標(biāo)本溶血對(duì)常規(guī)凝血試驗(yàn)和纖溶標(biāo)志物測(cè)定結(jié)果的影響

聶 群,董 晶,聶李平,周 宇,謝聞悅,李建新*

(1.深圳市大鵬新區(qū)婦幼保健院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳518120；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳518036)

標(biāo)本溶血對(duì)常規(guī)凝血試驗(yàn)和纖溶標(biāo)志物測(cè)定結(jié)果的影響

聶 群1,董 晶2,聶李平2,周 宇2,謝聞悅2,李建新2*

(1.深圳市大鵬新區(qū)婦幼保健院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳518120；2.北京大學(xué)深圳醫(yī)院 檢驗(yàn)科，廣東 深圳518036)

目的探討標(biāo)本溶血對(duì)常規(guī)凝血試驗(yàn)(包括PT、APTT和Fbg)和纖溶標(biāo)志物(包括D-dimer和FDP)測(cè)定結(jié)果的影響。方法對(duì)48例溶血標(biāo)本和2 h內(nèi)(平均65 min)重新采集的未溶血配對(duì)標(biāo)本分別進(jìn)行常規(guī)凝血試驗(yàn)和纖溶標(biāo)志物測(cè)定；另對(duì)30例未溶血標(biāo)本體外機(jī)械誘導(dǎo)溶血，分別于溶血前后進(jìn)行常規(guī)凝血試驗(yàn)和纖溶標(biāo)志物測(cè)定。結(jié)果對(duì)于臨床溶血和未溶血配對(duì)標(biāo)本，PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP在兩者間均無(wú)顯著性差異；對(duì)于誘導(dǎo)溶血標(biāo)本，誘導(dǎo)溶血前后PT、APTT、Fbg和FDP均無(wú)顯著性差異；誘導(dǎo)溶血后較溶血前D-dimer降低(361.10±493.40 VS 396.37±494.47 μg/L，P< 0.001)。以上參數(shù)結(jié)果在溶血和未溶血標(biāo)本之間，Pearson相關(guān)分析均呈高度相關(guān)(r均>0.97，P均<0.001)，Bland-Altman圖均顯示一致性良好。以上參數(shù)改變值和溶血程度均不相關(guān)(P均>0.05)。結(jié)論標(biāo)本溶血對(duì)常規(guī)凝血試驗(yàn)和FDP的測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響，體外機(jī)械誘導(dǎo)溶血對(duì)D-dimer測(cè)定結(jié)果造成較小的負(fù)性影響，但不影響臨床決定。應(yīng)對(duì)拒收溶血標(biāo)本用于常規(guī)凝血測(cè)試的規(guī)定進(jìn)行再評(píng)估。

溶血；常規(guī)凝血試驗(yàn)；D-dimer；FDP

(ChinJLabDiagn,2017,21:2115)

常規(guī)凝血試驗(yàn)[包括凝血酶原時(shí)間(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time,APTT)和纖維蛋白原(fibrinogen,Fbg)]是臨床血凝實(shí)驗(yàn)室執(zhí)行得最多的測(cè)試，廣泛用于篩選檢測(cè)遺傳性和獲得性凝血缺陷、抗凝和溶栓治療監(jiān)測(cè)、術(shù)前患者止凝血功能評(píng)估、彌散性血管內(nèi)凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)的篩選診斷、凝血抑制物篩選、靜脈血栓篩查等[1，2]。纖溶標(biāo)志物D-二聚體(D-dimer)和纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(fibrin/fibrinogen degradation products,FDP)也是臨床頻繁地申請(qǐng)的止血檢測(cè)項(xiàng)目，在輔助排除診斷靜脈血栓形成(venous thromboembolism,VTE)、判斷VTE再發(fā)風(fēng)險(xiǎn)、評(píng)估抗凝治療持續(xù)時(shí)間、DIC的診斷和管理方面具有非常重要的意義[3，4]。FDP和D-dimer聯(lián)合檢測(cè)還可以鑒別診斷原發(fā)性纖溶和繼發(fā)性纖溶[5]。

