?龍牙百合鱗莖生長點石蠟切片技術(shù)改良研究?

引用格式：楊林澔，陳淼，李庠，等. 龍牙百合鱗莖生長點石蠟切片技術(shù)改良研究[J]. 湖南農(nóng)業(yè)科學，2024（6）：10-13，20.

DOI：10.16498/j.cnki.hnnykx.2024.006.003

收稿日期：2023-12-13

基金項目：湖南省科學技術(shù)廳種業(yè)創(chuàng)新項目（2021NK1005）；湖南省自然基金項目（2023JJ30292）

作者簡介：楊林澔（1998—），男，山西河津人，碩士研究生，主要從事觀賞園藝研究。

通信作者：李玉帆

摘要：為了準確觀測龍牙百合鱗莖生長點的生長分化過程，以龍牙百合冷藏期間的鱗莖為試驗材料，在傳統(tǒng)石蠟制片法的基礎上，對脫水、透明等步驟進行優(yōu)化并篩選了最佳的甲苯胺藍染色方法。試驗獲得的百合鱗莖生長點石蠟切片制作改良方法為：將百合鱗莖剝開鱗片至可觀察到莖尖生長點，修整為5 mm大小的立方體投入FAA固定液中，保存一周；用85%乙醇（2 h）、95%乙醇（2 h）、100%乙醇（3 h）進行脫水處理，再用二甲苯與乙醇等比例溶液（2 h）、純二甲苯（3 h）進行透明處理；將透明好的材料放入石蠟+二甲苯溶液（體積比2∶3）中，在37 ℃的恒溫箱中浸蠟2 d，期間多次少量加入石蠟；之后在60 ℃

恒溫箱更換純石蠟2次，每次4 h，浸蠟后的材料在60 ℃的操作臺上包埋，再切成厚10 μm的薄片，待蠟片完全伸展，將蠟片粘于均勻涂抹了赫伯特粘片劑的載玻片上，37℃烤片5 h，脫蠟復水后用1%甲苯胺藍染液稀釋150倍染色3 min。

關(guān)鍵詞：龍牙百合；鱗莖生長點；石蠟切片；技術(shù)改良

中圖分類號：S644.1; Q-331 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）06-0010-04

Improvement of Paraffin Sectioning Conditions for the Growing Point of Lilium brownii var. viridulum Baker Bulb

YANG Lin-hao1，2，CHEN Miao1，2，LI Xiang3，MA Jie3，LI Yu-fan1，2

（1. College of Horticulture， Hunan Agricultural University， Changsha 410128， PRC; 2. Hunan Engineering Research Center for the Breeding and Utilization of High-Quality Flowers and Trees in the Mid-Subtropical Zone， Changsha 410128， PRC;

3. Hunan Cotton Science Institute， Changde 415000， PRC）

Abstract： To accurately observe the growth and differentiation process of the growing point of Lilium brownii var. viridulum Baker bulb， this study employed the conventional method to prepare the paraffin sections of the bulbs stored in the refrigerator. The dehydration and transparentizing steps were optimized and the toluidine blue staining method was selected. The conditions for preparing the paraffin sections were improved as follows. First， the scales of a lily bulb were peeled off to expose the growth point， which was then trimmed into a cube of 5 mm × 5 mm × 5 mm. The cube was fixed in FAA solution for one week， dehydrated with 85% ethanol for 2 h， 95% ethanol for 2 h， and 100% ethanol for 3 h， and then transparentized with the mixture of xylene and ethanol （1：1） for 2 h and pure xylene for 3 h. The transparent cube was then immersed in a mixture of paraffin and xylene （volume ratio of 2：3） at 37 °C for 2 days， during which a small amount of paraffin was supplemented multiple times. Afterwards， the mixture medium was replaced with pure paraffin in a thermostat incubator at 60 °C twice， each time for 4 h. After that， the material was embedded at 60 °C. The wax block was sliced into pieces with a thickness of 10 μm. After full extension， each slice was put onto a glass slide evenly coated with Herbert gelatin adhesive， and the slide was then heated at 37 °C for 5 h. After dewaxing and rehydration， the slide was stained with 1% toluidine blue staining solution diluted by 150 times for 3 min.

