異戊二烯對刺參急性毒性及其抗氧化酶和免疫酶活性的影響

羅耀明，李多慧，田甲申，鹿志創(chuàng)，王秀艷，王麗梅，姜大為

異戊二烯對刺參急性毒性及其抗氧化酶和免疫酶活性的影響

羅耀明1、2，李多慧2，田甲申1，鹿志創(chuàng)1，王秀艷2，王麗梅1，姜大為2

(1.遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院，遼寧省海洋生物資源和生態(tài)學(xué)重點實驗室，遼寧大連116023；2.大連市水產(chǎn)研究所，遼寧 大連116085)

為研究有機(jī)污染物對海洋生物的毒性影響，選擇海洋環(huán)境中典型的異戊二烯作為暴露污染物，研究其對體質(zhì)量為 (5.23±0.96)g刺參 Apostichopus japonicus的急性毒性及其體腔液中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶 (CAT)、酸性磷酸酶 (ACP)和堿性磷酸酶 (AKP)活性的影響，并在實驗室條件下，采用靜水式生物毒性試驗法開展了急性毒性試驗，以及96 h亞致死效應(yīng)的毒性試驗。結(jié)果表明:異戊二烯對刺參的24、48、72、96 h半致死質(zhì)量濃度分別為83.00、78.09、72.93、69.77 mg/L，安全質(zhì)量濃度為6.98 mg/L；亞致死試驗中，CAT活性受到的影響最大，表現(xiàn)為受到抑制作用，存在良好的劑量－效應(yīng)和時間－效應(yīng)正相關(guān)性；96 h時，中、低濃度異戊二烯對SOD活性具有顯著的誘導(dǎo)作用 (p＜0.05)，而高濃度異戊二烯對SOD活性具有極顯著的抑制作用 (p＜0.01)；ACP和AKP活性受到的影響較小，但48 h時兩種酶均受到極顯著的誘導(dǎo)作用 (p＜0.01)，96 h時AKP活性受到顯著的誘導(dǎo)作用 (p＜0.05)；隨著異戊二烯質(zhì)量濃度的增加和時間的延長，刺參體腔液中4種酶活性受到不同程度的影響，因此，異戊二烯脅迫對刺參體內(nèi)產(chǎn)生自由基導(dǎo)致氧化脅迫效應(yīng)，以及對消化、能量代謝系統(tǒng)的影響可能是其重要的致毒原因，刺參體腔液中4種酶的變化體現(xiàn)了異戊二烯的致毒機(jī)制。本研究結(jié)果可為異戊二烯對海洋生物的生態(tài)毒理學(xué)方面的研究提供參考依據(jù)。

異戊二烯；刺參；亞致死效應(yīng)；超氧化物歧化酶；過氧化氫酶；酸性磷酸酶；堿性磷酸酶

異戊二烯又名2－甲基－1，3－丁二烯 (2－methyl－1， 3－butadiene， isoprene)， 在常溫下是一種無色、易揮發(fā)的液體，具有刺激性氣味[1]。據(jù)研究資料顯示，秋季黃海和渤海表層海水中異戊二烯相較于大氣中呈現(xiàn)過飽和狀態(tài)，其水平分布呈北高南低的特征[2－3]。海水中的異戊二烯來源于多種途徑，包括浮游植物光合成、細(xì)菌代謝和有機(jī)物光化學(xué)降解等[4－6]，特別是船載化學(xué)品的泄漏、溢油事故和沿海石油化工企業(yè)的廢水排放，直接污染和破壞海洋生態(tài)系統(tǒng)，危害海洋生物，且在短期內(nèi)無法修復(fù)。1990年至今，中國海域發(fā)生的溢油、泄漏污染事故共計60余起[7]，2010年大連 “7.16溢油” 事故[8]和2011年蓬萊 “19－3溢油” 事故[9]中，油污對海洋生物產(chǎn)生了毒害，如棘皮動物、浮游生物、貝類、甲殼類、魚類、海鳥、紅樹林和大型哺乳動物等，并最終通過食物鏈影響到人類健康[10－11]。異戊二烯是常見的石油化工產(chǎn)品，作為危害性較強(qiáng)的有機(jī)污染物之一，在動物組織中發(fā)生反應(yīng)后形成的環(huán)氧化合物可誘變腫瘤[12]。

