遲緩型愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)誘導(dǎo)牙鲆(Paralichthys olivaceus)TLR1及TLR2基因的表達(dá)分析*

李慶亞 周 密 張 潔 鄭津輝 耿緒云 潘寶平孫金生, 高 虹①

(1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津市動植物抗性重點實驗室 天津 300387; 2.天津市水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中心天津 300221)

遲緩型愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)誘導(dǎo)牙鲆(Paralichthys olivaceus)TLR1及TLR2基因的表達(dá)分析*

李慶亞1周 密1張 潔1鄭津輝1耿緒云2潘寶平1孫金生1,2高 虹1①

(1.天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 天津市動植物抗性重點實驗室 天津 300387; 2.天津市水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中心天津 300221)

Toll樣受體是一類重要的蛋白質(zhì)分子, 參與固有免疫系統(tǒng), 在哺乳動物在受到細(xì)菌感染的時候, TLR1和TLR2基因可以形成異源二聚體, 進而啟動宿主的固有免疫。本文應(yīng)用實時熒光定量PCR的技術(shù), 檢測了 TLR1和 TLR2基因在牙鲆健康組織以及牙鲆腹腔注射遲緩型愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)后各組織中的表達(dá)變化, 并探討了它們與牙鲆(Paralichthys olivaceus)固有免疫反應(yīng)的關(guān)系。結(jié)果表明, TLR1和TLR2基因廣泛表達(dá)于健康牙鲆的各種組織中, 其中, TLR1在脾臟組織中表達(dá)量最高, 其次是心臟、肌肉; TLR2在小腸組織中表達(dá)量最高, 其次是肝臟、心臟。免疫刺激實驗表明, 多數(shù)組織在感染病原 6h后 TLR1基因表達(dá)達(dá)到峰值, 其中脾臟中基因的表達(dá)量最大,是0時間點的290倍(P＜0.01)。TLR2基因在感染病原1h后在脾臟中表達(dá)量最高, 為0時間點的17.8倍(P＜0.01), 在感染病原 1d后心臟組織中基因的表達(dá)量為對照組的 14倍(P＜0.01), 其余時間點表達(dá)變化不明顯。結(jié)果表明TLR1和TLR2參與了牙鲆對遲緩型愛德華氏菌的免疫應(yīng)答反應(yīng)。實驗結(jié)果還顯示, 在牙鲆感染遲緩型愛德華氏菌后, MyD88、TNF-α和IL-1基因的表達(dá)也都同步上調(diào), 暗示遲緩型愛德華氏菌有可能通過TLR1通路上調(diào)MyD88的表達(dá), 并最終導(dǎo)致炎癥因子TNF-α和IL-1的基因表達(dá)上調(diào), 以應(yīng)答病原菌的感染。

TLR1; TLR2; 牙鲆; 遲緩型愛德華氏菌; 表達(dá); 實時熒光PCR

牙鲆(Paralichthys olivaceus)屬于硬骨魚綱, 俗稱比目魚, 亦稱“牙片”, 是一種重要的海水養(yǎng)殖魚類(鮑寶龍等, 1999)。隨著養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的高密度集約化,牙鲆生長的相關(guān)疾病造成的影響日趨嚴(yán)重, 導(dǎo)致了水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的極大障礙, 各地養(yǎng)殖場也面臨了巨大的經(jīng)濟損失(王建波, 2010), 因此人們越來越關(guān)注牙鲆水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。

Toll樣受體(Toll-like receptor, TLRs)是模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR)家族中的一種,識別脂多糖, 酵母多糖以及病原微生物的核酸等保守分子, 有著辨別和傳遞信息的作用(王海坤等, 2006;王德成等, 2008; 范澤軍等, 2015)。與大多數(shù)脊椎動物不同, TLR1家族并不是單一的遺傳因子, 往往具有多重和同源性。在TLR家族中, 根據(jù)分子進化樹的分支關(guān)系, 又可分為六個亞家族, 哺乳動物的 TLR1亞家族包括4個成員, 分別是 TLR1、TLR2、TLR6和TLR10 (Roachet al, 2005)。而在魚類中沒有TLR6和TLR10, 但魚類有其特有的基因, 如TLR20、TLR21、TLR22、TLR23 (Gaoet al, 2013)。通常TLR1基因和TLR2基因是以異質(zhì)二聚體的形式存在的, 可識別各類脂蛋白。

