縮骨鯽(Carassius auratus sogu var.)MC4R克隆、組織分布以及與生長相關(guān)SNPs的篩選*

楊 揚(yáng) 周惠強(qiáng) 舒 琥① 藍(lán)昭軍 李 強(qiáng) 谷平華

(1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510006; 2.韶關(guān)市水產(chǎn)研究所 韶關(guān) 512006)

縮骨鯽(Carassius auratussogu var.)MC4R克隆、組織分布以及與生長相關(guān)SNPs的篩選*

楊 揚(yáng)1周惠強(qiáng)1舒 琥1①藍(lán)昭軍2李 強(qiáng)1谷平華2

(1.廣州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 廣州 510006; 2.韶關(guān)市水產(chǎn)研究所 韶關(guān) 512006)

黑色素皮質(zhì)素受體-4 (Melanocortin reporter-4, MC4R)是G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員, 在能量調(diào)控中發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)采用同源克隆以及染色體步移對縮骨鯽(Carassius auratussogu var.)MC4R基因進(jìn)行克隆, 對其核苷酸序列和推測的氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析, 通過Real-time PCR對其mRNA組織分布進(jìn)行研究, 并對縮骨鯽MC4R編碼區(qū)潛在的與生長相關(guān)的SNPs進(jìn)行篩選。本實(shí)驗(yàn)克隆MC4R基因組基因長度為2854bp, 只包含一個(gè)外顯子, 長度為981bp, 共編碼326個(gè)氨基酸, MC4R共有七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu), 是較為穩(wěn)定的疏水蛋白。縮骨鯽MC4R與鯽魚的MC4R氨基酸序列的同源度最高達(dá)到 99.3%, 與 MC3R和 MC5R同源度相對其他 MCRs成員較高?？s骨鯽MC4R mRNA在腦中表達(dá)量最為顯著, 眼中次之, 肌肉, 卵巢和腎臟中表達(dá)較少, 在鰓、腸、心臟和肝胰腺中微量表達(dá)。在MC4R的CDs區(qū)內(nèi)檢測到6個(gè)與生長潛在相關(guān)的SNPs: 兩個(gè)錯(cuò)義突變(A199G和A881C), 4個(gè)同義突變(A123G, C231T, A444G和C480T)。本實(shí)驗(yàn)可為縮骨鯽生長和發(fā)育的分子機(jī)制研究以及遺傳育種提供基礎(chǔ)資料。

黑色素皮質(zhì)素受體-4 (MC4R); 縮骨鯽; 克隆; 組織分布; 單核苷酸多態(tài)

黑色素皮質(zhì)素受體-4 (melanocortin reporter-4,MC4R)屬于黑色素皮質(zhì)激素受體(melanocortin reporters)家族, 是G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員, 具有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu), 為典型的視紫紅質(zhì)受體蛋白(Jangpraiet al, 2011)。黑色素皮質(zhì)素受體與其配體—阿黑皮素原 (POMC)的衍生物所組成的黑色素皮質(zhì)素系統(tǒng)在生物體代謝調(diào)控和能量平衡中扮演著重要的角色(Ellacottet al, 2004)。MC4R是該系統(tǒng)中的重要組成部分, 其功能十分廣泛, 與能量代謝(Ellacottet al,2004)、食物攝入(Bertileet al, 2006)、性行為(Van der Ploeget al, 2002)以及疼痛感觸(Vrintenet al, 2000)均有關(guān)聯(lián)。MC4R可接受多種受體, 它可以受到α-MSH的激活, 促使生物體加快代謝, 抑制進(jìn)食, 抑制體重增長; 也可以受到刺鼠蛋白(agouti), 刺鼠相關(guān)蛋白(AGRP)以及神經(jīng)肽 Y (NPY)的抑制, 抑制生物體代謝, 促進(jìn)生物體覓食, 減緩體重降低(左北瑤等,2011)。在人類中, MC4R的突變可以引起肥胖癥(Vaisseet al, 1998)。有統(tǒng)計(jì)顯示, 有4%的肥胖患者都是由于MC4R基因突變引起的(Froguelet al, 2001)。在小鼠中敲除該基因, 小鼠表現(xiàn)出多食、肥胖、胰島素分泌過多等癥狀(Huszaret al, 1997)。由于MC4R在能量調(diào)控中發(fā)揮的重要作用, 在疾病治療和農(nóng)業(yè)方面, MC4R受到越來越多的關(guān)注。