刺參Apostichopus japonicus屬于棘皮動物，其免疫系統(tǒng)屬于非特異性免疫系統(tǒng)。刺參的真體腔中含有大量半透明的體腔液，在體腔液中含有體腔細(xì)胞，在機(jī)體受到外界刺激時體腔細(xì)胞引起免疫應(yīng)答，并通過細(xì)胞免疫和體液免疫協(xié)同作用，將外源物分解成無害物質(zhì)或直接排出體外[13－14]。超氧化物歧化酶 (Superoxide dismutase，SOD)主要生物功能是催化超氧陰離子自由基歧化為過氧化氫和氧[15]。過氧化氫酶 (Catalase，CAT)是在生物演化過程中建立起來的生物防御系統(tǒng)的關(guān)鍵酶之一，其生物學(xué)功能是催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫分解，防止過氧化[16]。抗氧化防御酶通常是機(jī)體抵御外源污染物毒性作用的第一道屏障，對機(jī)體的氧化和抗氧化平衡起著重要的作用[17]。酸性磷酸酶 (Acid phosphatase，ACP)和堿性磷酸酶 (Alkaline phosphatase，AKP)廣泛存在于動物各組織中，是維持機(jī)體生長代謝和機(jī)體健康，保持體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定所必需的酶，當(dāng)免疫水平降低或提高時，它們會產(chǎn)生相應(yīng)的變化[18－20]，因此，本研究中探討了異戊二烯對刺參體內(nèi)抗氧化酶和免疫酶活性的影響。

目前，國內(nèi)外有關(guān)有機(jī)污染物[21－25]對海洋或水生生物毒理學(xué)方面的報道較多，但涉及異戊二烯對海洋生物毒理學(xué)方面的報道較少[26－27]，而國外有關(guān)異戊二烯的毒理機(jī)制以對嚙齒類動物的研究居多[28－29]。羅耀明等[26]曾開展過異戊二烯對刺參幼參 (1.30 g±0.62 g)的急性毒性試驗，結(jié)果表明，24、48、72、96 h時，半致死濃度分別為70.40、68.28、67.25、66.55 mg/L， 安全濃度為 6.66 mg/L。由于本試驗刺參的規(guī)格與其不同，因此，繼續(xù)開展異戊二烯對刺參的急性毒性試驗具有重要意義。本試驗中，同時還進(jìn)一步研究了異戊二烯對刺參體腔液中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、酸性磷酸酶和堿性磷酸酶活性的影響，以期為異戊二烯對海洋生物的毒性影響研究提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用刺參購自大連金州區(qū)杏樹屯某育苗場，體質(zhì)量為 (5.23±0.96)g，試驗前先置于實驗室暫養(yǎng)1周，每天換水1次，隔1天投餌1次。暫養(yǎng)期間，刺參攝食正常，無病害，無死亡。在試驗開始前一天停止投餌，并選取健康刺參用于試驗。試驗用水經(jīng)沉淀、沙濾，溫度為13～15℃，溶解氧為6.87～7.79 mg/L，鹽度為29.58～30.91，pH為7.5～8.3。