在牙鲆的內(nèi)臟組織中, 脾臟、頭腎、腸和肝臟四種組織與魚類的免疫系統(tǒng)有著密切的聯(lián)系。其中脾臟中的淋巴小泡中有很多與免疫作用相關(guān)的重要細(xì)胞,例如淋巴細(xì)胞、巨峰細(xì)胞等; 而頭腎在免疫系統(tǒng)應(yīng)答中有著非常重要的作用, 是免疫細(xì)胞的重要發(fā)源地;而腸黏膜則富含與免疫相關(guān)的淋巴組織, 肝臟則是基因表達(dá)的重要器官。

遲緩型愛德華氏菌(Edwardsiella tarda)是一種革蘭氏陰性菌, 在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)是極具危害的, 在牙鲆水產(chǎn)養(yǎng)殖中, 愛德華氏菌病是影響牙鲆健康生長的主要的傳染病之一。全面深入地研究牙鲆對該病原菌免疫應(yīng)答的分子機理, 將為建立一種有效的、能夠預(yù)防和控制E.tarda感染的免疫防治新措施提供理論基礎(chǔ)。前期研究組克隆了牙鲆TLR1基因的cDNA全長序列(Wuet al, 2012), 本研究繼續(xù)以TLR1及TLR2基因為研究對象, 利用實時熒光定量 PCR技術(shù)檢測分析了遲緩型愛德華氏菌感染健康牙鲆后, TLR1和TLR2基因表達(dá)量的情況變化。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗魚 健康牙鲆購買于天津某養(yǎng)魚場,體長 10—12cm, 將牙鲆放置于大小適中的水循環(huán)箱中, 調(diào)節(jié)鹽度(17—18)和溫度(20±2)°C (Wuet al, 2012;張潔等, 2015), 使其充分適應(yīng)生活環(huán)境。魚箱上方遮光, 避免直射, 每日投放魚飼料一次。

1.1.2 病原體 本次試驗病原刺激采用的是遲緩型愛德華氏菌。遲緩型愛德華氏菌是革蘭氏陰性菌,由天津市水產(chǎn)養(yǎng)殖病害防治中心從患病的牙鲆魚體上分離并鑒定, 由本實驗室保存。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)菌培養(yǎng) 在超凈臺上將遲緩型愛德華氏菌接種于LB培養(yǎng)基中(pH=7), 37°C培養(yǎng), 6000r/min離心 2min, 用無菌的 PBS緩沖液充分洗滌, 再次離心, 保存于PBS緩沖液中, 調(diào)整濃度107CFU/mL。

1.2.2 牙鲆免疫 將制備好的遲緩型愛德華氏菌注射到健康牙鲆體內(nèi), 每尾注射100μL, 由腹腔注射,對照組注射PBS緩沖液100μL, 分別于感染后0h, 1h,3h, 6h, 12h, 1d, 3d, 6d后, 每組隨機取出3尾進行解剖, 于超凈臺上分離各組織。

1.2.3 RNA的提取和純化 將上述解剖分離的各組織, 用天平稱取 50—100mg, 放入玻璃勻漿器中,加入1mL的Trizol充分研磨提取RNA, 12000r/min,4°C離心 10min, 取上清, 靜止 5min, 加入 200μL的氯仿, 震蕩15s, 靜止5min, 12000r/min, 4°C, 15min離心, 去上層水相, 加入 500 mL異丙醇, 混勻, 靜置10min, 12000r/min, 4°C, 離心 10min, 取沉淀, 倒置空干, 加入1mL 75%乙醇, 7500r/min, 4°C, 離心5min,取沉淀, 加入 20μL DEPC水溶解, 水浴 55°C, 5min,放置在–80°C冰箱備用。

1.2.4 cDNA鏈的合成 購買于 Sangon Biotech?公司的 cDNA試劑盒, 按照其推薦的方法, 用于TLR1基因和TLR2基因cDNA第一鏈的合成。反應(yīng)體系包括: RNA 2μg, 隨機六合引物(0.2μg/μL) 1μL,RNase free ddH2O, 5×Reaction Buffer 4μL, dNTP Mix(10mmol/L) 2μL, RNase Inhibitor (20U/μL) 1μL,M-MuLV RT (200U/μL) 1μL, 擴增體積總體積是20μL。

