褐藻膠裂解酶的基因克隆及表達(dá)條件優(yōu)化

許 超，黃桂媛，王巧貞，盧明倩，張榮燦，廖 威，張?jiān)崎_(kāi)*，黃庶識(shí)

（1.廣西科學(xué)院 廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；2.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530003；3.廣西北部灣海洋研究中心，廣西 南寧 530007；4.廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530226）

褐藻膠裂解酶的基因克隆及表達(dá)條件優(yōu)化

許 超1，2，黃桂媛1，王巧貞1，盧明倩1，張榮燦3，廖 威4，張?jiān)崎_(kāi)2*，黃庶識(shí)1

（1.廣西科學(xué)院 廣西海洋天然產(chǎn)物與組合生物合成重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530007；2.廣西大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530003；3.廣西北部灣海洋研究中心，廣西 南寧 530007；4.廣西職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530226）

采用大腸桿菌（Escherichia coli）表達(dá)海洋弧菌（Vibriosp.）X511的褐藻膠裂解酶基因，以實(shí)現(xiàn)對(duì)該酶的大量制備及酶學(xué)性質(zhì)研究。通過(guò)序列分析，預(yù)測(cè)該酶的前20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽，去除信號(hào)肽后的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量約為30 254.28 Da，等電點(diǎn)8.75，分子式為C1368H2100N364O401S6，對(duì)應(yīng)的基因序列命名為alg1987。按如下方案構(gòu)建重組菌：設(shè)計(jì)特異性核酸引物，PCR擴(kuò)增得到alg1987；將重組質(zhì)粒pET-30（a）-alg1987導(dǎo)入大腸桿菌Trans5α進(jìn)行測(cè)序；提取陽(yáng)性pET-30（a）-alg1987質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌BL21，利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）誘導(dǎo)表達(dá)。十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電⒕（SDS-PAGE）檢測(cè)誘導(dǎo)后的重組菌胞液上清，發(fā)現(xiàn)異源表達(dá)的褐藻膠裂解酶分子質(zhì)量大小與預(yù)測(cè)值相近。對(duì)重組菌中的褐藻膠裂解酶進(jìn)行表達(dá)條件優(yōu)化，結(jié)果顯示，最適參數(shù)為誘導(dǎo)溫度16℃，誘導(dǎo)時(shí)間16 h，誘導(dǎo)劑IPTG濃度0.8 mmol/L。

褐藻膠裂解酶；基因；克隆；條件優(yōu)化；表達(dá)

褐藻膠包括海藻酸及其可溶性鹽，是地球上可再生碳水化合物中總儲(chǔ)量?jī)H次于纖維素的多糖物質(zhì)[1-3]，廣泛存在于海洋褐藻門(mén)植物的細(xì)胞壁外層及內(nèi)層，其含量可達(dá)到褐藻干質(zhì)量的10%～40%[4-5]。組成褐藻膠的基本單糖是β-D-甘露糖醛酸（β-D-mannuronic acid，M）和α-L-古羅糖醛酸（α-L-guluronic acid，G），M與G互為差向異構(gòu)體，僅C5所連羧基的位置存在差異[4]。在褐藻膠中通常存在聚甘露糖醛酸（ploymannuronic acid，pM）、聚古羅糖醛酸（polyguluronic acid，pG）、pM/G、M/G共4種結(jié)構(gòu)單元，以隨機(jī)比例通過(guò)1,4-糖苷鍵的聚合作用形成直鏈、無(wú)分支、具有負(fù)電荷的線性大分子多糖[6]。此外，在少數(shù)細(xì)菌如假單胞菌和固氮菌屬等細(xì)菌中也存在褐藻膠，但一般只含多聚甘露糖醛酸[7]，而無(wú)多聚古羅糖醛酸[8]。褐藻膠廣泛應(yīng)用于飼料、食品、農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥[9-11]等多個(gè)行業(yè)。但是褐藻膠分子質(zhì)量大，黏度高，不容易被直接使用[12]，而通過(guò)對(duì)褐藻膠進(jìn)行降解或改性的方法，可得到可發(fā)酵的寡糖及的衍生物，且具有特殊生物活性，拓寬了褐藻膠應(yīng)用領(lǐng)Ⅱ[7]。