試驗用主要儀器:多功能酶標(biāo)儀 (瑞士Tecan)和CTl5RE型臺式微量高速離心機(jī) (日本Hitachi)。

試驗用主要藥品與試劑:異戊二烯和二甲基亞砜，均為化學(xué)純，購自中國國藥有限公司；超氧化物歧化酶、過氧化氫酶、堿性磷酸酶、酸性磷酸酶和總蛋白等試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 急性毒性試驗 參照 《水生生物檢測手冊》中靜水式毒性試驗法[30]，并根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果，按等差級數(shù)設(shè)定異戊二烯質(zhì)量濃度為64.00、68.00、 72.00、 76.00、 80.00、 84.00 mg/L， 以自然海水為空白對照組，以體積分?jǐn)?shù)0.1%的二甲基亞砜為助溶劑對照組。所有試驗組均設(shè)3個平行，每個10 L玻璃缸中放入20頭刺參，隨時觀察，取出死亡刺參，并記錄各組刺參分別在24、48、72、96 h的死亡量。判斷刺參死亡的標(biāo)準(zhǔn)是對輕微刺激無反應(yīng)，且在正常海水中飼養(yǎng)數(shù)日無存活跡象[26]。

取各試驗組3個平行結(jié)果的平均值計算死亡率， 按公式[31]P＝ (p′－C) /(1－C) 進(jìn)行校正。其中:p′為試驗組魚死亡百分?jǐn)?shù)；C為對照組魚死亡百分?jǐn)?shù)；P為經(jīng)校正后的試驗組魚死亡百分?jǐn)?shù)。參照死亡百分?jǐn)?shù)與概率單位換算表，將校正后的死亡百分?jǐn)?shù)換算成死亡概率單位，建立濃度對數(shù)與死亡概率單位的直線回歸方程，并計算出異戊二烯對刺參24、48、72、96 h的半致死質(zhì)量濃度及95%置信區(qū)間[32]，再用96 h半致死質(zhì)量濃度×0.1計算出安全質(zhì)量濃度。

1.2.2 亞致死毒性試驗 參照姜北[24]對刺參亞致死效應(yīng)的試驗方法，根據(jù)急性毒性試驗的96 h半致死濃度設(shè)定亞致死效應(yīng)試驗，按等比級數(shù)設(shè)置異戊二烯質(zhì)量濃度分別為0.56(低濃度)、2.79(中濃度)、13.95(高濃度)mg/L，以自然海水為空白對照組，每個試驗組設(shè)3個平行。每個10 L玻璃缸中放入30頭刺參，試驗期間不充氣 (經(jīng)測量溶氧量變化不明顯)、不投餌，因異戊二烯具有揮發(fā)性，為避免異戊二烯濃度降低影響試驗結(jié)果，在試驗期間每隔24 h換水1次，保持異戊二烯濃度不變。試驗開始后第24、48、72、96 h進(jìn)行取樣，每次從每缸隨機(jī)選取5頭刺參作為一個樣本。取樣后用0.9%的生理鹽水沖洗刺參體表，用滅菌后的濾紙吸干體表水分，在滅菌的冰培養(yǎng)皿上迅速解剖刺參，同時收集體腔液裝入離心管中，在4℃下以3000 r/min離心20 min后，收集上清液，在冰盤上迅速分裝于1.5 mL凍存管中，最后放入冰箱(－80℃)中冷凍保存待用。

刺參體腔液中超氧化物歧化酶 (SOD)、過氧化氫酶 (CAT)、酸性磷酸酶 (ACP)、堿性磷酸酶 (AKP)和總蛋白等含量的測定方法參照測試盒說明書。

SOD、CAT、ACP、AKP酶活性結(jié)果用比活力來表示，活力單位分別為U/mg、U/mg、U/g和金氏單位/g，即酶活水平/總蛋白含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，用LSD和Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05，極顯著性水平設(shè)為0.01。

2 結(jié)果與分析

圖1 不同濃度的異戊二烯對刺參的致死率Fig.1 Mortality of sea cucumber Apostichopus japonicus exposed to different concentrations of isoprene

2.1 異戊二烯對刺參的急性毒性

試驗中空白和助溶劑對照組均未出現(xiàn)刺參中毒和死亡現(xiàn)象。不同濃度的異戊二烯對刺參的致死率見圖1，刺參中毒特征表現(xiàn)為體表腫脹、口器張開、輕微刺激無反應(yīng)，出現(xiàn)麻痹狀態(tài)，隨著毒性作用時間的延長，口器中吐出乳白色絮狀物，直至死亡。隨著異戊二烯質(zhì)量濃度的升高，刺參死亡率不斷增加，死亡特征更加明顯，存在良好的劑量－效應(yīng)正相關(guān)性。

