瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachellii)脂肪酸去飽和酶FAD2和延伸酶ELOVL5的克隆及表達分析*

覃川杰 文正勇 袁登越 邵 婷 龔 全

(1.內江師范學院生命科學學院 長江上游魚類資源保護與利用四川省重點實驗室 內江 641112;2.四川省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所 成都 611731)

瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachellii)脂肪酸去飽和酶FAD2和延伸酶ELOVL5的克隆及表達分析*

覃川杰1文正勇1袁登越1邵 婷1龔 全2

(1.內江師范學院生命科學學院 長江上游魚類資源保護與利用四川省重點實驗室 內江 641112;2.四川省農(nóng)業(yè)科學院水產(chǎn)研究所 成都 611731)

脂肪酸去飽和酶(FAD, fatty acyl desaturase)及延伸酶(ELOVL, elongases of very long chain fatty acids)在魚類脂肪代謝過程中發(fā)揮了重要作用。利用RT-PCR克隆得到瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachellii)肝臟中控制高不飽和脂肪酸合成的(FAD2)和(ELOVL5)基因cDNA 序列。瓦氏黃顙魚FAD2 cDNA片段長2041bp, 編碼447個氨基酸, 含有3個組氨酸簇(HDxGH, HxxHH, QxxHH), 含亞鐵血紅素結合基序(HPGG)的類似細胞色素b5結構域等。瓦氏黃顙魚ELOVL5 cDNA片段長1065bp, 編碼 294個氨基酸, 含有組氨酸簇(HxxHH)、內質網(wǎng)停留信號(K、R)和 4個 ELO 共有的保守區(qū)域(KxxExxDT, QxxFLHxYHH, NxxxHxxMYxYY, TxxQxxQ)等結構域。熒光定量PCR分析表明, FAD2和ELOVL5 mRNA在瓦氏黃顙魚腦、肝臟的表達量最高, 顯著高于腸道、脾臟、腎臟、鰓等組織。結果表明, 瓦氏黃顙魚具有合成高不飽和脂肪酸的關鍵酶 FAD2和 ELOVL5, 且肝臟為合成高不飽和脂肪酸的主要場所。

脂肪酸去飽和酶(FAD2); 脂肪酸延伸酶(ELOVL5); 瓦氏黃顙魚; cDNA

瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachellii)是一種偏肉食性的雜食性魚類, 隸屬于鲇形目(Siluriformes)、鲿科(Bagride)、黃顙魚屬(Pelteobagrus), 其肉細嫩、味道鮮美, 深受消費市場青睞(丁瑞華, 1994)。該魚體型較大、生長快, 已成為我國重要的淡水名優(yōu)經(jīng)濟養(yǎng)殖魚類。目前, 吳代武等(2017)發(fā)現(xiàn), 飼料中添加過高的植物蛋白會明顯降低黃顙魚(P.fulvidraco)生長, 飼喂魚蛋白水解物日糧使黃顙魚肌肉游離氨基酸含量的升高, 特別是呈味氨基酸含量增加。飼料中添加豆油不會顯著影響瓦氏黃顙魚的增重率、肝體指數(shù)和體成分等, 但會影響肌肉中脂肪酸的組成, 增加肌肉中C18:1n-9、C18:2n-6和單不飽和脂肪酸比例(邵婷等,2017)。變換晝夜投喂時間會顯著影響肝臟中?；?CoA去飽和酶(acyl-CoA desaturase), 葡萄糖-6-磷酸酯 酶(glucose-6-phosphatase), γ-谷 氨 酰轉肽 酶 1(gamma- glutamyltranspeptidase 1), 胰凝乳蛋白酶 B(chymotrypsin B)等與蛋白、脂肪和糖代謝的相關基因mRNA的表達(Qinet al, 2017)。因此, 深入分析瓦氏黃顙魚高不飽和脂肪酸的生物合成能力有助于制定合理的飼料配方。

