandsignificanceofIgE、IL-4andIL-13fromtissueofsuddendeathbyanaphylacticshockinforensicmedicine

WangYudan1，ZhangZhongqing1，QiKaiyuan2，CuiGuanglai2，DingXianguo2，LiuYong1

(1.Department of Forensic Pathology， Forensic Medicine College，Zunyi Medical University,Zunyi Guizhou 563099，China；2.Grade 2014，F(xiàn)orensic Medicine College，Zunyi Medical University，Zunyi Guizhou 563099，China)

ObjectiveThe expression on IgE,IL-4 and IL-13 from the tissues of sudden death of anaphylactic shock was examined to detect its role in forensic diagnosis of anaphylactic shock.MethodsThe sudden death from anaphylactic shock were highly under clinical suspicion and clearly confirmed by forensic diagnosis.The number of these specimens is 15,and was obtained from Zunyi Medical University SFJDZX during 2010 to 2016.The control group was 20 cases,died from mechanical injury.Tissues of lung,trachea,larynx,spleen and intestine were fixed with formalin and stained with HE；The pathological changes were observed,and the expressions levels of IgE,IL-4 and IL-13 were detected by immunohistochemistry.ResultsThe phenomenon of more eosinophils infiltration with edema in the various degrees,and increasing levels of IgE,IL-4 and IL-13 in experimental group were found,compared with the control group.ConclusionThe expression of IL-4,IL-13 and IgE in sudden death tissues of anaphylactic shock was increased,which is involved in the occurrence of anaphylactic shock,and can be used as one of the reference indexes for the identification of sudden pathological changes of anaphylactic shock sudden death.

anaphylactic shock;Interleukin-4;Interleukin -13;Immunoglobulin E;sudden death

貴州省科學技術基金資助項目(NO:黔科合J字2012-2362)。

劉勇，男，副教授，研究方向：法醫(yī)病理學，E-mail:517243273@qq.com。

D919.4

A

1000-2715(2017)06-0650-06