目前水解褐藻膠方法可分為3類(lèi)：①物理降解，包括熱解、輻射和超聲降解，此方法的操作過(guò)程較為繁瑣，且存在能耗大及原料轉(zhuǎn)化率低的問(wèn)題，在工業(yè)上應(yīng)用得不多[13]；②化學(xué)降解，包括酸堿及氧化降解，酸水解法是目前比較主流的一種方法，該方法操作繁瑣，反應(yīng)過(guò)程難以控制，廢棄物處理難度大[14-15]；③生物酶法，應(yīng)用褐藻膠裂解酶進(jìn)行水解作用獲得寡糖或者單糖，與物理或者化學(xué)法相比，生物酶法工藝效率高，能耗少，環(huán)境友好，優(yōu)勢(shì)明顯。

褐藻膠裂解酶來(lái)源廣泛，在海洋藻類(lèi)、海洋軟體動(dòng)物和棘皮動(dòng)物以及微生物（包括土壤微生物、海洋微生物、噬菌體和少數(shù)病毒）中均有報(bào)道。在海洋微生物中，又以弧菌屬（Vibrio）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、交替單胞菌（Alteromonas）、假單胞菌屬（Pseudomonas）、交替假單胞菌屬（Pseudoaltermonas）、鞘氨醇菌屬（Sphingosinas）和鏈霉菌屬（Streptomyces）等被研究的最多[16-18]。褐藻膠在褐藻膠裂解酶（alginatelyase）的作用下生成不飽和醛糖酸[19]，可經(jīng)非酶促反應(yīng)轉(zhuǎn)變?yōu)?-脫氧-L-赤式-5-己酮糖糖醛酸（4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronate，DEH）[20-21]，DEH可被還原酶作用變成2-酮基-3-脫氧-D-葡萄糖酸（2-keto-3-deoxy-D-gluconate，KDG），進(jìn)而醛酸為丙酮酸進(jìn)入糖酵解途徑被利用[22-23]。

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，通過(guò)構(gòu)建工程菌對(duì)某一特定功能的基因進(jìn)行大量表達(dá)，是實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的有效途徑。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)褐藻膠裂解酶的異源表達(dá)也做了大量研究，如SHINABARGER D等[24-25]分別將銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）和褐球固氮菌（Azotobacter chroococcum）的褐藻膠裂解酶基因克隆至大腸桿菌（Escherichia coli）并成功表達(dá)；劉航等[26-27]利用大腸桿菌分別表達(dá)得到了紫色鏈霉菌（Treptomyces violaceoruber）和海洋弧菌QY105的褐藻膠裂解酶基因。此外，TAKEDAH等[28]通過(guò)整合鞘氨醇菌（Sphingomonassp.）A1和運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌（Zymomonas mobilis）中褐藻膠的吸收及轉(zhuǎn)化的多個(gè)基因，并阻斷了代謝通路上副產(chǎn)物的代謝途徑，率先在實(shí)驗(yàn)室以褐藻膠為唯一碳源利用重組菌株A1生產(chǎn)乙醇，其發(fā)酵3d后的乙醇產(chǎn)量達(dá)到13.0g/L。WARGACKIAJ等[29]將褐藻膠降解及乙醇合成途徑上的多個(gè)關(guān)鍵酶基因?qū)氪竽c桿菌的染色體，得到了可直接利用褐藻膠生產(chǎn)乙醇的重組菌，其乙醇產(chǎn)量可到達(dá)到理論值的80%。ENQUISTNEWMAN M等[30]構(gòu)建的可直接將褐藻膠轉(zhuǎn)化為乙醇的酵母工程菌株達(dá)到了工業(yè)生產(chǎn)的要求。