Key words： Lilium brownii var. viridulum Baker; growing point of bulb; paraffin section; technical improvement

龍牙百合（Lilium brownii var. viridulum Baker）是

百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）的多年生球根草本植物，是我國三大食用百合之一，因鱗片飽滿肥厚，形狀似龍牙而得名[1]。龍牙百合在湖南隆回縣有500多年的栽培歷史，后引入江西萬載，現(xiàn)已成為兩個地方的中國地理標志產(chǎn)品[2]。龍牙百合花型優(yōu)美，氣味清香，有鮮切花、盆花觀賞、或作花境等多種應用方式，具有較高的觀賞價值；龍牙百合還是重要的藥用植物，鱗片含有豐富的生物堿、蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪以及人體所需的各種維生素和微量元素，具有補肺養(yǎng)陰、清心安神、補中益氣的功效。因此，龍牙百合是一種重要的藥、食、觀賞兼用植物，具有重要的經(jīng)濟開發(fā)價值。

百合鱗莖具有自然休眠特性，未解除休眠的鱗莖種植后會出現(xiàn)發(fā)芽率不高和盲花現(xiàn)象，不同品種的鱗莖需要不同程度的低溫處理，才能打破休眠發(fā)芽生長。王家艷等[3]研究報道，不同種類的百合，鱗莖生長點生長分化的時間不同，有的是在冷藏期間發(fā)生，有的是在冷藏打破休眠后在種植期間莖尖開始進行分化[4]。精確掌握百合鱗莖生長點分化的進程對于百合的花期調(diào)控和周年生產(chǎn)非常重要[5]，目前還沒有龍牙百合鱗莖生長點分化時間和進程的研究報道[4]。

石蠟切片是觀察植物花芽分化進程的常見手

段[5-6]，傳統(tǒng)石蠟切片制作方法在百合石蠟切片的制作過程中會出現(xiàn)無法形成完整的蠟帶情況，甚至出現(xiàn)斷裂、碎裂問題，影響后續(xù)觀察。不少研究者針對不同植物材料的石蠟切片制片方法進行了改良研究[7]，取得了較好效果。本研究以龍牙百合為試驗材料，在傳統(tǒng)石蠟切片方法的基礎上，通過對脫水、透明、浸蠟等步驟進行改良，探究適合龍牙百合鱗莖生長點石蠟切片的制作方法和染色方法，以期為進一步研究龍牙百合鱗莖生長點花芽分化進程提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

龍牙百合鱗莖，從湖南隆回一線情農(nóng)業(yè)科技有限公司采購，鱗莖整齊飽滿、無病蟲害、無損傷，消毒后冷藏保存于湖南農(nóng)業(yè)大學園藝學院8 ℃冷庫。

FAA固定液、無水乙醇、二甲苯、固體石蠟、甲苯胺藍染色劑，采購于長沙市博儀生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 固定 按照王原媛等[8]采用的石蠟切片固定與保存方法，隨機取樣大小統(tǒng)一的百合鱗莖，在顯微鏡下使用解剖針剝開鱗片至可觀察到莖尖生長點，將材料修整為5 mm大小的梯形立方體（圖1），加入約為材料體積15～20倍的FAA固定液，4 ℃保存一周以上。

1.2.2 脫水、透明、浸蠟 針對龍牙百合莖尖生長點的特點，以脫水（A）、透明（B）、浸蠟（C）為三

因素，每個因素設3種不同的處理方法（表1、表2、

表3），采用L9（33）正交試驗設計，共組合成處理1

“A1B1C1”、處理2“A1B2C3”、處理3“A1B3C2”、處理

4“A2B1C3”、處理5“A2B2C2”、處理6“A2B3C1”、處理

7“A3B1C2”、處理8“A3B2C1”、處理9“A3B3C3”，各處理按照“脫水→透明→浸蠟”步驟操作。在脫水后，依據(jù)脫水材料放入二甲苯溶液中的變化判斷脫水是否徹底，若溶液渾濁，出現(xiàn)白色沉淀，則脫水不干凈；沒有變渾濁則表示脫水干凈。

1.2.3 包埋、切片 提前打開恒溫臺并融化石蠟，取出1.2.2處理好的樣品進行石蠟包埋，操作時將樣品側(cè)放在金屬模具中并在上方放置包埋盒，隨后緩慢注入石蠟，待包埋盒表層石蠟凝結(jié)，緩慢放入冰水中等待脫模，包埋好的蠟塊放入4℃冰箱中保存。切片前，先將蠟塊邊緣修整齊平，再將蠟塊固定在轉(zhuǎn)輪式切片機上，將蠟塊切為薄片，切片厚度為10 μm；將切好的蠟帶按順序排列，待蠟片完全伸展，將蠟片粘于均勻涂抹了赫伯特粘片劑的載玻片上，將載玻片置于37 ℃的展片臺上烤片5 h。