1.2.5 基因的定量表達(dá) 使用ABI 7500熒光PCR儀, 以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板, 獲得各組織的免疫相關(guān)基因的定量表達(dá)數(shù)據(jù)。使用 Promega?公司的GoTaq?qPCR Master Mix推薦的使用方法, 反應(yīng)體系為 cDNA 模版 4μL, 上游引物(10μmol/L) 0.4μL, 下游引物(10μmol/L) 0.4μL, GoTaq?qPCR Master Mix 10μL, Nuclease-Free Water 9.2μL。反應(yīng)總體積是 24μL,各組織樣品設(shè)3個重復(fù), 用2–ΔΔCT的方法進行相對定量分析, 用Origin 8軟件作柱狀圖分析。表1為實驗所使用的引物序列。

表1 Real-Time RT-PCR所使用的各基因特異性引物Tab.1 The specific primers of each gene used for Real-Time RT-PCR

2 結(jié)果

2.1 牙鲆健康組織中TLR1和TLR2的表達(dá)分布

TLR1和TLR2基因在健康牙鲆體內(nèi)廣泛表達(dá)于所測試的七種組織中。TLR1基因在脾臟組織中基因的相對表達(dá)量最高, 其次是心臟、肌肉, 如圖1; TLR2在小腸組織中基因的相對表達(dá)量最高, 其次是肝臟、心臟、肌肉, 如圖2。

圖1 TLR1在牙鲆健康組織中的相對表達(dá)量Fig.1 Relative expression of P.olivaceus TLR1 in various tissues

圖2 TLR2在牙鲆健康組織中的相對表達(dá)量Fig.2 Relative expression of P.olivaceus TLR2 in various tissues

2.2 免疫刺激后TLR1和TLR2基因的表達(dá)

TLR1基因在牙鲆刺激遲緩型愛德華氏菌后, 各中組織中基因的相對表達(dá)量呈先增高后降低的趨勢?；驹诟腥具t緩型愛德華氏菌6h后, TLR1基因的相對表達(dá)量出現(xiàn)最高峰, 之后整體呈下降趨勢。在心臟組織中, 牙鲆在注射致病菌 6h后表達(dá)量出現(xiàn)第一個高峰, 為對照組的 5.8倍, 之后相對表達(dá)量降低, 但在 1d時表達(dá)量出現(xiàn)最高峰, 為對照組的 9.8倍(P＜0.01)。如圖 3, 差異顯著(P＜0.05)和差異極顯著(P＜0.01)分別用“*”和“**”表示。在脾臟組織中 TLR1基因相對表達(dá)量變化最明顯。在脾臟組織中, 感染致病菌 1h后, TLR1基因相對表達(dá)量出現(xiàn)第一個高峰,為對照組的90倍(P＜0.01), 在免疫6h后, 基因相對表達(dá)量達(dá)到最高峰, 與對照組相比, 相對表達(dá)量為 290倍(P＜0.01), 之后 TLR1基因的相對表達(dá)量逐漸降低,如圖4。在頭腎、小腸、肌肉組織中, 牙鲆免疫6h后,TLR1基因的相對表達(dá)量出現(xiàn)最高峰, 分別是是對照組的 20倍(P＜0.01)、11倍(P＜0.01)、8.5倍(P＜0.01), 如圖5、圖6、圖7。而牙鲆的鰓組織與其他組織不同, 在鰓組織中, 牙鲆免疫 1h后表達(dá)量出現(xiàn)第一個高峰,與對照組比較, 基因的相對表達(dá)量是對照組的4.5倍(P＜0.05), 而牙鲆在免疫3h后, TLR1的相對表達(dá)量出現(xiàn)最高峰, 為對照組的9倍(P＜0.01), 如圖8。

圖3 TLR1和TLR2 在受E.tarda刺激后在心臟中的表達(dá)量變化Fig.3 Relative expression of P.olivaceus TLR1 and TLR2 in the heart after infection by E.tarda

圖4 TLR1和TLR2在受E.tarda刺激后在脾臟中的表達(dá)量變化Fig.4 Relative expression of P.olivaceus TLR1 and TLR2 in the spleen after infection by E.tarda