凝血試驗(yàn)易被一些分析前技術(shù)變量影響，如采血裝置、標(biāo)本收集管、標(biāo)本運(yùn)送和儲(chǔ)存條件等等[6，7]。在送達(dá)臨床實(shí)驗(yàn)室的凝血試驗(yàn)標(biāo)本中，溶血是較常見(jiàn)現(xiàn)象[7]。溶血可能導(dǎo)致凝血因子活化和干擾測(cè)量終點(diǎn)判讀，因此，美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究院(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)H21-A4指南規(guī)定，對(duì)于常規(guī)凝血試驗(yàn)如PT和APTT，應(yīng)拒收肉眼可見(jiàn)的溶血標(biāo)本[6]。Laga AC等[7]報(bào)道，標(biāo)本溶血雖然影響PT和APTT測(cè)試結(jié)果，但影響程度較輕，似乎對(duì)臨床決定無(wú)重要意義。但Lippi等[8]根據(jù)他們以凍融法誘導(dǎo)溶血的實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)為，僅輕微溶血標(biāo)本可供凝血測(cè)試，中度以上的溶血標(biāo)本會(huì)影響常規(guī)凝血試驗(yàn)結(jié)果的可信度?；谶@些，在CLSI新的H21-A5指南[9]中，無(wú)明確規(guī)定應(yīng)拒收溶血標(biāo)本用于常規(guī)凝血試驗(yàn)。

關(guān)于標(biāo)本溶血對(duì)纖溶分子標(biāo)志物D-dimer和FDP測(cè)定的影響，相關(guān)報(bào)道較少。本文從兩個(gè)方面前瞻性研究標(biāo)本溶血對(duì)常規(guī)凝血試驗(yàn)和纖溶標(biāo)志物測(cè)定結(jié)果的影響：首先研究臨床送檢的溶血的凝血測(cè)試標(biāo)本和2小時(shí)內(nèi)重新采集的非溶血配對(duì)標(biāo)本的常規(guī)凝血試驗(yàn)和纖溶標(biāo)志物測(cè)定結(jié)果差異，再研究標(biāo)本在機(jī)械誘導(dǎo)溶血前后的常規(guī)凝血試驗(yàn)和纖溶標(biāo)志物測(cè)定結(jié)果差異。

1 材料與方法

1.1 臨床溶血標(biāo)本

患者靜脈血采集于2 ml 109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝真空管(廣州陽(yáng)普公司)，血液與抗凝劑的比例為9∶1。溶血定義為標(biāo)本經(jīng)2 500×g離心15 min后，血漿以裸眼觀察呈粉紅色到紅色。接收到溶血標(biāo)本后，立即通知臨床重新采集非溶血標(biāo)本送檢。時(shí)間間隔在2 h內(nèi)的溶血和非溶血配對(duì)標(biāo)本才納入本研究。常規(guī)凝血試驗(yàn)在標(biāo)本接收后2 h內(nèi)以Sysmex CA 1500和Stago Compact血凝儀完成測(cè)試，每對(duì)溶血和非溶血配對(duì)標(biāo)本只在一臺(tái)血凝儀上測(cè)試。Sysmex CA 1500血凝儀常規(guī)凝血試驗(yàn)所用試劑由德國(guó)Siemens公司提供，PT試劑為T(mén)hromborel-S，APTT試劑為Actin和0.025 mol/L氯化鈣，F(xiàn)bg試劑為T(mén)hrombin Reagent (100NIH)。Stago Compact血凝儀采用其配套試劑，PT試劑為STA○RNeoplastine○RCI Plus 10，APTT試劑為STA○RPTT Automate 5，F(xiàn)bg試劑為STA Fibrinogen 5。D-dimer和FDP測(cè)定也在標(biāo)本接收后2 h內(nèi)完成，所用儀器為Sysmex CA 1500。D-dimer測(cè)定采用Siemens公司的D-dimer Assay PLUS試劑，該試劑采用D-dimer單克隆抗體，特異性強(qiáng)，不受纖維蛋白原和其他纖維蛋白降解產(chǎn)物的影響；采用乳膠增強(qiáng)型免疫比濁法進(jìn)行檢測(cè)，最低檢測(cè)限值為50 μg/L，檢測(cè)線性范圍為50-9999 μg/L，CV < 5%。FDP測(cè)定也采用乳膠增強(qiáng)型免疫比濁法試劑，生產(chǎn)廠家為日本第一化學(xué)株式會(huì)社。

1.2 體外機(jī)械誘導(dǎo)溶血標(biāo)本

隨機(jī)收集未溶血凝血測(cè)試標(biāo)本30例，先作常規(guī)凝血試驗(yàn)、D-dimer和FDP測(cè)試，再蓋上蓋子，在混旋器上強(qiáng)力混旋30 min，人為機(jī)械劇烈震蕩誘導(dǎo)標(biāo)本溶血，2 500 × g離心15min后再作常規(guī)凝血試驗(yàn)、D-dimer和FDP測(cè)試。所有測(cè)試在3 h內(nèi)完成。

1.3 血漿游離血紅蛋白(free hemoglobin,fHgb)測(cè)定

采用鄰-甲聯(lián)苯胺法，按操作規(guī)程[10]測(cè)定。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 臨床溶血標(biāo)本