本研究克隆篩自北部灣海Ⅱ的海洋弧菌（Vibriosp.）X511中的褐藻膠裂解酶基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒導(dǎo)入大腸桿菌（Escherichia coli），通過(guò)條件優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)該酶的異源大量表達(dá)，以期為大量制備褐藻膠裂解酶及進(jìn)一步研究提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試劑

海藻酸鈉：阿拉丁試劑有限公司；酵母浸膏、蛋白胨：英國(guó)Oxoid公司；七水硫酸鎂、硫酸銨、氯化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸亞鐵：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司；所有試驗(yàn)所用試劑均為分析純。細(xì)菌總DNA提取試劑盒：杭州博日科技公司；PCR高保真ExTaq酶、DNA及RNA Marker、DNA連接試劑盒：大連TakaRa公司；限制性?xún)?nèi)切酶Nde I、Xho I：美國(guó)NEB公司；質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒：美國(guó)Bioflux生物公司。

1.1.2 菌株及質(zhì)粒

海洋弧菌（Vibriosp.）X511為本實(shí)驗(yàn)室篩選保存；質(zhì)粒pET-30（a）：上海捷瑞生物公司；大腸桿菌（Escherichia coli）Trans5α、BL21（DE3）：北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

海藻酸鈉培養(yǎng)基：海藻酸鈉6 g/L，NaCl 15 g/L，硫酸銨5 g/L，磷酸氫二鉀1 g/L，硫酸鎂1 g/L，硫酸亞鐵0.001 g/L，pH 7.5。

活化培養(yǎng)基：海藻酸鈉培養(yǎng)基中的硫酸銨用蛋白胨替代，其他成分保持不變。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，pH調(diào)至7.0。

LA培養(yǎng)基：在LB培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上添加1.5%的瓊脂。以上培養(yǎng)基均在121℃條件下滅菌20 min備用。

1.2 儀器與設(shè)備

TProfessionalstandard96GradientPCR儀：德國(guó)Biometra公司；UNIVERSAL 32R臺(tái)式冷凍離心機(jī)：德國(guó)Hettich科學(xué)儀器公司；TU-1901雙光束紫外可見(jiàn)分光光度儀：北京普析通用儀器公司；OmegaFlour凝膠成像儀：美國(guó)Aplegen公司。

1.3 方法

1.3.1 序列分析

借助SignalP 4.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）分析褐藻膠裂解酶基因的信號(hào)肽；利用ExPASy（http：//web.expasy.org/compute_pi/）預(yù)測(cè)目的蛋白質(zhì)的分子質(zhì)量及等電點(diǎn)信息；在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center of Biotechnology Information，NCBI）（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中Blast目的蛋白，下載同源序列，利用MEGA6.0軟件基于鄰接法（Neighbor-Joining，NJ）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.2 基因克隆

取1 mL于-80℃冰箱中保藏的菌種X511至活化培養(yǎng)基中活化，按1%的接種量轉(zhuǎn)入海藻酸鈉培養(yǎng)基培養(yǎng)過(guò)夜，培養(yǎng)條件均為30℃、200 r/min。根據(jù)細(xì)菌總脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic，DNA）提取試劑盒的操作步驟，提取菌株X511的總DNA經(jīng)稀釋后作為聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）模板。

去除信號(hào)肽后的目的基因長(zhǎng)度為798 bp，采用Vector NTI Advance 11.5軟件設(shè)計(jì)引物，分別在引物兩段添加限制性酶切位點(diǎn)及保護(hù)堿基：alg1987-F：GGAATTC CATATG TCTGATGTAAATAATGGTATCG（下劃線部分為Nde玉酶切位點(diǎn)）；alg1987-R：CCG CTCGAG TTACTTGCCGTTTAGCTTAA（下劃線部分為Xho玉酶切位點(diǎn)）。委托北京奧科生物公司進(jìn)行引物合成。PCR總反應(yīng)體系為：ExTaq酶1μL，6xExTaq酶Buffer5μL，脫氧核糖核苷三磷酸（deoxyribonucleoside triphosphate，dNTP）混合物2.0 μL，上游引物（F）2.0 μL，下游引物（R）2.0 μL，DNA模板2.0 μL，加ddH2O至25μL。PCR擴(kuò)增條件為：98℃預(yù)變性5min，98℃變性10s，50℃退火15 s，68℃延伸50 s，68℃延長(zhǎng)5 min，16℃保存；循環(huán)數(shù)為30次。