圖5 TLR1和TLR2 在受E.tarda刺激后在頭腎中的表達(dá)量變化Fig.5 Relative expression of P.olivaceus TLR1 and TLR2 in the head kidney after infection by E.tarda

圖6 TLR1和TLR2 在受E.tarda刺激后在小腸中的表達(dá)量變化Fig.6 Relative expression of P.Olivaceus TLR1 and TLR2 in the intestine after infection by E.tarda

圖7 TLR1和TLR2在受E.tarda刺激后在肌肉中的表達(dá)量變化Fig.7 Relative expression of P.Olivaceus TLR1 and TLR2 in the muscle after infection by E.tarda

TLR2基因在牙鲆刺激遲緩型愛德華氏菌后, 在脾臟、心臟, 肌肉和小腸中的相對表達(dá)量的變化比較明顯, 整體呈先增高后降低的趨勢。在肝臟(圖 9)、腎臟和鰓組織中, TLR2基因的相對表達(dá)量變化不明顯。在脾臟組織中, 在刺激1h后, 表達(dá)量出現(xiàn)第一個高峰, 表達(dá)量是對照組的24倍(P＜0.01), 之后表達(dá)量下調(diào), 基本趨于穩(wěn)定。在心臟組織中, TLR2在刺激6h后相對表達(dá)量出現(xiàn)第一個高峰, 為對照組的 4倍(P＜0.05), 之后在刺激1d后, 基因相對表達(dá)量達(dá)到峰值, 是對照組的 14.5倍(P＜0.01), 之后 TLR2基因的表達(dá)量下降。在小腸組織中, 刺激3h后, TLR2基因的表達(dá)量出現(xiàn)最高峰, 為對照組的8.5倍(P＜0.01), 之后表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào), 最后相對表達(dá)量穩(wěn)定在 0時以下。在肌肉組織中, TLR2基因相對表達(dá)量的變化也比較明顯, 在刺激致病菌 3h后, 相對表達(dá)量出現(xiàn)峰值, 為對照組的 8.5倍(P＜0.01), 之后表達(dá)量出現(xiàn)下調(diào)。而在肝臟組織中, TLR2基因也出現(xiàn)了下調(diào)的趨勢。在感染致病菌 6h后, 相對表達(dá)量是沒有變化的, 而在其他時間點, 相對表達(dá)量基本穩(wěn)定在0時左右。圖10、圖11分別總結(jié)了牙鲆在腹腔注射E.tarda后各組織中TLR1及TLR2基因的時空表達(dá)變化。

圖8 TLR1和TLR2在受E.tarda刺激后在鰓中的表達(dá)量變化Fig.8 Relative expression of P.olivaceus TLR1 and TLR2 in the gill after infection by E.tarda

圖9 TLR1和TLR2 在受E.tarda刺激后在肝臟中的表達(dá)量變化Fig.9 Relative expression of P.olivaceus TLR1 and TLR2 in the liver after infection by E.tarda

圖 10總結(jié)了遲緩型愛德華氏菌感染牙鲆后TLR1及TLR2在各組織中的表達(dá)變化差異?？梢钥闯鯰LR1在脾臟中的表達(dá)上調(diào)最顯著, 說明脾臟是牙鲆應(yīng)答遲緩型愛德華氏菌的重要免疫器官。TLR2在脾臟、小腸和心臟中也有較高的表達(dá)上調(diào)。

圖10 牙鲆腹腔注射E.tarda后各組織中TLR1(A)和TLR2(B)的表達(dá)量變化Fig.10 Relative expression of P.olivaceus TLR1 (A) and TLR2 (B) in various tissues after infection by E.tarda in different durations

2.3 免疫刺激后MyD88基因的表達(dá)