一共48對(duì)溶血和非溶血配對(duì)標(biāo)本納入研究。34對(duì)標(biāo)本來(lái)自ICU，4對(duì)來(lái)自CCU，其它來(lái)自產(chǎn)科、神經(jīng)內(nèi)科、內(nèi)分泌科、神經(jīng)外科、消化內(nèi)科等。溶血和非溶血配對(duì)標(biāo)本的采集時(shí)間間隔平均為65 min。32對(duì)標(biāo)本的常規(guī)凝血試驗(yàn)在Stago Compact血凝儀上完成，另外16對(duì)標(biāo)本在Sysmex CA 1500血凝儀上完成。溶血標(biāo)本的血漿fHgb為2.01±1.37 g/L，覆蓋了臨床常見(jiàn)標(biāo)本溶血的血漿fHgb范圍。

溶血和未溶血配對(duì)標(biāo)本的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP結(jié)果均無(wú)顯著性差異(P均>0.05，表1)，且均呈高度相關(guān)(r均>0.97，P均<0.001)。Bland-Altman圖顯示，溶血和未溶血配對(duì)標(biāo)本的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP結(jié)果差值均較小，大于95%的差值位于一致性界限內(nèi)，也即溶血和未溶血配對(duì)標(biāo)本的結(jié)果一致性良好。PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP改變值與fHgb不相關(guān)，r分別為-0.176、-0.032、0.131、0.030和-0.160，P分別為0.232、0.829、0.375、0.840和0.277。

表1 溶血和重采未溶血配對(duì)標(biāo)本的常規(guī)凝血試驗(yàn)和纖溶標(biāo)志物結(jié)果

2.2 體外機(jī)械誘導(dǎo)溶血標(biāo)本

14對(duì)標(biāo)本的常規(guī)凝血試驗(yàn)在Stago Compact血凝儀上完成，另外16對(duì)標(biāo)本在Sysmex CA 1500血凝儀上完成。誘導(dǎo)溶血標(biāo)本的血漿fHgb為1.71±1.29 g/L。

誘導(dǎo)溶血前后的PT、APTT、Fbg和FDP結(jié)果均無(wú)顯著性差異(P均>0.05)，但誘導(dǎo)溶血后較溶血前D-dimer降低(P< 0.001)(表2)，溶血前后的結(jié)果均呈高度相關(guān)(r均>0.98，P均<0.001)。Bland-Altman圖顯示，誘導(dǎo)溶血前后的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP結(jié)果差值均較小，大于95%的差值位于一致性界限內(nèi)，也即誘導(dǎo)溶血前后的結(jié)果一致。PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP的結(jié)果差值與fHgb不相關(guān)，r分別為0.068、-0.084、0.108、0.010和-0.160，P 分別為0.722、0.657、0.5705、0.398和0.958。

表2 體外機(jī)械誘導(dǎo)溶血前后的的常規(guī)凝血試驗(yàn)和纖溶標(biāo)志物結(jié)果

3 討論

標(biāo)本溶血往往是因?yàn)椴杉?、運(yùn)輸過(guò)程中方法不當(dāng)引起的。針頭過(guò)細(xì)、抽入氣泡、止血帶扎的時(shí)間過(guò)長(zhǎng)以及運(yùn)輸過(guò)程中的不當(dāng)?shù)仍蚨伎稍斐蓸?biāo)本溶血。標(biāo)本溶血是較常見(jiàn)現(xiàn)象，約占送達(dá)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)本的3%左右[7,11]，約占標(biāo)本不合格原因的40%-70%[11]。標(biāo)本體外溶血通過(guò)一系列機(jī)制影響臨床化學(xué)測(cè)試結(jié)果[11]。標(biāo)本溶血導(dǎo)致帶負(fù)電荷的紅細(xì)胞膜磷脂暴露，可能會(huì)加速凝血激活，或者與凝血活酶試劑競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合因子VII而減慢凝血過(guò)程；另一方面，標(biāo)本溶血會(huì)干擾凝血儀對(duì)反應(yīng)終點(diǎn)的測(cè)量，從而影響凝血試驗(yàn)測(cè)試結(jié)果[6,7]。

Laga AC等[7]的結(jié)果表明，溶血標(biāo)本所釋放的基本上為游離形式，而非結(jié)合于微囊形式的血紅蛋白，對(duì)凝血系統(tǒng)的活化作用有限；標(biāo)本溶血可導(dǎo)致外源凝血途徑活化輕度增高(FVIIa和F1+2水平輕度增高)，使臨床溶血標(biāo)本和機(jī)械誘導(dǎo)溶血標(biāo)本的PT和APTT測(cè)試結(jié)果縮短，但影響程度較輕，對(duì)臨床決定似乎無(wú)重要意義。Tang N等[12]報(bào)道，雖然機(jī)械誘導(dǎo)的溶血會(huì)干擾血栓彈力圖的測(cè)定，但對(duì)常規(guī)凝血試驗(yàn)(PT、APTT和Fbg)的結(jié)果影響甚微，偏差低于美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室修正法案的允許范圍。D'Angelo G等[13]也報(bào)道，即使嚴(yán)重溶血，對(duì)PT和APTT的測(cè)定影響很小，但導(dǎo)致Fbg的降低和D-dimer增高，這可能與他們制備溶血液時(shí)間過(guò)長(zhǎng)以及采用凍融程序?qū)е履せ钣嘘P(guān)。