1.3.3 表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)試劑盒操作步驟，切膠回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在37℃條件下對(duì)目的基因及pET-30（a）載體進(jìn)行雙酶切，體系為：CutSmartTM 5 μL，Nde玉2 μL，Xho玉2 μL，加入目的基因至50μL，反應(yīng)時(shí)長(zhǎng)2h；分別切膠回收目的基因及載體的雙酶切產(chǎn)物，于16℃按以下條件過(guò)夜連接，體系為：Solution玉10 μL，pET-30a 4 μL，目的DNA 12 μL；將重組載體pET-30（a）-alg1987轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans5α，挑選陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子送上海生工公司測(cè)序，提取序列正確的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌BL21（DE3）[31]。

1.3.4 優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)條件

挑取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子接至LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜，得到種子液；以1%的接種量將種子液轉(zhuǎn)接至LB培養(yǎng)液中，振蕩培養(yǎng)至OD600nm介于0.6～0.8之間，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG）至終濃度為0.4 mmol/L，分別為16℃、25℃、37℃三組不同溫度條件下誘導(dǎo)表達(dá)，在誘導(dǎo)時(shí)間為0、2 h、4 h、8 h、16 h、24 h時(shí)取樣，測(cè)定重組菌破胞液中的褐藻膠裂解酶粗酶活性，選取粗酶活性最高時(shí)對(duì)應(yīng)的條件作進(jìn)一步優(yōu)化。

IPTG可誘導(dǎo)重組菌中異源基因的表達(dá)，但其自身對(duì)微生物細(xì)胞體具有一定的毒害作用，過(guò)高的濃度甚至?xí)⑺兰?xì)胞，影響重組菌的表達(dá)效率。為得到較優(yōu)的添加量，分別對(duì)IPTG終濃度為0、0.2 mmol/L、0.4 mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L進(jìn)行優(yōu)化，選擇褐藻膠裂解酶粗酶活性最高時(shí)對(duì)應(yīng)的IPTG濃度。

1.3.5 褐藻膠裂解酶活性測(cè)定

將培養(yǎng)好的菌液于6 000 r/min、4℃條件下離心10 min收集菌體，用濃度為0.1mol/L，pH值為7.5的Tris-HCl等體積重懸；在冰浴條件下超聲20 min破碎菌體，8 000 r/min，4℃離心5 min，取上清作為粗酶。酶活測(cè)定方法為：向900 μL底物（海藻酸鈉溶于0.1mol/LpH值為7.5的Tris-HCl至質(zhì)量體積比為0.2%）中加入100μL粗酶液，30℃水浴反應(yīng)10min，12 000 r/min條件下離心2 min，測(cè)定上清液在波長(zhǎng)235 nm條件下的OD235nm值[26]，定義光密度值每分鐘上升0.01為一個(gè)酶活力單位（U）。

相對(duì)酶活是指定義同一批試驗(yàn)中酶活性最高一組的為100%，其他試驗(yàn)組的相對(duì)酶活性為該試驗(yàn)組與最高組之間酶活性的比值。

1.3.6 SDS-PAGE電泳

將誘導(dǎo)后的重組菌破胞液液進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電⒕（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE），以初步確定重組菌表達(dá)的褐藻膠裂解酶的分子質(zhì)量。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列分析結(jié)果

采用SignalP4.1Server分析褐藻膠裂解酶基因（見(jiàn)圖1A）對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)序列（全長(zhǎng)共285個(gè)氨基酸），預(yù)測(cè)該蛋白質(zhì)的前20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列（見(jiàn)圖1B下劃線部分）。