MyD88是髓樣分化因子(myeloid differentiation factor 88), 在TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中起著非常重要的作用, 是 TLR基因家族的關(guān)鍵接頭分子(姜華,2010), 它可以介導(dǎo) TLR 所有的信號傳導(dǎo), 除TLR3外(Bonnertet al, 1997; Akiraet al, 2006)。在 MyD88介導(dǎo)的TLR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中, IRAK家族和MyD88相互作用進而募集TRAF6, 導(dǎo)致NF-KB, MAPK或JNK的激活, 誘導(dǎo)一些如TNF的細(xì)胞因子及其他前炎癥因子的產(chǎn)生, 進而激發(fā)一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)。為了檢驗 MyD88是否也參與了遲緩型愛德華氏菌的感染應(yīng)答反應(yīng), 我們又測試了MyD88基因在牙鲆三個重要的免疫器官中的表達(dá)變化。實驗結(jié)果表明,在脾臟組織中, MyD88基因的表達(dá)量增加較明顯,在免疫3h后出現(xiàn)最高峰, 表達(dá)量是對照組的18倍(P＜0.01), 之后表達(dá)量降低, 但表達(dá)量仍高于對照組。在腎臟組織中, MyD88基因在免疫 6h后基因表達(dá)量出現(xiàn)最高峰, 表達(dá)量是對照組的 12倍(P＜0.01), 之后表達(dá)量逐漸降低, 在免疫 1d后, 基因的表達(dá)量是對照組的 6.5倍(P＜0.01)。在牙鲆鰓組織中, 在免疫 3h后MyD88的表達(dá)出現(xiàn)上調(diào), 表達(dá)量是對照組的10倍(P＜0.01); 在免疫3d后, 基因的表達(dá)量達(dá)到最高峰, 是對照組的 10.5倍(P＜0.01)。結(jié)果如圖 11。

圖11 牙鲆E.tarda感染后MyD88基因的表達(dá)變化Fig.11 Relative expression of P.olivaceus MyD88 after infection by E.tarda

2.4 免疫刺激后TNF-α和IL-1的表達(dá)

細(xì)胞因子是一種構(gòu)成免疫系統(tǒng)的重要介質(zhì), 主要由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激后分泌的可溶性小分子蛋白質(zhì)。細(xì)胞因子作為在免疫系統(tǒng)中細(xì)胞間相互作用的信號分子、與細(xì)胞膜上受體結(jié)合后可以發(fā)揮多種生物效應(yīng), 在免疫調(diào)節(jié)、免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)中有著非常重要的作用(朱立祥, 2010)。參與免疫反應(yīng)的細(xì)胞因子主要有腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素(IL)、干擾素(INF)等。許多炎癥細(xì)胞因子也有著非常重要的作用, 例如 TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8等。為了進一步檢測 TLRs信號通路下游炎癥因子的應(yīng)答反應(yīng), 實驗還測定了 TNF-α、IL-1基因的表達(dá)變化。

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor, TNF)可以抑制和殺傷腫瘤細(xì)胞, 主要由活化的單核/巨噬細(xì)胞產(chǎn)生, 它可以促進中性粒細(xì)胞吞噬, 抗感染, 會引起發(fā)熱, TNF會誘導(dǎo)肝細(xì)胞急性期蛋白合成(井遠(yuǎn)方, 2013),進而促進髓樣白血病細(xì)胞向巨噬細(xì)胞分化, 誘導(dǎo)細(xì)胞增殖分化, 并參與某些自身免疫病的病理損傷, 是一類重要的炎癥因子。實驗結(jié)果表明, 在脾臟組織中,TNF-α的表達(dá)上調(diào)比較明顯, 在免疫1h后達(dá)到峰值,相對表達(dá)量是對照組的 300倍(P＜0.01), 之后表達(dá)量緩慢降低, 但表達(dá)量仍高于對照組。在腎臟組織中,TNF-α的表達(dá)在免疫 1h后出現(xiàn)第一個表達(dá)高峰, 表達(dá)量是對照組的 400倍(P＜0.01), 之后表達(dá)量沒有明顯的變化。在牙鲆鰓組織中, 在免疫 1h后牙鲆的表達(dá)量出現(xiàn)第一個表達(dá)高峰, 表達(dá)量是對照組的130倍(P＜0.01); 在免疫6h后, TNF-α的表達(dá)量是對照組的225 倍(P＜0.01)。