MC4R作為一種腦神經(jīng)受體主要分布于腦中, 在其他組織內(nèi)也有著不同程度的分布。MC4R的組織表達(dá)在哺乳動(dòng)物和家禽有著較多的研究。Mountjoy等(1994)通過原位雜交技術(shù)對大鼠腦內(nèi)MC4R的表達(dá)進(jìn)行檢測, 結(jié)果顯示MC4R在皮質(zhì)、丘腦、下丘腦、腦干和脊髓內(nèi)均有表達(dá)。王婕等(2011)對鴨的MC4R基因的組織表達(dá)差異進(jìn)行了分析, 結(jié)果顯示, 肌肉、脂肪、心臟、腎臟、脾臟和腦中均有不同程度的表達(dá)。在魚類中, MC4R 的組織表達(dá)在齊口裂腹魚(Schizothorax prenati, Weiet al, 2013), 金魚(C.auratusvar., Cerdá-Reverteret al, 2003), 虹 鱒(Oncorhynchus mykiss, Haitinaet al, 2004)和蛇皮魚(Snakeskin gourami, Jangpraiet al, 2011)等魚中有所研究, 均在腦中有著較高的表達(dá)。

單核苷酸多態(tài)(single nucleotide polymorphisms,SNPs)是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性(Lander, 1996)。SNPs分布極為廣泛, 平均每1000bp的基因就含有一個(gè)SNPs (Zhaoet al, 2003)。分布于基因內(nèi)的SNP可能會(huì)對mRNA的表達(dá), 翻譯和剪切以及蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能造成影響, 從而導(dǎo)致生物體性狀的改變(Carrollet al,2005)。MC4R的SNPs與生物體的性狀關(guān)聯(lián)分析在家畜和家禽中有著廣泛的研究, 但在魚類中罕有報(bào)道,只對吉富羅非魚(Oreochromis niloticus)和紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes) MC4R的SNPs有所研究(劉福平等, 2009; 張麗等, 2012)。

縮骨鯽(C.auratussogu var.)主要分布于湖南與廣東, 因其尾部脊椎萎縮而得名, 在廣東有一定規(guī)模的養(yǎng)殖(謝楠等, 2016)。其軀體較高, 體長約為體高的1.6倍。距背鰭前基部三分之一處的后部脊椎骨呈萎縮狀, 尾柄長遠(yuǎn)小于尾柄高。背鰭后基部的兩側(cè)肌肉發(fā)達(dá)。這種體型并非病態(tài), 而是純粹的遺傳所致(俞豪祥等, 1986)。縮骨鯽肉質(zhì)鮮美, 營養(yǎng)豐富, 但是生長較為緩慢。故以能量代謝密切相關(guān)的 MC4R作為本實(shí)驗(yàn)的候選基因, 對其克隆, 序列分析, 表達(dá)分布以及檢測與生長潛在相關(guān) SNPs, 為縮骨鯽生長和發(fā)育的分子機(jī)制研究以及遺傳育種提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚

實(shí)驗(yàn)用縮骨鯽 14尾, 體質(zhì)量為(106±8.7)g, 取自廣東韶關(guān)水產(chǎn)研究所, 飼養(yǎng)于廣州大學(xué)水產(chǎn)養(yǎng)殖室的水族箱內(nèi)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

Ezup柱式動(dòng)物基因組 DNA抽提試劑盒和SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自生物工程(上海)股份有限公司; Taq酶和 RNA keeper購自 Vazyme Biotech公司。PMD19-T、大腸桿菌 DH5α感受態(tài)、RNAiso、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)和 SYBR? Premix Ex Taq?II (Tli RNaseH Plus), ROX plus均購自TaKaRa公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)和序列的克隆

根據(jù)鯽魚MC4R基因設(shè)計(jì)兩對CDs區(qū)域的引物(MC4R1F, MC4R1R, MC4R2F和MC4R2R)和一對3’非翻譯區(qū)引物(MC4R3F和MC4R3R), 根據(jù)已擴(kuò)增出縮骨鯽 MC4R片段, 設(shè)計(jì)三條染色體步移引物MC4R4、MC4R5、MC4R6和一對Real-time PCR引物(表1)。剪取25mg縮骨鯽背部肌肉, 使用生工DNA提取試劑盒抽提基因組 DNA。使用上述的引物對縮骨鯽基因組 DNA進(jìn)行擴(kuò)增, 純化后, 轉(zhuǎn)入大腸桿菌,送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序并使用Seqman拼接。

表1 用于縮骨鯽MC4R基因克隆、表達(dá)分析和SNPs篩選的引物Tab.1 Primers used for cloning and expression analysis of MC4R in C.auratus sogu var.

