基于de novo高通量測序的曼氏無針烏賊(Sepiellajaponica)ESTs中微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選與特征分析*

呂振明 侯 龍 龔 理 劉立芹 陳永久 郭寶英董迎輝 吳常文

(1.浙江海洋大學(xué) 海洋生物種質(zhì)資源發(fā)掘與利用國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗室 舟山 316022;2.浙江萬里學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗室 寧波 315100)

基于de novo高通量測序的曼氏無針烏賊(Sepiella
japonica)ESTs中微衛(wèi)星位點(diǎn)篩選與特征分析*

呂振明1侯 龍1龔 理1劉立芹1陳永久1郭寶英1董迎輝2①吳常文1

(1.浙江海洋大學(xué) 海洋生物種質(zhì)資源發(fā)掘與利用國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗室 舟山 316022;2.浙江萬里學(xué)院 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗室 寧波 315100)

對均一化轉(zhuǎn)錄組測序獲得的 47604個曼氏無針烏賊的微衛(wèi)星序列進(jìn)行分析, 結(jié)果表明, 烏賊轉(zhuǎn)錄組中微衛(wèi)星位點(diǎn)豐富, 每1402nt的EST中就有一段不小于12nt長度的微衛(wèi)星序列。單堿基重復(fù)是EST微衛(wèi)星序列的主要形式(38.69%), 其次依次為三堿基(31.14%)、二堿基(26.35%)、四堿基(3.29%)、五堿基(0.38%)、六堿基(0.14%)重復(fù), 短序列類型占微衛(wèi)星總量的 96.18%。同堿基類型的微衛(wèi)星序列組成又存在差異, AC(54.51%)和 AG(31.22%)是最常見的二堿基重復(fù)序列; 而AGC(16.37%)和 AAC(14.06%)是最常見的三堿基重復(fù)序列。通過引物設(shè)計和體系優(yōu)化, 共篩選到了24對多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn), 對來自福建漳州海域的35只野生曼氏無針烏賊(Sepiella japonica)個體進(jìn)行群體遺傳學(xué)檢測, 結(jié)果表明, 每個位點(diǎn)檢測到的等位基因數(shù)3—10個不等(均值5.9個); 平均雜合度觀測值(Ho)和期望值(He)分別為0.518和0.681。除2個位點(diǎn)外所有位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)都大于0.5。Hardy-Weinberg平衡檢測表明, 僅4個位點(diǎn)有顯著偏離(P＜0.05), 未檢測到連鎖不平衡現(xiàn)象。這表明轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù)適于烏賊微衛(wèi)星位點(diǎn)的開發(fā), 獲得的SSR標(biāo)記可用于今后烏賊資源遺傳評估和科學(xué)有效管理過程。

曼氏無針烏賊; 轉(zhuǎn)錄組; EST序列; 微衛(wèi)星

曼氏無針烏賊(Sepiella japonica)屬軟體動物門、頭足綱、十腕目、烏賊科、無針烏賊屬種類, 是我國重要的海洋漁業(yè)資源之一, 20世紀(jì)70年代, 我國曼氏無針烏賊年產(chǎn)量曾達(dá) 6萬多噸, 是我國著名的“四大海產(chǎn)”之一(董正之, 1988)。但自20世紀(jì)80年代以來,由于過渡捕撈或海域環(huán)境的破壞, 其資源量嚴(yán)重衰退, 幾近枯竭的邊緣(Lüet al, 2016)。為了恢復(fù)我國曼氏無針烏賊的漁業(yè)資源和產(chǎn)量, 近年來我國陸續(xù)攻克了其規(guī)模化苗種繁育和養(yǎng)殖技術(shù), 人工養(yǎng)殖已在國內(nèi)沿海省份悄然興起, 而其人工增殖放流更是在國內(nèi)得到迅猛開展, 并取得顯著成效(Jianget al,2014; Yanet al, 2016)。然而, 為更好地開展曼氏無針烏賊的繁養(yǎng)及增殖養(yǎng)護(hù)工作, 迫切需要對其現(xiàn)有種群的種質(zhì)狀況和遺傳組成進(jìn)行精確的了解。