圖1 目的基因及蛋白質(zhì)序列Fig.1 Target gene and protein sequence

利用ExPASy分析不含信號(hào)肽的褐藻膠裂解酶序列，預(yù)測(cè)其理論的分子質(zhì)量大小為30 254.28 Da，等電點(diǎn)8.75，分子式為C1368H2100N364O401S6。在NCBI中進(jìn)行蛋白質(zhì)序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該酶與褐藻膠裂解酶PL-7家族中多個(gè)酶的結(jié)構(gòu)Ⅱ較為相似，下載同源序列，利用MEGA6.0軟件構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 目的蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of the target protein

由圖2可知，褐藻膠裂解酶Alg1987與噬瓊膠菌屬菌株Agarivoranssp.JAM-Alm中的褐藻膠裂解酶BAH70324.1以及白色噬瓊膠菌屬菌株Agarivorans albus中的褐藻膠裂解酶WP 040307007.1和Agarivorans albusMKT 106中的褐藻膠裂解酶GAD01352.1一致性最高，為81%，遠(yuǎn)低于同種酶之間的95%，說(shuō)明Vibriosp.X511 Alg1987可能是一種新型褐藻膠裂解酶。

利用SWISS-MODEL對(duì)褐藻膠裂解酶Alg1987的第29～259個(gè)氨基酸進(jìn)行在線同源建模，得到多個(gè)推薦模型。由圖3可知，與Alg1987同源性最高的模型為2za9.1.A，兩者的相似性?xún)H為23.08%，該模型富的C端富含β折疊，其余部分為α螺旋。

圖3 褐藻膠裂解酶Alg1987的三維結(jié)構(gòu)模擬圖Fig.3 Three-dimensional structure simulation diagram of alginate lyase Alg1987

2.2 基因克隆及表達(dá)載體的構(gòu)建

圖4 瓊脂糖凝膠電⒕結(jié)果Fig.4 Results of agarose gel electrophoresis

以海洋弧菌Vibriosp.X511的總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4a可知，得到的擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度約800bp，采用NCBI將目的基因的序列與測(cè)序結(jié)果進(jìn)行在線比對(duì)，結(jié)果顯示兩者的相似度為100%，說(shuō)明已成功獲得目的基因；由圖4b可知，菌落PCR的凝膠電⒕結(jié)果顯示，多個(gè)大腸桿菌轉(zhuǎn)化子均能擴(kuò)出與目的基因長(zhǎng)度一致的條帶，初步證明目的基因已成功導(dǎo)入受體菌。由圖4c可知，提取菌落PCR驗(yàn)證結(jié)果為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒，用Nde玉和Xho玉雙酶切質(zhì)粒，以空載的pET-30（a）質(zhì)粒為對(duì)照，經(jīng)0.4%瓊脂糖凝膠電⒕后發(fā)現(xiàn)重組質(zhì)粒中含有與目的基因大小一致的片段（圖4c中1號(hào)⒕道），進(jìn)一步說(shuō)明目的基因可能已成功導(dǎo)入了質(zhì)粒中。將質(zhì)粒送至生物公司測(cè)序并比對(duì)，顯示該質(zhì)粒中存在與目的基因相似度為100%的DNA片段，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，-80℃甘油保藏含目的基因的Trans5α克隆載體。