1.4 MC4R基因的序列拼接及分析

將測序獲得MC4R基因片段利用DNAstar 7.1的Seqman對序列進(jìn)行拼接、比對, 獲得縮骨鯽 MC4R基因組基因全序列, NCBI登錄號為KX988002。利用ExPASy-ProtParam tool在線分析工具分析縮骨鯽MC4R基因編碼蛋白的理化性質(zhì)。使用 TMHMM Server v.2.0對縮骨鯽MC4R蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測。使用Mega 5.0軟件對已公布的部分MC4R以及MCR家族的氨基酸序列(表2)進(jìn)行多重比對, 并使用NJ法構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹, Bootstrap檢驗(yàn)重復(fù)1000次。

1.5 縮骨鯽MC4R的組織分布表達(dá)分析

取 3尾縮骨鯽的 9個(gè)組織: 腦、眼、心臟、卵巢、肝胰臟、腸、腎臟、鰓和肌肉迅速放入RNA keeper中, 使用trizol法提取總RNA, 使用2%瓊脂糖電泳檢測RNA質(zhì)量。按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。該實(shí)驗(yàn)使用的熒光定量PCR平臺(tái)是ABI7000,按照 SYBR? Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus)試劑盒要求進(jìn)行 Real-time PCR對 9種組織的mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測, 每一個(gè)樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù)。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線檢測, 并送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序, 以確定擴(kuò)增基因?yàn)槟康幕?。本?shí)驗(yàn)使用 β-actin作為內(nèi)參基因(表 1),QMC4RF和QMC4RR作為縮骨鯽MC4R 特異性引物。使用2–ΔΔct法對不同組織的相對表達(dá)量進(jìn)行計(jì)算并作圖。

表2 用于構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹的MC4R以及MCRs氨基酸序列Tab.2 GenBank accession numbers of MC4R and MCRs used in this study

1.6 與生長相關(guān)的SNPs的檢測

在一同時(shí)孵化, 飼養(yǎng)條件相同的縮骨鯽群體內(nèi),選取5條較大個(gè)體和5條較小個(gè)體, 作為篩選與生長相關(guān)的 SNPs的樣本, 并剪其鰭條, 提取基因組DNA。將提取的 10尾縮骨鯽基因組 DNA混合成基因池, 使用 MC4R1F、MC4R1R、MC4R2F 和 MC4R2R兩對引物以該基因池為模板分別對兩段 CDs進(jìn)行擴(kuò)增, 并送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司測序, 得到的結(jié)果使用Chromas 2.33查看, 篩選SNPs點(diǎn), 并對SNPs位點(diǎn)進(jìn)行初步分析。

2 結(jié)果

2.1 縮骨鯽的MC4R基因組基因獲得與分析

縮骨鯽MC4R CDs以及3’非翻譯區(qū)的擴(kuò)增片段如圖 1所示, 啟動(dòng)子區(qū)域通過染色體步移獲得,MC4R基因組基因長度為 2854bp, 只包含一個(gè)外顯子, 長度為 981bp, 共編碼 326個(gè)氨基酸, 縮骨鯽MC4R序列的具體分析見圖 2。推測的 MC4R蛋白預(yù)計(jì)分子量為 36531.58, 等電點(diǎn)為 8.45。其氨基酸組成中以亮氨酸(Leu)的含量最高(12.6%), 含量最低的是色氨酸(Trp), 為 1.5%, 其他氨基酸含量在1.8%—10.7%之間。此蛋白不穩(wěn)定系數(shù)為 35.65, 是一種較為穩(wěn)定的蛋白。此外, 蛋白質(zhì)氨基酸殘基親疏水性總平均數(shù)(GRAVY)為–0.713, 此蛋白為疏水蛋白。

圖1 縮骨鯽MC4R部分基因組序列擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 PCR result of MSTN of C.auratus sogu var.