微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)是研究物種種質(zhì)狀況和遺傳組成的重要方法, 由于其高度多態(tài)性和共顯性等優(yōu)勢而被廣泛運(yùn)用于物種的群體遺傳結(jié)構(gòu)(Anet al,2014)、種質(zhì)狀況評估(Lüet al, 2013)及遺傳改良研究中(Fujiet al, 2007)。近年來, 有關(guān)曼氏無針烏賊微衛(wèi)星標(biāo)記的開發(fā)已有少量相關(guān)報道(Wuet al, 2010; Guoet al, 2013), 但仍需要開發(fā)出更多的微衛(wèi)星標(biāo)記用于其種質(zhì)和遺傳組成的評估, 同時以往的研究均以DNA建庫和探針雜交富集法進(jìn)行微衛(wèi)星的篩選(Zaneet al, 2002), 但該方法不僅費(fèi)時、費(fèi)力, 而且需要預(yù)先對物種的基因組信息有較好的了解(Wanget al,2012)。近年來, 基于二代高通量測序的出現(xiàn)為快速、高效的進(jìn)行微衛(wèi)星的開發(fā)提供了可能(Csencsicset al,2010), 該技術(shù)可通過一次高通量的測序產(chǎn)生海量的微衛(wèi)星序列, 因而被廣泛運(yùn)用于許多非模式動植物的微衛(wèi)星開發(fā)中(Yuet al, 2011; Zhuet al, 2012)。特別是轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù), 由于成本低, 微衛(wèi)星序列檢出率高, 因而被廣泛運(yùn)用于包括魚類(Teacheret al,2012)、蝦蟹類(Maet al, 2014)、貝類(Patnaiket al,2016)等水生生物的微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)中, 目前采用高通量測序進(jìn)行烏賊等頭足類動物的微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)還未見相關(guān)報道, 本研究擬采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)從海量的 EST序列中篩選微衛(wèi)星序列, 分析其序列組成和特征, 開發(fā)多態(tài)性較強(qiáng)的微衛(wèi)星位點(diǎn)用于其種群遺傳變異分析, 相關(guān)研究成果將為今后我國曼氏無針烏賊資源科學(xué)合理保護(hù)和開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

用于轉(zhuǎn)錄組de novo高通量測序分析的曼氏無針烏賊(Sepiella japonica)鮮活樣品取自浙江省海洋水產(chǎn)研究所西閃養(yǎng)殖基地?；铙w解剖后取肌肉、肝臟、鰓、腦、性腺等組織, 迅速放入液氮中冷凍保存?zhèn)溆?。用于多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)分離與鑒定及群體遺傳多態(tài)度檢測的曼氏無針烏賊樣本取自福建漳州海域的自然群體,共計35只, 取肌肉組織用70%的酒精保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)錄組 EST微衛(wèi)星序列獲取 曼氏無針烏賊組織RNA的提取、cDNA文庫的構(gòu)建參照Teacher等(2012)的方法進(jìn)行。構(gòu)建好的 cDNA文庫在 CBot上進(jìn)行簇生成反應(yīng)(TruSeq PE Cluster Kit V3-cBot-HS,Illumina)后, 采用Illumina Hiseq 2000高通量測序平臺(TruSeq SBS KIT-HS V3, Illumina) 進(jìn)行雙末端測序, 由深圳華大基因科技有限公司完成。獲得的clean reads進(jìn)行De novo 序列拼接和組裝, 采用MISA軟件對拼接得到的序列進(jìn)行微衛(wèi)星的搜索, SSR位點(diǎn)確認(rèn)設(shè)置條件為單堿基類型重復(fù)至少12次, 2堿基類型重復(fù)至少 6 次, 3、4堿基類型重復(fù)至少5次, 6堿基以上類型重復(fù)至少4次。對轉(zhuǎn)錄組EST微衛(wèi)星的類型, 各微衛(wèi)星類型比例及序列特征等進(jìn)行分析和統(tǒng)計。