魚類必需營養(yǎng)素中的高度不飽和脂肪酸(high unsaturation fatty acids, HUFAs), 尤其是二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid, EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acids, DHA), 它們對維持生物機體的正常機能, 促進生長發(fā)育和繁殖, 以及提高成活率等方面起著重要生理作用。水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中大部分HUFAs的來源主要是魚油, 但由于其高昂的價格,增加了養(yǎng)殖成本, 導致經(jīng)濟效益降低; 因而, 缺乏高不飽和脂肪酸的豆油等植物油被廣泛應用于水產(chǎn)飼料(覃川杰等, 2013)。一般而言, 魚類可以通過n-3和/或n-6的途徑去飽和及碳鏈的延長作用, 將植物產(chǎn)品中的18:3 n-3及18:2 n-6脂肪酸分別轉化為長鏈高不飽和脂肪酸(Cooket al, 2002)。但不同魚類合成HUFAs的能力相差比較明顯, 如淡水魚類的高不飽和脂肪酸的合成能力明顯優(yōu)于海水魚類(Tocheret al,1999, 2006)。因此, 了解和掌握養(yǎng)殖魚類長鏈脂肪酸的合成能力, 有助于在魚類養(yǎng)殖中合理利用不同的脂肪源。研究表明, 脂肪酸去飽和酶Δ6和脂肪酸延伸酶 ELOVL5在動物高效利用植物脂肪過程中發(fā)揮了關鍵作用(Xueet al, 2014), 且脂肪酸去飽和酶和延長酶普遍存在于多數(shù)淡水魚類中(Agabaet al, 2005)。目前, 只從少數(shù)幾種魚類克隆了脂肪酸去飽和酶和延伸酶的 cDNA, 且主要集中在海水魚類, 如軍曹魚Rachycentron canadum, 大西洋鱈Gadus morhua等(許友卿等, 2010; Xueet al, 2014); 赤鱸Perca fluviatilis和草魚Ctenopharyngodon idellus等淡水魚類中開展了相關研究(杜嵇華等, 2011; Geayet al,2016)。作者在本文中對瓦氏黃顙魚的 FAD2和ELOVL5 cDNA序列進行克隆, 并分析該兩種基因在瓦氏黃顙魚中的表達, 以期進一步探討瓦氏黃顙魚合成HUFAs的可能性及其機制。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料為鮮活瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachellii) (體重約15g/尾), 購于內江某養(yǎng)殖場。將實驗魚置于冰上麻醉, 然后處死, 同時將其肌肉、肝臟、心臟、脾臟、腸道、腎臟、鰓和腦取出, 液氮速凍, 置于–80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 總RNA提取及cDNA合成

按照 RNAiso Plus (TaKaRa)試劑操作步驟提取瓦氏黃顙魚肝臟總 RNA; 以肝臟總 RNA為模板,oligo(dT)20為逆轉錄引物, 按照 PrimeScriptTMRT reagent Kit (TaKaRa)逆轉錄試劑盒操作步驟合成cDNA。

1.3 瓦氏黃顙魚FAD2和ELOVL5基因cDNA克隆

根據(jù)人、豬以及魚等物種的 FAD2和 ELOVL5基因保守區(qū)域, 設計PCR簡并引物(上海生工合成)。以瓦氏黃顙魚的肝臟cDNA為模板, 采用rTaq DNA聚合酶(TaKaRa), 以簡并引物進行 PCR擴增。用Biometra PCR儀擴增, PCR反應參數(shù)為: 94℃熱啟動4min, 然后 94℃變性 30s, 50℃ (FAD2)和 52℃(ELOVL5)分別退火30s, 再72℃延伸1min, 30個循環(huán),72℃ 10min終止反應。

將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳, 將含有目的 DNA片段的瓊脂糖凝膠切下, 然后使用 Tiangene DNA純化試劑盒進行純化。具體操作步驟按天根公司試劑盒的使用說明進行。