白細(xì)胞介素(interleukin, IL)是一類由白細(xì)胞產(chǎn)生又在白細(xì)胞間發(fā)揮作用的細(xì)胞因子。IL-1可以調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫激活, 是一種起著致熱作用的熱原質(zhì)成分, 也是一種重要的介導(dǎo)炎癥炎性介質(zhì)。抗原、內(nèi)毒素、細(xì)菌及病毒等都可以作為刺激因子誘導(dǎo)IL-1, 在慢性和急性炎癥的致病過程中發(fā)揮重要作用。實驗結(jié)果表明,在頭腎組織中, IL-1的表達(dá)比較明顯, 在免疫1h后表達(dá)出現(xiàn)峰值, 表達(dá)量是對照組的 305倍(P＜0.01); 在免疫6h后, 表達(dá)量是對照組的370倍(P＜0.01), 之后表達(dá)量平緩, 但表達(dá)量仍高于對照組。在脾臟組織中,IL-1的表達(dá)量在免疫 1h后出現(xiàn)第一個高峰, 與對照組相比, 表達(dá)量是對照組的75倍(P＜0.01), 之后表達(dá)量趨于穩(wěn)定。在牙鲆鰓組織中, 在免疫 6h后表達(dá)量出現(xiàn)第一個表達(dá)高峰, 與對照組比較, 表達(dá)量是對照組的30倍(P＜0.01)。結(jié)果如圖12。

圖12 TNF-α和IL-1在牙鲆感染E.tarda后的表達(dá)量變化Fig.12 Relative expression of P.olivaceus TNF-α and IL-1 after infection by E.Tarda

3 討論

Toll樣受體是在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的, 作為一種重要的受體, 在果蠅的發(fā)育和天然免疫中發(fā)揮抗微生物感染的作用。被報道的TLR1基因組結(jié)構(gòu)表明, 在目前的研究中一些相關(guān)內(nèi)含子的變異現(xiàn)象并沒有被證實。研究表明, 斑馬魚的TLR1基因中含有一個內(nèi)含子(Wuet al, 2008), 但在其他被報道的哺乳類、雞和硬骨魚類中不具有內(nèi)含子(Wuet al, 2008; Paltiet al,2010; Reblet al, 2010)。這些是否是由于物種差異造成的還需要進一步被證實。而TLR2基因是TLR家族在先天免疫中發(fā)揮作用的關(guān)鍵成員。在哺乳動物中,TLR2可以觸發(fā) MyD88依賴性信號傳導(dǎo)誘導(dǎo)的各種細(xì)胞因子應(yīng)答, 也可識別一些特定的微生物的結(jié)構(gòu)(Liet al, 2016)。TLR2可以與TLR1和TLR6形成異質(zhì)二聚體和同源二聚體, 識別各種不同的病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular patterns,PAMPs) (Fanet al, 2015)。

目前, 許多研究都致力于魚類免疫相關(guān)基因的克隆和應(yīng)用鑒定, 解析這些基因的分子結(jié)構(gòu), 通過免疫刺激實驗來研究各基因在組織中的表達(dá), 以期獲得該基因功能的相關(guān)信息。TLR1和TLR2是牙鲆體內(nèi)重要的免疫相關(guān)基因, 在牙鲆體內(nèi)它們的轉(zhuǎn)錄是否受遲緩型愛德華氏菌的調(diào)節(jié), 目前在國內(nèi)還沒有相關(guān)報道。TLR1和TLR2基因雖然在一些魚類中已經(jīng)被克隆鑒定, 如河豚、斑馬魚(Jaultet al, 2004;Meijeret al, 2004), 但目前可檢索到的基因功能方面的研究還是有限的: 有研究顯示脂多糖刺激河豚后可使 TLR1基因的表達(dá)增加(Wuet al, 2008); 虹鱒TLR1基因的表達(dá)不受脂蛋白刺激的影響, 但脂多糖卻能上調(diào)該基因的表達(dá)(Paltiet al, 2010); 斜帶石斑魚用脂多糖、Poly(I:C), 以及鰻弧菌分別刺激后,TLR1和 TLR2基因表達(dá)都發(fā)生了上調(diào)(Weiet al,2011); 鯰魚經(jīng)遲緩型愛德華氏菌刺激后, TLR2基因在頭腎中表達(dá)略微下調(diào), 在脾中先下調(diào)后上調(diào)(Baoprasertkulet al, 2007)。可見, 在哺乳動物與魚類之間, TLR1和TLR2所識別的配體存在一定差異, 在哺乳動物中, TLR1和TLR2主要識別的配體是脂蛋白(朱春紅等, 2009)。