1.2.2 多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)分離與鑒定 選取二、三堿基重復(fù)單元為主的微衛(wèi)星序列, 采用 primer3設(shè)計微衛(wèi)星引物, 引物合成由上海英俊生物技術(shù)有限公司完成。微衛(wèi)星位點(diǎn)分離時DNA的提取采用傳統(tǒng)的酚、氯仿抽提法; PCR擴(kuò)增采用 25μL的反應(yīng)體系, 內(nèi)含50ng基因組DNA, 1×buffer (Promega, USA), 2mmol/L MgCl2, 0.2mmol/L dNTPs, 0.2μmol/L各引物和1UTaq酶(Promega, USA)。反應(yīng)程序條件為94℃預(yù)變性5min;94℃變性1min, 50—65℃退火1min, 72℃延伸1min,35個循環(huán); 72℃延伸 10min, 各引物退火條件在50—65℃范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化。利用 10個個體進(jìn)行多態(tài)性標(biāo)記的檢測, PCR產(chǎn)物采用毛細(xì)管電泳檢測, 用Genemapper 3.5 (Applied Biosystem)分析產(chǎn)物長度。

1.2.3 群體遺傳多態(tài)度檢測與統(tǒng)計 采用篩選出的多態(tài)性微衛(wèi)星引物對采自福建漳州天然海域的 35只曼氏無針烏賊進(jìn)行SSR擴(kuò)增, 產(chǎn)物經(jīng)電泳、分型后,采用ARLEQUIN3.5.1.3 (Excoffieret al, 2010)軟件統(tǒng)計位點(diǎn)等位基因數(shù)(NA)、觀測雜合度(Ho)、預(yù)期雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)等遺傳變異參數(shù)。采用CERVUS3.0.3 (Marshallet al, 1998)和GENEPOP 4.0.10 (Raymondet al, 1995)檢測各位點(diǎn)等位基因分布是否符合 Hardy-Weinberg平衡(HWE)及各位點(diǎn)是否存在連鎖不平衡。

2 結(jié)果

2.1 曼氏無針烏賊轉(zhuǎn)錄組EST中微衛(wèi)星的序列特征

采用 Illumina測序和 De novo拼接后共獲得了85674個Unigene, 總長66760294nt, 共搜索到47604個微衛(wèi)星序列, 平均每1402nt的EST序列中就含有1個至少12nt的微衛(wèi)星序列, 微衛(wèi)星分布相當(dāng)豐富。對微衛(wèi)星的組成類型和數(shù)量進(jìn)行分析, 結(jié)果表明: 單堿基重復(fù)是曼氏無針烏賊轉(zhuǎn)錄組 EST最主要的微衛(wèi)星類型(38.69%); 其次為三堿基(31.14%)和二堿基(26.35%)重復(fù)類型, 上述三種短序列重復(fù)類型占微衛(wèi)星總量的 96.18%。而長序列類型微衛(wèi)星相對占比很低, 四堿基(3.29%)、五堿基(0.38%)、六堿基(0.14%)的重復(fù)類型總和只占微衛(wèi)星總量的3.82%, 如圖1所示。各堿基類型的微衛(wèi)星中, 不同序列組成的微衛(wèi)星數(shù)量迥異。如圖2所示, 二堿基類型中, AC(54.51%)和 AG(31.22%)是最常見的二堿基重復(fù)形式, 兩者在二堿基類型中的占比達(dá) 85.73%; 而 CG(0.10%)的重復(fù)形式最少, 較低頻率的GC類型可能與胞嘧啶易甲基化, 使其因脫氨基作用而變成胸腺嘧啶有關(guān)(Schorderetet al, 1992)。而三堿基類型中各堿基組成形式差異相對較小, AGC(16.37%)和AAC(14.06%)是最常見的三堿基重復(fù)形式, 其次為 ATC(13.72%)、ACC(13.07%)、AAT(10.67%)、ACT(10.27%)、AGG(9.62%)、AAG(9.52%),而 ACG(1.99%)和 CCG(0.72%)類型則最少。

圖1 曼氏無針烏賊轉(zhuǎn)錄組EST中1-6堿基類型微衛(wèi)星的組成Fig.1 The percentages of mono-, di-, tri-, tetra-, quad-, penta-,and hexa-nucleotide repeats in SSR motif sequences in S.japonica transcriptome EST