2.2 縮骨鯽MC4R氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)分析

縮骨鯽 MC4R氨基酸序列的跨膜結(jié)構(gòu)使用TMHMM Server v.2.0進(jìn)行分析, 結(jié)果顯示, 該蛋白共有七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu), 與其他G蛋白偶聯(lián)受體相同?？缒さ鞍譔-末端位于細(xì)胞膜外, C-末端位于細(xì)胞膜內(nèi)七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)的位置分別為45—67, 79—101, 121—143,163—185, 195—217, 243—265 和 280—302(圖 2)。

圖2 縮骨鯽MC4R核苷酸序列與推測的氨基酸序列Fig.2 MC4R nucleotide sequence and predicted amino acid sequence of C.auratus sogu var.

2.3 縮骨鯽MC4R的同源性分析

對比 GenBank中已經(jīng)公布的一些物種的 MC4R和 MCRs氨基酸序列, 結(jié)果顯示, 縮骨鯽與鯽魚的MC4R氨基酸序列的同源度最高達(dá)到99.3%, 與鯉魚的同源度次之達(dá)到98.6%, 縮骨鯽與其他鯉科魚類的同源度為 97.9%—97.5%, 鯉科魚類中的 MC4R非常保守。縮骨鯽與其他硬骨魚類的同源度為 83.4%—79.7%, 與軟骨魚類赤的同源度為 75.3%, 與陸生動(dòng)物的同源度為71.2%—68.9%。在MCRs家族中, 縮骨鯽MC4R與鯽魚的MC5R最為同源, 達(dá)到68.4%。另外, 與斑馬魚的MC3R的同源度為60.5%, 與斑馬魚MC1R的同源度為42.5%, 與斑馬魚的MC2R同源度為25.7%。總而言之, MC4R在不同的物種內(nèi)相對保守, MCRs家族間有著較大差異。

圖3 不同物種MC4R以及MCRs家族氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of MC4R of different species and MCRs family

2.4 縮骨鯽MC4R在不同組織的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分布

通過Real-time PCR對縮骨鯽MC4R在不同組織內(nèi)的表達(dá)量研究。Real-time PCR的擴(kuò)增產(chǎn)物溶解曲線為單峰, 測序結(jié)果確認(rèn)擴(kuò)增產(chǎn)物為目的片段。Real-time PCR結(jié)果表明, 在縮骨鯽腦中MC4R中含量最高, 眼中次之, 肌肉, 卵巢和腎臟中表達(dá)較少,在鰓、腸、心臟和肝胰腺中微量表達(dá)(圖4)。

2.5 縮骨鯽MC4R編碼區(qū)SNPs檢測

在縮骨鯽的CDs區(qū)域中, 有6個(gè)SNPs被檢測到(圖2), 以編碼區(qū)第1個(gè)核苷酸為1, 編碼區(qū)下游為正值, 對 SNPs進(jìn)行命名, 分別為 A123G、A199G、C231T、A444G、C480T和A881C(圖5), A123G位同義突變(CTA＞CTG), 均編碼亮氨酸; A199G為錯(cuò)義突變(ATC＞GTC), 分別編碼異亮氨酸和纈氨酸, 均為非極性氨基酸, 該突變位于第一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)內(nèi); C231T為同義突變(TAC＞TAT), 均編碼酪氨酸; A444G為同義突變(ACG＞ACA), 均編碼蘇氨酸; C480T為同義突變(ACT＞ACC), 均編碼蘇氨酸, A881C位錯(cuò)義突變(CAC＞CAA), 分別編碼組氨酸和谷氨酰胺, 位于第四個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)區(qū)。這些突變均可能對縮骨鯽的生長數(shù)量性狀造成影響。

圖4 縮骨鯽MC4R mRNA在不同組織內(nèi)的表達(dá)Fig.4 Relative expression of MC4R mRNA in tissues of in C.auratus sogu var.

圖5 縮骨鯽MC4R編碼區(qū)的SNPs位點(diǎn)Fig.5 The SNPs in CDs of C.auratus sogu var.