從表1可見，異戊二烯對刺參的24、48、72、96 h半致死濃度分別為 83.00、78.09、72.93、69.77 mg/L，異戊二烯對刺參的安全濃度為6.98 mg/L。異戊二烯的半致死濃度隨試驗時間的延長而降低，表明其致毒能力隨試驗時間的延長而明顯增強(qiáng)，存在較為明顯的蓄積急性致毒。

表1 異戊二烯對刺參的急性毒性作用Tab.1 Acute toxicity of isoprene to sea cucumber Apostichopus japonicus

2.2 異戊二烯對刺參超氧化物歧化酶活性的影響

不同時間內(nèi)不同濃度的異戊二烯對刺參體腔液中SOD活性的影響見圖2。24 h時，異戊二烯對SOD活性有誘導(dǎo)作用，隨著濃度的升高對其活性影響增大；48 h時，低、高濃度異戊二烯對其活性有極顯著誘導(dǎo)作用 (P＜0.01)，中濃度異戊二烯有極顯著抑制作用 (P＜0.01)；72 h時，各濃度組異戊二烯對其活性影響不顯著 (P＞0.05)；96 h時，低、中濃度異戊二烯對其活性有顯著誘導(dǎo)作用(P＜0.05)，高濃度異戊二烯有極顯著抑制作用(P＜0.01)。這表明，刺參體內(nèi)的SOD活性對異戊二烯的刺激較為敏感，機(jī)體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)受到脅迫后產(chǎn)生了響應(yīng)并對機(jī)體形成保護(hù)，隨著毒性作用時間的延長，高濃度異戊二烯對刺參體內(nèi)的SOD活性抑制作用極其顯著，可能會損傷SOD活性。

2.3 異戊二烯對刺參過氧化氫酶活性的影響

圖2 不同時間內(nèi)不同濃度的異戊二烯對刺參體腔液中SOD活性的影響Fig.2 Effects of different concentrations of isoprene on the activities of SOD in sea cucumber at different time

不同時間內(nèi)不同濃度的異戊二烯對刺參體腔液中CAT活性的影響見圖3。在24、48、72、96 h時，不同濃度的異戊二烯脅迫后對刺參體內(nèi)的CAT活性均有抑制作用，且隨著濃度的加大對其活性的抑制作用增強(qiáng)，存在良好的劑量－效應(yīng)正相關(guān)性，也存在一定的時間－效應(yīng)正相關(guān)性。這表明，刺參體內(nèi)的CAT活性對異戊二烯的刺激非常敏感，在機(jī)體受到異戊二烯脅迫后，體內(nèi)的CAT活性受到抑制，隨著異戊二烯濃度的加大和毒性作用時間的延長，對其活性的抑制作用越顯著，從而對CAT活性的損傷越大。

圖3 不同時間內(nèi)不同濃度的異戊二烯對刺參體腔液中CAT活性的影響Fig.3 Effects of different concentrations of isoprene on the activities of CAT in coelomic fluid of sea cucumber at different time

2.4 異戊二烯對刺參酸性磷酸酶活性的影響

不同時間內(nèi)不同濃度的異戊二烯對刺參體腔液中ACP活性的影響見圖4。在24、72、96 h時，異戊二烯對刺參體內(nèi)的ACP活性有一定的誘導(dǎo)和抑制作用，但作用不顯著 (P＞0.05)；48 h時，異戊二烯對ACP活性有誘導(dǎo)作用，其中，低、高濃度異戊二烯的誘導(dǎo)作用極顯著 (P＜0.01)。這表明，刺參體內(nèi)的ACP活性對異戊二烯的刺激不太敏感，在機(jī)體受到異戊二烯脅迫后，ACP活性受到的影響不大。

圖4 不同時間內(nèi)不同濃度的異戊二烯對刺參體腔液中ACP活性的影響Fig.4 Effects of different concentrations of isoprene on the activities of ACP in coelomic fluid of sea cucumber at different time