各堿基類型的微衛(wèi)星在重復(fù)次數(shù)變異上也存在巨大差別。如表1所示, 二堿基類型中重復(fù)次數(shù)變異6—11次不等, 而三堿基類型的重復(fù)次數(shù)變異范圍為5—8次; 四堿基和五堿基類型的重復(fù)次數(shù)僅5—6次和4—5次; 六堿基類型中未發(fā)現(xiàn)有重復(fù)次數(shù)的變異,均為重復(fù)4次, 表明各堿基類型隨著堿基數(shù)的增加存在的變異也逐漸減少。同時, 轉(zhuǎn)錄組中微衛(wèi)星均以最低重復(fù)數(shù)的序列最多, 如在二堿基類型中, 最低重復(fù)數(shù) 6的微衛(wèi)星數(shù)量最多, 占所有二堿基類型的35.04%。三堿基類型中, 最低重復(fù)數(shù)5的微衛(wèi)星數(shù)量最多, 占所有三堿基類型的53.85%。隨著重復(fù)數(shù)的增加, 相應(yīng)微衛(wèi)星的數(shù)量逐級減少。

圖2 曼氏無針烏賊轉(zhuǎn)錄組EST中二、三堿基類型微衛(wèi)星的序列組成情況Fig.2 Observed counts of identified microsatellite loci for different repeat sequence motifs of di- and trinucleotide repeats in S.japonica transcriptome EST

2.2 曼氏無針烏賊多態(tài)微衛(wèi)星位點(diǎn)的分離及多態(tài)性分析

共篩選了121對二、三堿基類型為主的微衛(wèi)星引物, 僅 65對引物能穩(wěn)定擴(kuò)增出清晰、可辨的微衛(wèi)星條帶, 其中具多態(tài)位點(diǎn)的微衛(wèi)星數(shù)達(dá)24對。采用24對微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)對采自福建漳州海域的35只曼氏無針烏賊個體進(jìn)行遺傳變異和多態(tài)性檢測, 結(jié)果如表2所示: 24對引物共擴(kuò)增得到142個等位基因, 每個位點(diǎn)的等位基因數(shù)(Na)3—10不等, 平均 5.92個等位基因。雜合度觀測值(Ho)在 0.030—0.857之間, 均值為 0.518, 雜合度預(yù)期值(He)在 0.420—0.826之間,均值為 0.681。多態(tài)信息含量(PIC)在 0.3863—0.8728之間。除位點(diǎn)CL2235-2 (PIC=0.3863)、CL899(0.4009)外, 所有位點(diǎn)的 PIC值都大于 0.5, 顯示了較高的多態(tài)性。二、三堿基類型微衛(wèi)星相比, 二堿基微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性無論是位點(diǎn)等位基因數(shù)(Na)、雜合度(He)、多態(tài)信息含量(PIC)等參數(shù)都明顯比三堿基高, 并且在He和PIC上的差異達(dá)到顯著(P＜0.05)。不同重復(fù)次數(shù)的微衛(wèi)星相比, 重復(fù)次數(shù)越高的微衛(wèi)星其多態(tài)性也越高, 但僅在位點(diǎn)等位基因數(shù)(Na)差異上達(dá)到顯著水平(P＜0.05), 如表3所示。經(jīng)檢測, 有4個位點(diǎn)明顯偏離Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05); 經(jīng)連鎖不平衡檢測, 所有位點(diǎn)均未檢測到明點(diǎn)的連鎖不平衡現(xiàn)象(P＞0.05)。

表1 曼氏無針烏賊轉(zhuǎn)錄組EST中各種微衛(wèi)星類型的重復(fù)數(shù)變異Tab.1 The repeating number of di-, tri-, quad-, penta-, and hexa-nucleotide repeats in SSR motif sequences in S.japonica transcriptome EST

3 討論

從本研究的結(jié)果可以看出, 基于轉(zhuǎn)錄組的高通量測序是非?？焖佟⒏咝У暮Ｑ箢^足類微衛(wèi)星分離方法。本研究之前, 僅有約 25對曼氏無針烏賊的微衛(wèi)星標(biāo)記被成功開發(fā)(Wuet al, 2010; Guoet al, 2013),而利用de novo轉(zhuǎn)錄組高通量測序技術(shù), 我們共獲得了85674個Ungene, 基因序列總長66760294nt, 共搜索到47604個微衛(wèi)星序列, 平均每1402nt的EST就有一個不少于 12nt的微衛(wèi)星序列。大部分序列都含有完整的適于微衛(wèi)星引物設(shè)計的兩翼序列, 并可用于今后的微衛(wèi)星標(biāo)記大規(guī)模開發(fā)中, 這些微衛(wèi)星序列幾乎是之前采用DNA建庫和探針雜交富集法獲得的微衛(wèi)星序列的上千倍。這也許就是為什么近年來高通量測序技術(shù)越來越多地被用于微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)之中的原因。