3 討論

縮骨鯽MC4R與部分GenBank公布MC4R的序列和MCRs家族成員比對顯示, 縮骨鯽與鯽魚的同源性最高達(dá)到 99.3%, 這與劉良國等(2005)采用 RAPD方法分析鯽魚品系所得出的結(jié)果相符: 縮骨鯽可能是由普通鯽魚分化而來。鯉科魚類中, MC4R的同源度都很高, 可達(dá) 97.5%—99.3%, 這意味著 MC4R在生理調(diào)控方面可能有著重要作用。MC4R與其他MCR家族成員同源度為 25.7%—68.4%, 其中, MC4R與MC3R和MC5R的同源度相對其他MCRs成員較高,分別為 68.4%和 60.5%, 有報(bào)道稱這三個(gè)黑色素皮質(zhì)素受體在功能上有所重疊(Shuklaet al, 2013), 這可能是由于MC4R與MC5R和MC3R相對于其他MCR家族成員分化時(shí)間較短有關(guān)。另外, Klovins等(2004)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在白斑角鯊(Squalus acanthias)中,MC4R與MC3R和MC5R的同源度相對于其他MCRs成員也是最高的, 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其相符。多重比對顯示, 魚類中的MC4R與陸生動(dòng)物有著較大的差異, 魚類 MC4R氨基酸長度多為 326—327aa, 但是陸生動(dòng)物中MC4R氨基酸殘基長度一般332aa左右。另外,通過 MC4R氨基酸序列構(gòu)建的分子系統(tǒng)發(fā)育樹與形態(tài)學(xué)的系統(tǒng)分類結(jié)果基本吻合。

縮骨鯽的 MC4R mRNA表達(dá)主要分布于腦中,在肌肉, 腎臟, 眼和卵巢中也有不同程度的分布, 在鰓, 肝胰腺, 腸和心臟中微量表達(dá)?？s骨鯽在腦, 肌肉, 腎臟, 眼和卵巢中的表達(dá)與蛇皮魚較為相似(Jangpraiet al, 2011); 在金魚中, MC4R在腦, 眼和性腺中同樣有著顯著的分布(Cerdá-Reverteret al,2003)。在虹鱒中, MC4R也主要集中于腦, 腎臟和性腺中表達(dá), 但在肌肉中表達(dá)較少, 與縮骨鯽相異。MC4R作為一種中樞神經(jīng)受體, 故而在腦中有著較高的表達(dá)(Ellacottet al, 2004); MC4R與性行為有著密切的關(guān)聯(lián), 這可能是 MC4R在性腺中有著顯著的表達(dá)的原因(Lhet al, 2002); MC4R在腎中的顯著表達(dá),可能與腎臟是重要的調(diào)節(jié)能量平衡的器官并且腎臟中有著POMC衍生物的存在有關(guān)(Bertileet al, 2006)。有報(bào)道稱 MC4R存在于肌肉中, 可能與代謝調(diào)節(jié)有關(guān)(劉欣等, 2012), 但是其對肌肉及其周圍組織的作用尚不清楚。

本實(shí)驗(yàn)共發(fā)現(xiàn)位于縮骨鯽 MC4R編碼區(qū)上的 6個(gè)SNPs, 其中四個(gè)同義突變, 兩個(gè)錯(cuò)義突變, 在很多研究中, 同義突變同樣會(huì)影響生物體的生長性狀, 這主要是因?yàn)橥x突變可能會(huì)改變蛋白的折疊空間結(jié)構(gòu), 導(dǎo)致蛋白的功能發(fā)生變化(Kimchi-Sarfatyet al,2007), 這在多種動(dòng)物中均有報(bào)道(劉德武等, 2008;付金秀等, 2016)。Komar(2007)也認(rèn)為只有少數(shù)的同義突變屬于中性突變, 大部分的同義突變會(huì)對個(gè)體造成影響。A199G為錯(cuò)義突變(ATC＞GTC), 分別編碼異亮氨酸和纈氨酸, 但均為非極性疏水氨基酸, 這種變化并不會(huì)對該蛋白造成致命的影響, 但是很有可能影響縮骨鯽的性狀。A881C 為錯(cuò)義突變(CAC＞CAA), 分別編碼組氨酸和谷氨酰胺, 位于第四個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)區(qū), 兩個(gè)氨基酸均為極性氨基酸, 同樣不是致命的, 但是否對縮骨鯽的個(gè)體性狀有影響,還需要大規(guī)模的群體進(jìn)行SNPs與性狀的關(guān)聯(lián)分析。