2.5 異戊二烯對刺參堿性磷酸酶活性的影響

不同時間內(nèi)不同濃度的異戊二烯對刺參體腔液中AKP活性的影響見圖5。在24、48、72、96 h時，不同濃度的異戊二烯對刺參體內(nèi)的AKP活性具有一定的誘導(dǎo)作用，其中48、96 h內(nèi)出現(xiàn)了顯著的誘導(dǎo)作用。這表明，刺參體內(nèi)的AKP活性對異戊二烯的刺激敏感度一般，在機(jī)體受到異戊二烯脅迫后，AKP活性受到一定的誘導(dǎo)，進(jìn)而產(chǎn)生相應(yīng)的變化并保護(hù)刺參機(jī)體免受傷害。

圖5 不同時間內(nèi)不同濃度的異戊二烯對刺參體腔液中AKP活性的影響Fig.5 Effects of different concentrations of isoprene on the activities of AKP in coelomic fluid of sea cucumber at different time

3 討論

3.1 異戊二烯對刺參的急性毒性

異戊二烯對刺參的急性毒性作用存在良好的劑量－效應(yīng)正相關(guān)性，這與羅耀明等[26]的研究結(jié)論相似。研究發(fā)現(xiàn)，有機(jī)污染物的生物毒性作用主要與受體的結(jié)合能力和生物的累積特性有關(guān)[33]，當(dāng)有機(jī)污染物的正辛醇－水分配系數(shù)＜5時，水生生物通過富集作用引起中毒，但不會延食物鏈放大毒性[34]。本研究中異戊二烯的正辛醇－水分配系數(shù)為2.42，說明毒性不會通過食物鏈進(jìn)行放大。

3.2 異戊二烯對刺參體腔液中抗氧化酶和免疫酶的影響

本試驗中，刺參在異戊二烯脅迫下，其體腔液中的4種酶活性受到不同程度的影響，異戊二烯對CAT活性有顯著的抑制作用，損傷最大，影響最強(qiáng)，對SOD活性的影響次之，對ACP和AKP活性的影響較小。SOD活性在異戊二烯濃度較低和暴露時間較短時會產(chǎn)生一定的應(yīng)激反應(yīng)，機(jī)體產(chǎn)生的這種應(yīng)激反應(yīng)即為興奮作用，這與Monferran等[35]的研究結(jié)論及姜北[24]的苯脅迫試驗結(jié)果相似，然而在48 h卻出現(xiàn)了中濃度異戊二烯對SOD活性極顯著的抑制作用，可能是由于刺參個體間差異性導(dǎo)致的結(jié)果。但當(dāng)機(jī)體受到有機(jī)污染物脅迫時，體內(nèi)的抗氧化酶活性會隨有機(jī)污染物濃度和暴露時間的不同而有所差異[36－38]，本試驗中，隨著毒性時間的延長，在96 h時高濃度異戊二烯對SOD活性有極顯著的抑制作用，而中、低濃度異戊二烯對SOD活性有顯著的誘導(dǎo)作用，這說明適宜濃度的異戊二烯對刺參造成的損傷可以減輕，同時還能誘導(dǎo)刺參的免疫水平，從而提高機(jī)體的免疫防御能力。異戊二烯對刺參體腔液中CAT活性表現(xiàn)為抑制作用，存在良好的劑量－效應(yīng)和時間－效應(yīng)正相關(guān)性，表明異戊二烯對刺參具有氧化脅迫作用，可能造成機(jī)體的氧化損傷，這與苯系物對刺參CAT活性的影響結(jié)果較為相似[23]。ACP是吞噬溶酶體的重要組成部分，在細(xì)胞吞噬和包囊反應(yīng)中釋放ACP，參與對帶磷酸酯基團(tuán)異物的降解過程[39]。本試驗中，異戊二烯對ACP活性的抑制作用不顯著，在48 h時出現(xiàn)了極顯著誘導(dǎo)作用，表明刺參受到異戊二烯脅迫后提高了自身的非特異性免疫能力。AKP能夠促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和吸收，從而間接地加強(qiáng)了機(jī)體的非特異性免疫能力[40]。本試驗中，異戊二烯對AKP活性主要表現(xiàn)為誘導(dǎo)作用，這與田麗粉等[25]研究的勝利原油對褐牙鲆幼魚堿性磷酸酶的影響結(jié)論較為相似?？傊?，異戊二烯對刺參體腔液中ACP活性和AKP活性影響較小，這表明ACP和AKP對3種濃度的異戊二烯在一定時間內(nèi)具有一定的承受能力，也可能是對異戊二烯脅迫的生理應(yīng)答反應(yīng)不明顯。但是，本試驗中ACP在48 h時有濃度組受到顯著的誘導(dǎo)作用，AKP在48 h和96 h時有濃度組受到顯著的誘導(dǎo)作用，說明毒性作用時間延長可能會導(dǎo)致機(jī)體損傷。