1.4 擴增片段的克隆與測序

將PCR產(chǎn)物經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳純化后, 再經(jīng)HQ & Q.Gel Extraction Kit II (U-gene)回收后, 將其克隆至pMD 18-T載體上(TaKaRa), 轉化感受態(tài)E.coliJM109, 利用M13正、反向引物, 通過PCR反應,檢測得到陽性克隆, 由上海生工公司測序。

1.5 基因片段的序列分析

將測序后所得的瓦氏黃顙魚 FAD2和 ELOVL5 cDNA片段序列, 在BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)進行同源比較。提交NCBI數(shù)據(jù)庫后, 再根據(jù)所得到的cDNA序列, 推導其FAD2和ELOVL5氨基酸序列(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/orfig.cgi); 再采用Expert Protein Analysis System (http://us.expasy.org/)以及 ANTHEPROT 2000 V5.2軟件推導cDNA片段所得的FAD2和ELOVL5功能位點。

1.6 組織表達分析

按照RNAiso Plus (TaKaRa)試劑操作步驟分別提取9尾瓦氏黃顙魚肝臟、肌肉、腸道、心臟、脾臟、腎臟、鰓和腦總RNA后, 用Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑合成cDNA。根據(jù)已獲得瓦氏黃顙魚 FAD2和 ELOVL5 cDNA設計基因特異性引物分析組織表達, 特異性序列見表 1。以β-actin為內參基因(表 1)(Zhenget al,2010), 采 用 2–ΔΔct法(Livaket al, 2001), 按 照SYBR?Premix Ex TaqTMII試劑操作步驟和 Roche Light Cycler Nano (USA)熒光定量PCR儀分析檢測FAD2和ELOVL5 mRNA相對表達量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用平均值±標準差(Mean±S.D.)表示試驗數(shù)據(jù),采用SPSS18.0軟件處理試驗結果。基于單因方差分析基礎上, 采用 Duncan多重比較法對組間差異進行檢驗, 當P＜0.05則為存在顯著差異。