4 結(jié)論

本文采用同源克隆及染色體步移對縮骨鯽MC4R基因進(jìn)行了克隆, 得到了縮骨鯽MC4R的基因序列長度為 2854bp, 只包含一個(gè)外顯子, 長度為981bp, 共編碼326個(gè)氨基酸, MC4R共有七個(gè)跨膜結(jié)構(gòu), 是較為穩(wěn)定的疏水蛋白。該基因與其他魚類相比具有較高的同源度, 但與陸生動(dòng)物的同源度相對較低?？s骨鯽MC4R mRNA在腦中表達(dá)量最為顯著, 眼中次之, 肌肉、卵巢和腎臟中表達(dá)較少, 在鰓、腸、心臟和肝胰腺中僅微量表達(dá)。另外還發(fā)現(xiàn)了位于編碼區(qū)上的6個(gè)潛在的與生長性狀相關(guān)聯(lián)的SNP位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)可為研究縮骨鯽的生長和發(fā)育的調(diào)控機(jī)制以及分子輔助育種提供基礎(chǔ)資料和理論依據(jù)。

王 婕, 劉小林, 侯水生等, 2011.北京鴨 MC4R基因的克隆及其組織表達(dá)的差異.西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 20(1): 29—34

左北瑤, 錢宏光, 2011.MC4R基因研究進(jìn)展.中國草食動(dòng)物,31(5): 45—50

付金秀, 郭紅威, 李 超等, 2016.雞DGAT2基因第7外顯子多態(tài)性與生產(chǎn)性能的關(guān)聯(lián).農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào), 24(5):689—696

劉 欣, 金勇君, 楊美子等, 2012.MC5R在促黑素對骨骼肌細(xì)胞脂肪酸氧化影響中的作用.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志, 22(17):12—16

劉良國, 趙 俊, 陳湘粦, 2005.彭澤鯽兩個(gè)雌核發(fā)育克隆與三個(gè)鯽魚品系的RAPD分析.淡水漁業(yè), 35(2): 13—16

劉福平, 白俊杰, 葉 星等, 2009.羅非魚 MC4R基因克隆及與其生長相關(guān)的 SNPs位點(diǎn).中國水產(chǎn)科學(xué), 16(6):816—823

劉德武, 杜穎軍, 張 豪等, 2008.豬Leptin基因的SNP篩查及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 27(2):251—257

張 麗, 仇雪梅, 王 娟等, 2012.紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)MC4R基因的多態(tài)性分析.生物技術(shù)通報(bào), (7):97—102

俞豪祥, 張海明, 1986.“縮骨鯽”的生物學(xué)及養(yǎng)殖試驗(yàn)初報(bào).水產(chǎn)科技情報(bào), (3): 21

謝 楠, 劉 凱, 馮曉宇, 2016.鯽魚常見品種概述.杭州農(nóng)業(yè)與科技, (4): 13—17

Bertile F, Raclot T, 2006.The melanocortin system during fasting.Peptides, 27(2): 291—300

Carroll L, Voisey J, van Daal A, 2005.Gene polymorphisms and their effects in the melanocortin system.Peptides, 26(10):1871—1885

Cerdá-Reverter J M, Ringholm A, Schi?th H Bet al, 2003.Molecular cloning, pharmacological characterization, and brain mapping of the melanocortin 4 receptor in the goldfish:involvement in the control of food intake.Endocrinology,144(6): 2336—2349

Ellacott K L, Cone R D, 2004.The central melanocortin system and the integration of short- and long-term regulators of energy homeostasis.Recent Progress in Hormone Research,59: 395—408

Froguel P, Boutin P, 2001.Genetics of pathways regulating body weight in the development of obesity in humans.Experimental Biology and Medicine, 226(11): 991—996

Haitina T, Klovins J, Andersson Jet al, 2004.Cloning, tissue distribution, pharmacology and three-dimensional modelling of melanocortin receptors 4 and 5 in rainbow trout suggest close evolutionary relationship of these subtypes.Biochemical Journal, 380(2): 475—486

Huszar D, Lynch C A, Fairchild-Huntress Vet al, 1997.Targeted disruption of the melanocortin-4 receptor results in obesity in mice.Cell, 88(1): 131—141

Jangprai A, Boonanuntanasarn S, Yoshizaki G, 2011.Characterization of melanocortin 4 receptor inSnakeskin gouramiand its expression in relation to daily feed intake and short-term fasting.General and Comparative Endocrinology, 173(1): 27—37

Kimchi-Sarfaty C, Oh J M, Kim I Wet al, 2007.A “silent”polymorphism in the MDR1 gene changes substrate specificity.Science, 315(5811): 525—528