1.2.4 脫蠟復水 將裝有載玻片的染色架依次進行二甲苯、乙醇浸泡脫蠟至蒸餾水沖洗處理：純二甲苯10 min（2次）→1/2純二甲苯＋1/2無水乙醇10 min→無水乙醇10 min→95%乙醇7 min→85%乙醇7 min→70%乙醇7 min→50%乙醇7 min→30%乙醇7 min→蒸餾水流水沖洗10 min，將載玻片上的石蠟溶洗干凈，并選用完整、連貫的切片進行染色。

1.2.5 染色 脫蠟后的切片選用甲苯胺藍染色液染色：將1%濃度甲苯胺藍染色液用蒸餾水分別稀釋50、100、150倍，選用相同脫水處理1.2.4制成的切片分組染色5 s 、10 s 、30 s、1 min 、3 min 、5min（表4），共得到18組不同染色處理的切片，隨后置于37℃烘箱中烤片，等待觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1 百合莖尖石蠟切片不同脫水時間的效果比較

由圖2可知，A1處理組放入純二甲苯溶液后出現(xiàn)大量白色沉淀（圖2a），A2處理組出現(xiàn)少量白色沉淀（圖2b），A3處理組沒有沉淀（圖2c）。結(jié)果表明，A3脫水處理的材料脫水效果最好。

2.2 百合莖尖石蠟切片的切片效果比較

由表5可知，脫水處理相同，透明和浸染方法不同的三組處理組內(nèi)比較，處理3、處理6、處理9的蠟塊在切片時分別優(yōu)于同一脫水處理組其他2個處理，說明在相同脫水條件下，延長透明時間、浸蠟時間的切片效果更好；處理3、處理6和處理9之間相比較，處理9切出的蠟帶無斷裂卷曲，蠟片無破碎缺失，切片效果最好，說明通過改良脫水、透明、浸蠟方法，制得的石蠟切片在切片過程中蠟帶、蠟片的效果明顯提升。結(jié)果表明，在百合莖尖石蠟切片制作中獲得脫水、透明、浸蠟方法的最佳組合是處理9（A3B3C3）：脫水方法是85%、95%乙醇各1次，每次2 h，100%乙醇2次，每次2 h；透明方法是在石蠟+二甲苯溶液（體積比1∶1）中透明2 h，再在二甲苯中透明2次，每次1.5 h；浸蠟方法是石蠟二甲苯溶液（體積比2∶3）在37 ℃恒溫箱停留2 d，期間多次少量加入石蠟，之后在60℃恒溫箱更換純石蠟2次，每次4 h。

2.3 百合莖尖石蠟切片甲苯胺藍染色的優(yōu)化

由圖3可知，在染液稀釋50倍時，染色時間1、3、5 min時材料呈現(xiàn)深綠色，細胞界限模糊，且切片部分區(qū)域大量染液進入細胞內(nèi)導致區(qū)域顏色變深；染色5、10 s時切片顏色較淺，觀察不清晰；染色30 s較為清晰。染液稀釋100倍時，5、10、30 s時細胞雖然較為清楚，但顏色呈現(xiàn)紫色、較淺，染色不均；染色1 min與3 min的切片效果較為相似，整體呈現(xiàn)深綠色，染色均勻度較好，但橫向比較同一時間梯度下剩余切片可知其穩(wěn)定性一般，個別切片還有組織破碎的現(xiàn)象發(fā)生；染色5 min時著色效果最佳，細胞均呈淡藍色且細胞形態(tài)清晰可見，低倍和高倍鏡下觀察效果均表現(xiàn)良好，所以在稀釋100倍條件下，最適宜的染色時間為5 min。染液稀釋150倍時，染色時間少于3 min的處理染色不均勻，其染色穩(wěn)定性較差；染色時間為3 min時切片色彩對比度高，染色均勻度較好，其穩(wěn)定性也比其他處理組要好；染色5 min組織比較符合預期，但相同染色時間的大量切片對比后，染色5 min組會出現(xiàn)深淺不一的情況，染色穩(wěn)定性較差；綜合比較下，3 min為稀釋150倍甲苯胺藍染液的最優(yōu)染色時間。