表1 PCR引物序列Tab.1 The PCR primer sequences

2 結果與討論

動物體內可通過n-6和n-3途徑合成HUFAs。以n-3途徑合成高不飽和脂肪酸, 首先第一步反應是由α-亞麻酸(α-linolenic acid, ALA, 18:3n-3)轉化為十八碳四烯酸(octadecatetraenoic acid, OTA, 18:4n-3); 而n-6途徑則是由前體物質亞油酸(linoleic acid, LA,18:2n-6)轉 化 為 γ-亞 麻 酸 (γ-linolenic acid, GLA,18:3n-6); 第一步轉化的脫氫反應是 n-3和 n-6 合成途徑的限速步驟, Δ6脂肪酸去飽和酶能將 α-亞麻酸和亞油酸分別轉化成十八碳四烯酸和亞麻酸, 是由亞油酸和亞麻酸合成高不飽和脂肪酸的限速酶(Tocheret al, 2006)。如果動物體內缺乏Δ6去飽和酶,或該酶活性受到抑制, 就會妨礙機體內亞油酸向γ-亞麻酸(n-6途徑)和α-亞麻酸向十八碳四烯酸(n-3途徑)的轉化, 影響HUFAs的生物合成(Bellet al, 2009)。然而, 不同魚類Δ6脂肪酸去飽和酶的差異較大; 在大西洋鮭(Salmo salar)等洄游魚類體內發(fā)現(xiàn)兩種FAD的存在, 它們分別具有Δ5和Δ6的活性(Hastingset al,2005; Zhenget al, 2005), 而斑馬魚(Danio rerio)FAD則同時具有Δ5和Δ6活性(Hastingset al, 2001)。本實驗采用 RT-PCR方法獲得瓦氏黃顙魚 FAD基因的cDNA片段, FAD基因cDNA序列片段1904bp, 包括86bp的5’-UTR、480bp的3’-UTR和1338bp的ORF(圖1)。ORF分析獲得 FAD完整的 446個氨基酸。經(jīng)BLASTp比對分析發(fā)現(xiàn), 瓦氏黃顙魚的FAD2氨基酸序列與其他物種的 FAD2氨基酸序列有著高相似性(圖 2)。瓦氏黃顙魚 FAD2氨基酸與虎頭鯊Pangasianodon hypophthalmus(88%, AFN21428.1)、黃顙魚P.fulvidraco(80%, AJQ20793.1)、墨西哥脂鯉Astyanax mexicanus(76%, XP_007235183.1)、金錢魚Scatophagus argus(68%, AHA62794.1)等 FAD2均有很高的同源性(表2)。因此可以推斷所克隆到的cDNA為 FAD2基因片段, 將所得該基因片段提交至GenBank, 登錄號分別為KY853758。瓦氏黃顙魚FAD氨基酸序列含有多個保守的結構域(圖 2), 與草魚C.idellus、刀鱭Coilia nasus、軍曹魚R.canadum、黃鱔Monopterus albus、黃顙魚P.fulvidraco等相似(杜嵇華等, 2011; 周秋白等, 2011; 魏廣蓮等, 2014; Songet al, 2015), 含有八個保守的組氨酸殘基, 構成三個保守組氨酸富集區(qū)(histidine-richregion), 結構簡式表示為HX(3-4)H、HX(2-3)HH、(H/Q)X(2-3)HH (Zhenget al, 2005), 3個保守的組氨酸富集區(qū)和1個Fe2＋結合形成催化活性中心, 還包括亞鐵血紅素結合基序(HPGG)的類似細胞色素 b5結構域等(Zhenget al,2009)。Δ6脂肪酸去飽和酶是一種膜結合脂肪酸去飽和酶, 它以細胞色素b5氧化還原酶和NADH作為電子供體, 用來催化甘油酯中的脂肪酸脫氫(Sprecheret al, 1995)。此外, NADH-細胞色素b5還原酶可以通過FAD中的細胞色素b5結構域直接向FAD蛋白催化位點傳遞電子, 催化甘油酯中的脂肪酸脫氫, 而不需要細胞色素b5蛋白參與(Guillouet al, 2010)。前兩個組氨酸簇位于2個跨膜區(qū)之間, 第三個組氨酸簇位于第二個跨膜區(qū)的后面, 這樣三個保守的組氨酸簇與鐵離子共同構成了 FAD發(fā)揮催化活性的催化中心。2個跨膜區(qū)對于它們的細胞定位和形成適合的空間結構十分重要(Loset al, 1998)。

脂肪酸碳鏈的延伸主要發(fā)生于內質網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)、過氧化物酶體(peroxisome)和線粒體(mitochondrion)中。在內質網(wǎng)上,以脂酰CoA (fatty acyl-CoA)作為起點, 通過縮合、還原、脫水、再還原四個步驟循環(huán)完成碳鏈的延伸, 合成超長鏈脂肪酸(very long chain fatty acid, VLCFA)(Leonardet al, 2004)。超長鏈脂肪酸延伸酶(elongase of very long chain fatty acid, ELOVL)家族正是催化超長鏈脂肪酸合成循環(huán)反應中的第一個限速縮合步驟的酶類(Sprecher, 2000)。該家族的蛋白質序列中均含有KxxExxDT、HxxHH、HxxMYxYY、TxxQxxQ等相似的結構域。哺乳動物體內ELOVL家族包含7個成員, 其中ELOVL5參與延長單不飽和脂肪酸(C16、C18)和多不飽和脂肪酸(C18、C20、C22)。它能調控肝臟脂肪及碳水化合物的代謝, 從而影響機體血脂、血糖濃度(Wanget al, 2008)。目前魚類中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ELOVL5, 并成為HUFA合成代謝研究熱點。本實驗,采用RT-PCR克隆得到ELOVL5 cDNA片段1164bp,包括 70bp的 5’-UTR、212bp的 3’-UTR 和 882bp的ORF(圖3); ORF編碼294個氨基酸, BLASTp比對分析表明, 該氨基酸序列與其他魚類 ELOVL5的氨基酸序列具有較高的相似性(圖 4)。因此可以推斷所克隆到的cDNA片段為瓦氏黃顙魚ELOVL5基因, 將所得該基因片段提交至 GenBank, 登錄號分別為KY853759。瓦氏黃顙魚 ELOVL5氨基酸與拉氏巨鯰Pangasius larnaudii(88%, AGR45586.1)、非洲鯰(C.gariepinus, 86%, AAT81405.1)、草魚(C.idella,81%, ADU04500.1)、墨西哥麗脂鯉(A.mexicanus, 78%,XP_007240116.1)等均有很高的同源性(表2)。瓦氏黃顙魚ELOVL5基因含有內質網(wǎng)停留信號(K, R)、高度保守的氧化還原中心組氨酸簇(HxxHH, 位于第 2個跨膜區(qū)內)以及跨膜區(qū)(QxxFLHxYHH, KxxExxDT,TxxQxxQ, NxxxHxxNYxYY)等結構功能域(圖4)。同樣, 黃顙魚P.fulvidraco、草魚C.idella、黃鱔M.albus等魚類 ELOVL5基因均含有組氨酸簇、碳末端內質網(wǎng)停留信號、多個跨膜區(qū)域等, 且在不同魚類中高度保守(杜嵇華等, 2011; 周秋白等, 2011; Songet al,2015), 以上這些結構域對形成合適構型和其細胞定位有著重要的作用(Loset al, 1998)。