Klovins J, Haitina T, Ringholm Aet al, 2004.Cloning of two melanocortin (MC) receptors in spiny dogfish: MC3 receptor in cartilaginous fish shows high affinity to ACTH-derived peptides while it has lower preference to γ-MSH.European Journal of Biochemistry, 271(21): 4320—4331

Komar A A, 2007.Silent SNPs: impact on gene function and phenotype.Pharmacogenomics, 8(8): 1075—1080

Lander E S, 1996.The new genomics: global views of biology.Science, 274(5287): 536—539

Lh V D P, Martin W J, Howard A Det al, 2002.A role for the melanocortin 4 receptor in sexual function.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99(17): 11381—11386

Mountjoy K G, Mortrud M T, Low M Jet al, 1994.Localization of the melanocortin-4 receptor (MC4-R) in neuroendocrine and autonomic control circuits in the brain.Molecular Endocrinology, 8(10): 1298—1308

Shukla C, Koch L G, Britton S Let al, 2013.Differential contribution of brain-region-specific melanocortin 5 receptor to physical activity levels in lean vs.obesity-prone rats.The FASEB Journal, 27: 935.1

Vaisse C, Clement K, Guy-Grand Bet al, 1998.A frameshift mutation in human MC4R is associated with a dominant form of obesity.Nature Genetics, 20(2): 113—114

Van der Ploeg L H T, Martin W J, Howard A Det al, 2002.A role for the melanocortin 4 receptor in sexual function.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 99(17): 11381—11386

Vrinten D H, Gispen W H, Groen G Jet al, 2000.Antagonism of the melanocortin system reduces cold and mechanical allodynia in mononeuropathic rats.The Journal of Neuroscience, 20(21): 8131—8137

Wei R B, Yuan D Y, Zhou C Wet al, 2013.Cloning, distribution and effects of fasting status of melanocortin 4 receptor(MC4R) inSchizothorax prenanti.Gene, 532(1): 100—107

Zhao Z M, Fu Y X, Hewett-Emmett Det al, 2003.Investigating single nucleotide polymorphism (SNP) density in the human genome and its implications for molecular evolution.Gene,312: 207—213

CLONE, EXPRESSION, AND SCREENING OF GROWTH ASSOCIATED SNPS OFCARASSIUS AURATUSSOGU VAR.

YANG Yang1, ZHOU Hui-Qiang1, SHU Hu1, LAN Zhao-Jun2, LI Qiang1, GU Ping-Hua2
(1.School of Life Science,Guangzhou University,Guangzhou510006,China;2.Shaoguan Fisheries Research Institute,Shaoguan512006,China)

Melanocortin reporter-4 (MC4R) belongs to G-protein-coupled receptors family; it plays an important role in energy regulation.By homologous cloning and chromosome walking, MC4R gene ofCarassius auratussogu var.was cloned, and the expression of MC4R gene were studied based on real-time PCR.Meanwhile, SNPs (single nucleotide polymorphisms) of the MC4R in CDs region were detected by Sanger sequences.The result show that the length of MC4R genome gene was 2854bp that contain one 981-bp exon, the CDs code 326 amino acid.The MC4R contained 7 transmembrane structure and was a stable hydrophobin.Through sequence alignment of MC4Rs from different species and other members of MCRs, we found that theC.auratusis the closest species toC.auratussogu var.The homology ratio is 99.3%, the MC4R was far from other MCRs members.The real-time PCR result shows that MC4R mRNA was most expressed in brain, and then in eyes; and less expressed in muscle, ovary, and kidney.Weak MC4R mRNA was expressed in gill, intestine, heart and hepatopancreas.In the codon sequence, six SNPs were detected: two missense mutations, and four silent mutations.The results shall be insightful to understand the growth ofC.auratussogu var., and offer fundamental data for molecular markers ofC.auratussogu var.

melanocortin reporter-4 (MC4R);Carassius auratussogu var.; clone; tissue expression; single nucleotide polymorphisms (SNPs)

Q953; S917.4

10.11693/hyhz20170100025

* 國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))重大專項(xiàng), 201303048號; 廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目, 2015A0303135092號; 廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目,2014A020208145號。楊 揚(yáng), E-mail: 214453598@qq.com

① 通訊作者: 舒 琥, 博士, 教授, E-mail: shuhu001@126.com

2017-01-29, 收修改稿日期: 2017-03-04