除快速、高效之外, 高通量測序技術(shù)還提供了傳統(tǒng)方法無法提供的微衛(wèi)星基因組序列特征, 而這些微衛(wèi)星基因組序列信息可為更有效地篩選微衛(wèi)星目標(biāo)序列、設(shè)計引物, 更快速地篩選高多態(tài)性的微衛(wèi)星標(biāo)記提供了良好的基礎(chǔ)。如由研究結(jié)果可知, 一、二、三堿基是最主要基因組微衛(wèi)星堿基類型, 四、五、六堿基則相對稀少; 呈現(xiàn)出隨著堿基數(shù)量的增加, 微衛(wèi)星數(shù)量逐步減少的現(xiàn)象, 這與已知的許多真核生物的基因組微衛(wèi)星組成情況類似(Chistiakovet al, 2006;Zhuet al, 2012), 這就提示我們在曼氏無針烏賊微衛(wèi)星標(biāo)記規(guī)模化開發(fā)時, 二、三堿基的微衛(wèi)星類型可能是最主要的篩選對象。同時二、三堿基的微衛(wèi)星類型相比, 二堿基微衛(wèi)星的重復(fù)次數(shù)從6—12共7種類型,而三堿基微衛(wèi)星的重復(fù)次數(shù)僅 5—8共 4種類型, 二堿基比三堿基微衛(wèi)星具有更多的變異類型, 暗示二堿基也可能比三堿基微衛(wèi)星標(biāo)記具有更高的多態(tài)性,而該結(jié)果也得到了后續(xù)實(shí)驗結(jié)果的證實(shí), 二堿基微衛(wèi)星無論在He和 PIC上都顯著高于三堿基(P＜0.05),這也提示為了更有效地篩選多態(tài)性微衛(wèi)星標(biāo)記, 二堿基類型將是首選的篩選對象。另外, 不同重復(fù)次數(shù)的微衛(wèi)星相比, 重復(fù)次數(shù)越高的微衛(wèi)星其多態(tài)性也越高, 如圖2所示。該結(jié)果與前人在哺乳動物包括人類中的研究結(jié)果相似(Kelkaret al, 2008), 這也告訴我們, 在曼氏無針烏賊的微衛(wèi)星開發(fā)中, 選擇重復(fù)次數(shù)高的微衛(wèi)星將是提高微衛(wèi)星多態(tài)性的有效方法。

本研究共篩選出 24對多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn), 并用于檢測來自福建漳州的曼氏無針烏賊自然群體的遺傳多態(tài)性。結(jié)果表明, 漳州曼氏無針烏賊自然群體仍存在較高的遺傳多樣性。24個位點(diǎn)的等位基因數(shù)(NA)3—10不等, 平均5.92個等位基因。雜合度觀測值(Ho)在 0.030—0.857之間, 雜合度預(yù)期值(He)在0.420—0.826之間, 多態(tài)信息含量(PIC)在 0.3863—0.8728之間。該結(jié)果與Guo等(2013)以DNA測序為基礎(chǔ)的生物素磁珠法開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)性大致相當(dāng), 而略低于 Wu等(2010)以尼龍膜雜交法開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記的多態(tài)性。但應(yīng)該指出的是Guo等(2013)研究的群體是福建寧德的自然群體, 與本研究的福建漳州自然群體所處海區(qū)接近, 而 Wu等(2010)研究的群體為廣東湛江群體。該結(jié)果說明, 采用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)獲得的微衛(wèi)星多態(tài)性也可與DNA測序獲得的微衛(wèi)星多態(tài)性相當(dāng), 而與過去認(rèn)為的編碼區(qū)域的微衛(wèi)星多態(tài)性一般較非編碼區(qū)域的微衛(wèi)星多態(tài)性低的看法相異(Mochmannet al, 2004; Pearsonet al, 2005),而與Kelkar等(2008)哺乳動物如人與大猩猩中的結(jié)果類似。因此該結(jié)果再一次說明轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)是一種高效快捷的微衛(wèi)星標(biāo)記開發(fā)方法。經(jīng)檢測24個微衛(wèi)星位點(diǎn)無明顯的連鎖不平衡現(xiàn)象(P＞0.05), 僅 4個顯著偏離Hardy-Weinberg平衡(P＜0.05), 這些新開發(fā)的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)可為今后曼氏無針烏賊漁業(yè)資源的科學(xué)管理和保護(hù)提供有力的遺傳學(xué)評估手段。