將不同染色液稀釋倍數(shù)在最佳染色時間下的石蠟切片照片在顯微鏡下觀察比較，稀釋50倍（圖3A）與100倍（圖3B）的染色液著色較深，染色后細胞邊界與稀釋150倍（圖3C）相比更模糊，圖3C清晰度最優(yōu)，可以觀察到完整的組織。結(jié)果表明，甲苯胺藍染色龍牙百合鱗莖尖石蠟切片最佳的染色處理為1%甲苯胺藍染液稀釋150倍，染色3 min。

3 討論與結(jié)論

材料的脫水是石蠟切片制備中重要的步驟，植物組織中含有大量水分，水和石蠟是不能溶合的，脫水能使組織中的水分完全除去，并使組織變硬，有研究表明脫水時間過久會造成材料硬化，切片時會碎裂[9]。本試驗通過設置不同的乙醇濃度、時間來探究最適的脫水時間，得到最適的脫水方法為85%乙醇、95%乙醇脫水，再替換為100%乙醇脫水，提高了脫水質(zhì)量，也減少了后續(xù)切片中組織破碎的風險，這與康云艷等[10]對黃瓜幼嫩莖段切片制作改良的結(jié)果一致，同時相比傳統(tǒng)石蠟制片法，極大減少了脫水時間[5， 11]。

透明過程中使用的二甲苯具有一定毒性，操作時需要做好防護，透明步驟的時間也要適中，時間太短，酒精無法完全置換干凈，會導致石蠟無法浸入材料，但是透明太久也可能造成組織硬化，影響切片。本試驗將透明方法改良后，相比傳統(tǒng)石蠟制片法[5]進一步縮短了透明時間，方便后續(xù)的實驗操作。但在實際操作時，對于不同種類的植物材料，脫水和透明方法應該根據(jù)實際情況改變[8]。

浸蠟是石蠟制片中另一個重要的環(huán)節(jié)，本試驗的材料為龍牙百合鱗莖莖尖，其特性是質(zhì)地柔軟、較為脆弱，根據(jù)這種特性應選擇熔點為56～58 ℃的純凈石蠟。由于石蠟不易溶于二甲苯，故而需要延長浸蠟時間，另外第一次浸蠟要最好少量多次添加石蠟，并在之后經(jīng)常更換純蠟，以保證石蠟能夠更完全滲透入材料，再與組織之間形成更為緊密的結(jié)合，形成一個整體，提升蠟塊與切片的質(zhì)量，這與李澤華等[12]的研究結(jié)果一致。在浸蠟的同時，要維持恒溫箱內(nèi)的溫度穩(wěn)定，防止出現(xiàn)溫度變化過大的情況。操作時可以考慮將鑷子先預熱，再和材料一同放入恒溫箱內(nèi)操作，避免鑷子插入或取出時，因石蠟的溫度過低而凝固，影響效果[11]。

甲苯胺藍作為較常見人工合成染料其染色效果與蘇木精相類似，在觀察組織結(jié)構(gòu)時，染液過淺或過深會致使染色對比度不高，效果不佳，所以要根據(jù)材料特性配置染色液。在本次試驗中，比較了不同染色液濃度及染色時間對石蠟切片制備效果的影響，結(jié)果表明最佳甲苯胺藍染色體系為將1%濃度的甲苯胺藍染液稀釋150倍，在染缸中染色3 min。另外需留心溶液調(diào)制技巧，如染料現(xiàn)配現(xiàn)用等；染色期間還需特別注意水流清洗速度及操作時間，可以使用較低水流速度沖洗樣品，顯微切片效果更好。

本試驗獲得的百合鱗莖生長點石蠟切片制作改良方法為：將百合鱗莖剝開鱗片至可觀察到莖尖生長點，修整為5 mm大小的立方體投入FAA固定液中，保存一周；使用85%乙醇（2 h）、95%乙醇（2 h）、100%乙醇（3 h）進行脫水處理，再用二甲苯與乙醇等比例溶液（2 h）、純二甲苯（3 h）進行透明處理；將透明好的材料放入石蠟+二甲苯溶液（體積比2∶3）中，在37 ℃的恒溫箱中浸蠟2 d，期間多次少量加入石蠟；之后在60℃恒溫箱更換純石蠟2次，每次4 h，浸蠟后的材料在60 ℃的操作臺上包埋，切成厚10 μm的薄片，待蠟片完全伸展，將蠟片粘于均勻涂抹了赫伯特粘片劑的載玻片上，將載玻片置于37℃的展片臺上烤片5 h，脫蠟復水后用1%甲苯胺藍染液稀釋150倍染色3 min。

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（責任編輯：謝培庚）