圖1 瓦氏黃顙魚FAD2基因cDNA序列及編碼的氨基酸序列Fig.1 Nucleotide sequences of FAD2 cDNA and deduced amino acid sequence of P.vachellii

圖2 瓦氏黃顙魚FAD2基因氨基酸序列與其他物種FADS2基因的氨基酸序列多重比較Fig.2 Alignment of FAD2 of P.vachellii with other homologues using Clustal W program

表2 物種名稱、序列號和相似性Tab.2 Accession number, scientific name and identity of the members of FAD2 and ELOVL5 amino sequences

圖3 瓦氏黃顙魚ELOVL5基因cDNA序列及編碼的氨基酸序列Fig.3 Nucleotide sequences of ELOVL5 cDNA and deduced amino acid sequence of P.vachellii

圖4 瓦氏黃顙魚ELOVL5基因氨基酸序列與其他物種ELOVL5基因的氨基酸序列多重比較Fig.4 Alignment of ELOVL5 of P.vachellii with other homologues using Clustal W program

脂肪酸去飽和酶基因在瓦氏黃顙魚的 8種組織中均有表達。在肝臟和腦部的表達量最高, 其次為心、腸道、腎、脾、鰓, 而在皮膚和肌肉的表達量相對較低, 見圖 5。類似地, 刀鱭 FAD6在腦、腸道、肌肉、肝臟、腎臟、心、鰓等組織中具有表達, 且刀鱭FAD6基因在腦中的表達量最高, 并且極顯著地高于其他組織(P＜0.01), 其次是腸道(魏廣蓮等, 2014)。非洲鯰C.gariepinus和赤鱸Perca fluviatilis的FAD2在肝臟和腦中的表達量也顯著高于腸道、脾臟、腎臟等組織(Geayet al, 2016; Obohet al, 2016)。黃顙魚P.fulvidracoFAD2 mRNA在肝臟和腦的表達水平顯著高于肌肉、脾臟和鰓組織, 但顯著低于腸道(Songet al,2015)。類似地, 大西洋鱈Gadus morhuaΔ6去飽和酶基因在腦中的表達量最高, 其次是肝、腎和腸(Tocheret al, 2006)。虹鱒Oncorhynchus mykiss的Δ6 FAD2基因在肝臟、腦、腸道等組織中有著較高的表達量(Seiliezet al, 2003)。有研究表明, 在幼魚生長發(fā)育的關鍵階段, 魚體的神經(jīng)組織特別在腦和視網(wǎng)膜中含有高濃度的DHA, 并且DHA和n-3 HUFA的總含量高于其他非神經(jīng)組織中的含量(Tocheret al, 2006)。FAD2在多種魚類的腦中均顯著高于腸道、肝臟等營養(yǎng)代謝器官, 究其原因, 可能是腦中需要合成或攝取較多的高不飽和脂肪酸, 用以維持其正常的代謝功能的緣故(Naughton, 1981)。