2.3 褐藻膠裂解酶的表達(dá)優(yōu)化

2.3.1 誘導(dǎo)溫度及時(shí)間

分別優(yōu)化重組菌的誘導(dǎo)劑添加量及誘導(dǎo)時(shí)間，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，在誘導(dǎo)時(shí)間4 h以?xún)?nèi)，3組不同的誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌表達(dá)褐藻膠裂解酶幾乎沒(méi)有影響；隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，重組菌在較低誘導(dǎo)溫度下表達(dá)的褐藻膠裂解酶粗酶活性較高；在誘導(dǎo)溫度為16℃時(shí)，重組菌經(jīng)16 h的誘導(dǎo)后，其超聲破碎細(xì)胞液上清中的褐藻膠裂解酶活性達(dá)到最大值，繼續(xù)誘導(dǎo)至24 h，酶活性無(wú)明顯變化；在誘導(dǎo)溫度分別為25℃和37℃條件下誘導(dǎo)8h時(shí)，重組菌的破碎細(xì)胞液中開(kāi)始出現(xiàn)包涵體，且褐藻膠裂解酶粗酶活性明顯較低。故選擇誘導(dǎo)溫度16℃，誘導(dǎo)時(shí)間16 h為誘導(dǎo)條件。

圖5 不同誘導(dǎo)溫度對(duì)重組菌表達(dá)褐藻膠裂解酶的影響Fig.5 Effects of different induction temperatures on the expression of aginate lyase in recombinant bacteria

圖6 不同誘導(dǎo)溫度下的重組菌破碎細(xì)胞液上清Fig.6 Supernatant of recombinant bacteria cytosol at different induction temperatures

分別取16℃、25℃及37℃誘導(dǎo)溫度條件下誘導(dǎo)16 h的重組菌破胞液上清進(jìn)行SDS-PAGE電⒕，結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，重組菌在3個(gè)不同誘導(dǎo)溫度下大量表達(dá)的蛋白質(zhì)分子質(zhì)量大小一致且與預(yù)測(cè)值（約30 kDa）相近，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)樣品1，2，3均有褐藻膠裂解酶活性，而樣品4（空載）無(wú)酶活性，說(shuō)明重組大腸桿菌正確表達(dá)了褐藻膠裂解酶基因alg1987。

2.3.2 誘導(dǎo)劑濃度

將重組菌在IPTG終濃度分別為0、0.2 mmol/L、0.4mmol/L、0.6 mmol/L、0.8 mmol/L、1.0 mmol/L條件下下于16℃誘導(dǎo)16 h，收集菌體，超聲波破碎細(xì)胞，離心后得到的上清液中褐藻膠裂解酶粗酶活性結(jié)果見(jiàn)圖7。由圖7可知，當(dāng)誘導(dǎo)劑濃度介于0～0.2mmol/L時(shí)，不同IPTG濃度下破胞液上清中檢出的粗酶活性較為穩(wěn)定，酶活性較低，約為最高值的45%；隨著IPTG濃度的升高，重組菌的褐藻膠裂解酶活性也呈上升趨勢(shì)，并在濃度為0.8 mmol/L時(shí)達(dá)到最大；當(dāng)IPTG濃度高于0.8 mmol/L時(shí)，酶活性迅速下降，推測(cè)0.8 mmol/L可能為該重組菌耐受的IPTG臨界濃度。

圖7 IPTG濃度對(duì)表達(dá)的影響Fig.7 Effect of IPTG concentration on expression

綜合上述的優(yōu)化結(jié)果，選擇誘導(dǎo)溫度16℃、誘導(dǎo)時(shí)間16 h、誘導(dǎo)劑濃度為0.8 mmol/L為重組菌的表達(dá)褐藻膠裂解酶的最佳誘導(dǎo)條件。

3 結(jié)論

褐藻膠及其寡糖具有很大的應(yīng)用潛力，但目前從自然環(huán)境中篩選到的大多數(shù)產(chǎn)褐藻膠裂解酶菌株的酶活性較低，產(chǎn)物復(fù)雜，分離純化難度大，生產(chǎn)成本高，不利于褐藻膠裂解酶的規(guī)模化應(yīng)用。利用基因工程手段將褐藻膠裂解酶基因?qū)脒z傳背景清晰的工程菌株獲得高產(chǎn)的重組菌，使褐藻膠裂解酶的工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)成為可能。