異戊二烯脅迫對刺參體內(nèi)產(chǎn)生自由基并導(dǎo)致氧化脅迫以及消化代謝等影響，可能是異戊二烯重要的致毒機(jī)制，因此，刺參體腔液中 SOD、CAT、ACP、AKP 4種酶活性受到不同程度的影響，可能會造成機(jī)體損傷導(dǎo)致中毒，甚至死亡。

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Acute toxicity and effects of isoprene on activities of antioxidant and immune enzymes in sea cucumber Apostichopus japonicus

LUO Yao－ming1，2， LI Duo－h(huán)ui2， TIAN Jia－shen1， LU Zhi－chuang1，WANG Xiu－yan2， WANG Li－mei1， JIANG Da－wei2
(1.Key Laboratory of Marine Biological Resources and Ecology， Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute， Dalian 116023， China；2.Dalian Fisheries Research Institute， Dalian 116085， China)

Acute toxicity of isoprene， a common toxic pollutant in marine environment， to sea cucumber Apostichopus japonicas with body weight of(5.23±0.96)g was studied in a laboratory by static bioassay and effects of isoprene on activities of superoxide dismutase(SOD)，catalase(CAT)，acid phosphatase(ACP)and alkaline phosphatase(AKP)were investigated in coelomic fluid of sea cucumber.The results showed that the median lethal concentration(LC50)of isoprene to sea cucumber was 83.00 mg/L in 24 h， 78.09 mg/L in 48 h， 72.93 mg/L in 72 h， and 69.77 mg/L in 96 h， with safe concentration of 6.98 mg/L.In sublethal effect test， the activities of CAT were the most sensitive and inhibited in isoprene treatment groups， with good time－dose dependent effect， and the activities of SOD were induced in the medium and low concentration of isoprene treatment groups and inhibited very significantly in the high concentration treatment groups at 96 h(p＜0.01).The activities of ACP and AKP were less sensitive to isoprene， and significantly induced at 48 h(p＜0.01)， and the activities of AKP were significantly induced at 96 h(p＜0.05).The activities of four enzymes in the coelomic fluid of sea cucumber were affected by isoprene with the increase in isoprene concentrations and time prolonged，indicating that the toxic mechanisms of isoprene is involved in generated free radicals，oxidative stress and the effects on digestive and metabolic systems in sea cucumber.The findings may provide the reference on ecological toxicology of isoprene to marine organisms.

isoprene； Apostichopus japonicus； sublethal effect； superoxide dismutase(SOD)； catalase(CAT)；acid phosphatase(ACP)；alkaline phosphatase(AKP)

Q954.4

A

10.16535/j.cnki.dlhyxb.2017.06.008

2095－1388(2017)06－0682－06

2017－03－28

遼寧省海洋與漁業(yè)廳科研項目 (201417)

羅耀明 (1982—)，男，工程師。E－mail:lym1982＠126.com

王麗梅 (1964—)，女，研究員。E－mail:meizi4678＠sina.com