圖5 FAD2和ELOVL5 mRNA在瓦氏黃顙魚組織中的相對表達量Fig.5 Distribution of FAD2 and ELOVL5 mRNA in tissues of P.vachellii

脂肪酸延伸酶基因 ELOVL5在瓦氏黃顙魚的 8種組織中也均有表達, 其中 ELOVL5 mRNA在瓦氏黃顙魚腦和肝臟中的表達量最高, 其次是垂體和腸道, 肌肉和血液中的表達水平較低(圖 5)。類似地,ELOVL5在非洲鯰C.gariepinus和大西洋鱈G.morhua的組織中均有表達(Xueet al, 2014; Obohet al,2016)。ELOVL5 mRNA在大西洋鱈的腦和鰓組織中的表達水平要高于肌肉、血液、肝臟和心臟; 而ELOVL5a和ELOVL5b mRNA在大西洋鱈中腸道(幽門盲囊), 肝臟和腦的表達水平最高。類似于其他多種淡水魚類, FAD2和ELOVL2 mRNAs的組織表達水平表明, 肝臟是魚類長鏈多不飽和脂肪酸生物合成的主要場所(Moraiset al, 2009)。

3 結論

本實驗成功克隆了瓦氏黃顙魚ELOVL5和FAD2基因cDNA序列, 瓦氏黃顙魚ELOVL5和FAD2氨基酸序列與其它魚類ELOVL5和FAD2的氨基酸序列具有較高的相似性, 且含有高度保守的結構域。FAD2和ELOVL5 mRNA在瓦氏黃顙魚腦、肝臟的表達量顯著高于腸道、脾臟、腎臟、鰓等組織。結果表明, 瓦氏黃顙魚具有合成高不飽和脂肪酸的關鍵酶FAD2和ELOVL5, 且肝臟可能為合成高不飽和脂肪酸的主要場所。

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MOLECULAR CLONING AND EXPRESSION OF FATTY ACID DESATURASE AND ELONGASE GENES IN DARKBARBEL CATFISHPELTEOBAGRUS VACHELLII

QIN Chuan-Jie1, WEN Zheng-Yong1, YUAN Deng-Yue1, SHAO Ting1, GONG Quan2
(1.Key Laboratory of Sichuan Province for Fishes Conservation and Utilization in the Upper Reaches of the Yangtze River,Neijiang Normal University,Neijiang641112,China; 2.Fisheries Institute,Sichuan Academy of Agricultural Sciences,Chengdu611731,China)

Understanding the endogenous synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids is of benefit to fish feed formulation.A FADS2 and an ELOVL5 cDNA were cloned containing open reading frames (ORF) of 1338 base pair (bp)and 864 bp specifying proteins of 447 and 294 amino acids, respectively.The deduced amino acid sequence ofPelteobagrus vachelliiFADS2 possessed conserved motif and included the histidine boxes, cytochrome b5 domain,transmembrane regions, and ELOVL 5 containing histidine boxes, endoplasmic reticulum retention signal domain, and transmembrane regions.In addition, FADS2 and ELOVL 5 mRNA distributed mainly in the brain and liver, and expressed significantly higher than that of intestine, spleen, kidney, gill, heart and muscle.These results indicate thatP.vachelliipossessed the desaturase and elongase, and the liver was the main tissues for synthesis of long-chain polyunsaturated fatty acids.

fatty acid desaturase; fatty acid elongase;Pelteobagrus vachellii; cDNA

Q789

10.11693/hyhz20170400088

* 國家自然科學基金項目, 31402305號; 四川省科技廳應用基礎項目, 2017JY0161號; 四川省“十三五”育種攻關項目,2016NYZ0024號。覃川杰, 博士, 副教授, E-mail: qinchuanjie@126.com

2017-04-07, 收修改稿日期: 2017-04-25