表2 曼氏無針烏賊24對微衛(wèi)星多態(tài)位點(diǎn)特征Tab.2 Characteristics of 24 microsatellite loci developed for S.japonica

表3 不同堿基數(shù)和重復(fù)次數(shù)對微衛(wèi)星多態(tài)性的影響Tab.3 The influence of repeat motif and repeat number on the polymorphic level of microsatellite markers

4 結(jié)論

本研究的結(jié)果表明, 基于轉(zhuǎn)錄組的高通量測序技術(shù)是海洋頭足類微衛(wèi)星標(biāo)記高效開發(fā)的理想方法。與傳統(tǒng)的DNA建庫和探針雜交富集法開發(fā)微衛(wèi)星標(biāo)記相比, 其不僅快速、高效, 而且開發(fā)的微衛(wèi)星多態(tài)性也與傳統(tǒng)方法相當(dāng)。本研究篩選出的24對多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)可用于今后烏賊資源遺傳評估和科學(xué)有效管理過程。

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ISOLATION AND ANALYSIS ON EST MICROSATELLITES OFSEPIELLA JAPONICABY DE NOVO HIGH-THROUGHPUT TRANSCRIPTOME SEQUENCING

Lü Zhen-Ming1, HOU Long1, GONG Li1, LIU Li-Qin1, CHEN Yong-Jiu1, GUO Bao-Ying1,DONG Ying-Hui2, WU Chang-Wen1
(1.National and Provincial Joint Laboratory of Exploration and Utilization of Marine Aquatic Genetic Resources,Zhejiang Ocean University,Zhoushan316022,China; 2.Zhejiang Key Laboratory of Aquatic Germplasm Resources,Zhejiang Wanli University,Ningbo315100,China)

A total of 47604 microsatellite sequences fromSepiella japonicatranscriptome was obtained and analyzed by next-generation sequencing.The results show that there were abundant SSR sequences in transcriptome ofS.japonicaand, in average, 1402nt EST sequence would contain a SSR in length of no less than 12 nucleotides.The mono-nucleotides SSR is the main type of microsatellites (38.69%), followed by tri-nucleotide (31.14%), di-nucleotide (26.35%),quad-nucleotide (3.29%), penta-nucleotide (0.38%), and hexa-nucleotide (0.14%) microsatellites.The shorter repeats accounted for 96.18% of the total quantity of the microsatellite sequences.Among di-nucleotide repeats, AC (54.51%) and AG (31.22%) were most common, while among tri- nucleotide repeats, AGC (16.37%) and AAC (14.06%) were most frequent.Twenty-four polymorphic microsatellites were isolated and tested in 35 cuttlefish individuals collected from a natural population in Zhangzhou sea area, Fujian province.The results show that the number of alleles per locus ranged from 3 to 10 and the mean allelic richness was 5.9; the mean observed heterozygosities (Ho) and expected heterozygosities(He) were 0.518 and 0.681, respectively.The polymorphic information content (PIC) values of all loci, except for two, were above 0.5.A Hardy-Weinberg equilibrium test revealed significant deviation in 4 of the 24 microsatellite loci after sequential Bonferroni corrections (P＜0.05).Linkage disequilibrium was not observed between any pair of loci, indicating that the markers were independent.Therefore, this microsatellite isolation method is cost and time effective in comparison to traditional approaches.The SSR markers isolated will be useful in future’s genetic evaluation process of this species,which is essential for a sound management of cuttlefish fishery resources.

Sepiella japonica; transcriptome; EST sequence; microsatellites

Q789; S931

10.11693/hyhz20170300079

* 國家自然科學(xué)基金項目, 41406138號; 浙江省自然科學(xué)基金項目, LY130190001號; 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗室開放課題, KF201-6008號。呂振明, 博士研究生, 教授, E-mail: nblzmnb@163.com

① 通訊作者: 董迎輝, 博士, 副教授, E-mail: 15067427669@126.com

2017-03-29, 收修改稿日期: 2017-04-23