Lippi G等[14]和La'ulu SL等[15]報(bào)道，機(jī)械誘導(dǎo)的溶血對(duì)D-dimer測(cè)定造成較小的負(fù)性影響。Lippi G等[14]認(rèn)為，大多數(shù)輕度溶血樣本的D-dimer測(cè)定結(jié)果可以發(fā)向臨床。

我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，臨床溶血和重采未溶血配對(duì)標(biāo)本的PT、APTT、Fbg、D-dimer和FDP結(jié)果均無(wú)顯著性差異，且均呈高度相關(guān)，Bland-Altman圖顯示以上指標(biāo)的結(jié)果差值均較小，也即兩者間的結(jié)果一致性良好；體外機(jī)械誘導(dǎo)溶血與臨床溶血標(biāo)本的結(jié)果類(lèi)似，雖然對(duì)D-dimer測(cè)定造成較輕的負(fù)性影響(約降低10%)，但誘導(dǎo)溶血前后D-dimer結(jié)果高度相關(guān)，Bland-Altman圖顯示結(jié)果一致。這可能與機(jī)械誘導(dǎo)溶血對(duì)凝血系統(tǒng)的活化作用較弱[7]，以及溶血干擾比色法吸光度測(cè)定有關(guān)。同時(shí)也說(shuō)明體外運(yùn)輸?shù)葯C(jī)械因素導(dǎo)致的標(biāo)本溶血對(duì)常規(guī)凝血試驗(yàn)、D-dimer和FDP的測(cè)定結(jié)果影響有限，不影響臨床決定。

由于標(biāo)本溶血是臨床實(shí)驗(yàn)室的較常見(jiàn)現(xiàn)象，對(duì)溶血標(biāo)本重新采集需耗費(fèi)大量的人力、物力以及時(shí)間成本?；跇?biāo)本溶血對(duì)常規(guī)凝血試驗(yàn)、D-dimer和FDP的測(cè)定結(jié)果影響有限，應(yīng)對(duì)拒收溶血標(biāo)本用于常規(guī)凝血測(cè)試的規(guī)定進(jìn)行再評(píng)估。

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Theeffectofspecimenhemolysisonroutinecoagulationtestandfibrinolyticmarkerresults

NIEQun,DONGJing,NIELi-ping,etal.

(DepartmentofClinicalLaboratory,DapengNewDistrictMaternalandChildrenHealthHospital,Shenzhen518120,China)

ObjectiveTo evaluate the effect of specimen hemolysis on routine coagulation test (including PT,APTT and Fbg) and fibrinolytic marker (including D-dimer and FDP) results.MethodsRoutine coagulation test and fibrinolytic marker were executed for 48 consecutive hemolyzed patient samples and paired re-collected (within 2 hours) nonhemolyzed specimens,and for randomly collected 30 nonhemolyzed specimens before and after mechanically induced hemolysis.ResultsIn 48 paired patients,there were no statistically significant differences in PT,APTT,Fbg,D-dimer and FDP results between hemolyzed and nonhemolyzed specimens,respectively.In 30 randomly collected specimens,significant differences were not seen in PT,APTT,Fbg and FDP values before and after induced hemolysis.Dimer decreased (361.10±493.40 vs 396.37±494.47 μg/L,P<0.001) after induced hemolysis.Pearson correlation analysis showed high correlation (allr>0.97,P<0.001),and Bland-Altman plot exhibited good agreement,in results of above-mentioned tests between hemolyzed and nonhemolyzed specimens.Differences in the results of above tests were not correlated with the degree of hemolysis (allP>0.05).ConclusionThere was no significant effect of specimens hemolysis on the results of routine coagulation test and FDP.Minor negative effect on D-dimer determination was seen in mechanically induced hemolyzed specimens in vitro,which is unlikely to be considered clinically meaningful.A policy of rejecting hemolyzed specimens for coagulation tests should be reevaluated.

hemolysis;routine coagulation test;D-dimer;FDP

深圳市科技創(chuàng)新委基礎(chǔ)研究資助項(xiàng)目(JCYJ20150403091443282)

*通訊作者

1007-4287(2017)12-2115-04

R331.1

A

2017-06-15)