以本實(shí)驗(yàn)室篩選的海洋弧菌X511的基因組DNA為模板，克隆得到了褐藻膠裂解酶基因alg1987；經(jīng)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)同源比，下載與Alg1987同源性較高的序列，構(gòu)建了進(jìn)化樹(shù)，發(fā)現(xiàn)該酶同源性最高（79%）的蛋白屬于褐藻膠裂解酶PL7家族，推測(cè)Alg1987可能為褐藻膠裂解酶PL7家族中的一個(gè)新型酶；采用生物信息學(xué)工具預(yù)測(cè)褐藻膠裂解酶Alg1987的分子質(zhì)量為30 254.28 Da，等電點(diǎn)8.75，分子式為C1368H2100N364O401S6；選用PET-30（a）為載體構(gòu)建重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，利用IPTG誘導(dǎo)重組菌的表達(dá)，SDSPAGE凝膠電⒕檢測(cè)誘導(dǎo)后重組菌的破碎細(xì)胞液上清，顯示異源表達(dá)的褐藻膠裂解酶Alg1987與預(yù)測(cè)的分子質(zhì)量大小一致。優(yōu)化表達(dá)條件以提高重組菌中褐藻膠裂解酶的表達(dá)效率，得到的最適條件為：誘導(dǎo)溫度16℃，誘導(dǎo)時(shí)間16 h，誘導(dǎo)劑IPTG濃度0.8 mmol/L。本研究為菌株海洋弧菌Vibriosp.X511產(chǎn)褐藻膠裂解酶Alg1987的大量制備及酶學(xué)性質(zhì)研究打下了基礎(chǔ)。

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Conditions optimization of gene cloning and expression of alginate lyase

XU Chao1,2,HUANG Guiyuan1,WANG Qiaozhen1,LU Mingqian1,ZHANG Rongcan3,LIAO Wei4,ZHANG Yunkai2*,HUANG Shushi1
（1.Guangxi Key Laboratory of Marine Natural Products and Combinatorial Biosynthesis Chemistry,Guangxi Academy of Sciences,Nanning 530007,China;2.College of Life Science and Technology,Guangxi University,Nanning 530003,China;3.Guangxi Beibu Gulf Marine Research Centre,Nanning 530007,China;4.Guangxi Vocational and Technical College,Nanning 530226,China）

The alginate lyase gene in marineVibriosp.X511 was expressed byEscherichia colito realize the large-scale preparation of alginate lyase and research enzymatic properties.By analyzing the sequence,the first 20 amino acids of the enzyme were predicted as the signal peptide,the protein molecular mass without the signal peptide was 30 254.28 Da,the isoelectric point was 8.75,the molecular formula was C1368H2100N364O401S6,and the corresponding gene sequence was named asalg1987.The construction program of bacteria recombination was as follows:the specific nucleic acid primers were designed and thealg1987was obtained by PCR;the recombinant plasmid pET-30（a）-alg1987was introduced intoE.coliTrans5α for sequencing;the positive plasmid pET-30（a）-alg1987was extracted and introduced intoE.coliBL21,then expressed by the induce of IPTG.The supernatant of recombinant bacteria cytosol was induced and detected by SDS-PAGE,it was found that the molecular mass of the alginate lyase by heterologous expression was similar to the predicted value.The expression conditions of alginate lyase in recombinant bacteria were optimized.The results showed that optimum parameters were as follows:induction temperature 16℃,time 16 h,induction agent IPTG concentration 0.8 mmol/L.

alginate lyase;gene;cloning;conditions optimization;expression

Q814

0254-5071（2017）12-0120-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.12.025

2017-09-13

國(guó)家自然科學(xué)基金（31560017）；廣西自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目（2014GXNSFDA118012）；廣西科技計(jì)劃重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目（桂科AB16380071）；廣西科技計(jì)劃科技基地和人才專(zhuān)項(xiàng)（桂科AD17129019）

許 超（1991-），男，碩士研究生，研究方向?yàn)楹Ｑ笪⑸铩?/p>

*通訊作者：張?jiān)崎_(kāi)（1972-），男，副研究員，博士，研究方向?yàn)槲⑸锕こ獭?/p>