通過實時熒光定量 PCR的檢測, 我們的實驗結(jié)果顯示, 在被研究的牙鲆 7個健康組織中, TLR1和TLR2基因有廣泛的組織表達(dá)分布, TLR1基因在脾臟組織中的表達(dá)量最高, 在鰓和頭腎中表達(dá)最低; TLR2在小腸組織中表達(dá)量最高, 在鰓、脾臟和頭腎中表達(dá)最低。而頭腎和鰓做為魚類重要的免疫器官, 其TLR1和 TLR2的基礎(chǔ)表達(dá)量都較低, 也許這一表達(dá)特征可用于表征牙鲆魚體的健康狀況。有研究報道,斜帶石斑魚在被檢測的9個組織中, TLR1在脾臟的相對表達(dá)量最高(Weiet al, 2011), 這一研究結(jié)果與我們的研究結(jié)果是一致的。河豚的TLR1基因在被檢測的 8個組織中, 心臟中表達(dá)量最高, 其次是脾臟(Wuet al, 2008)?？梢? 不同的TLRs成員基因在不同魚種或不同組織中的基礎(chǔ)表達(dá)量是有一定差異的。這種不同魚種在不同組織表達(dá)量高低的生物學(xué)意義還有待進一步的研究。在免疫刺激實驗中, 遲緩型愛德華氏菌能夠上調(diào)牙鲆TLR1和TLR2基因的表達(dá), 并且顯示TLR1基因?qū)Σ≡w的刺激更加敏感, 且在脾臟中的表達(dá)上調(diào)程度最大, 說明脾臟中的TLR1在識別遲緩型愛德華氏菌感染中起了重要作用。做為TLRs信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的重要接頭分子 MyD88, 在牙鲆感染時期,MyD88基因也有著與TLR1基因同步的表達(dá)上調(diào), 暗示遲緩型愛德華氏菌可能通過 TLR1信號通路上調(diào)MyD88的表達(dá), 并激活免疫細(xì)胞中炎癥因子 TNF-α和 IL-1的基因表達(dá)上調(diào), 最終釋放炎癥因子以應(yīng)答病原菌的感染。

作為低等的脊椎動物, 魚類似乎有著更豐富的TLRs, 魚類有其特有的 TLR家族成員(歐陽蒲月等,2010), 例如 TLR20、TLR21、TLR22和 TLR23(Wuet al, 2012), 目前, 在牙鲆、斜帶石斑魚和斑馬魚等硬骨魚類中就有針對 TLR21基因的相應(yīng)研究(Liet al,2012; Gaoet al, 2013; Yehet al, 2013; 張潔等, 2015),這也進一步說明了魚類的 TLR家族有擴張的趨勢。TLRs家族可識別同樣的PAMP, 例如河豚魚TLR3、TLR22能識別雙鏈核糖核酸(Matsuoet al, 2008), 虹鱒魚 TLR5和 TLR5s能識別細(xì)菌的鞭毛蛋白(Tsujitaet al, 2004), 另外還有一些研究(李敏等, 2012)報道了TLR5和TLR5s基因在斑點叉尾中的表達(dá)分析; 在硬骨魚和青蛙中能檢測到TLR21, 也能檢測到 TLR9(Oshiumiet al, 2003; Meijeret al, 2004; Ishiiet al,2007)。但是, 魚類缺乏哺乳動物中的TLR6和TLR10,分子系統(tǒng)樹顯示TLR1、TLR2、TLR10和TLR6有相似的分子結(jié)構(gòu)(韋友傳, 2011), 處在同一分支上(Roachet al, 2005), 魚類TLR1和TLR2的功能是否有替代哺乳動物中TLR6和TLR10的功能, 還需進一步的研究證實。

免疫識別成分檢測、病原檢測與疾病的發(fā)生發(fā)展是研究魚類免疫進程重要的三個部分, 只有將三者結(jié)合起來, 才能得出更合理的結(jié)論。硬骨魚類機體免疫防御的第一道防線是Toll 樣受體對病原體的識別,因此可以通過分析研究 Toll樣受體的作用機制進一步開發(fā)牙鲆免疫增強劑(Wuet al, 2012); 在牙鲆養(yǎng)殖業(yè)中, 愛德華氏菌病是影響牙鲆健康生長的重要因素, 通過分析牙鲆 TLRs基因表達(dá)的變化, 可監(jiān)測養(yǎng)殖牙鲆的健康狀況, 分析可能感染的病原種類, 及時采取預(yù)防治療措施。因此, 研究遲緩型愛德華氏菌對牙鲆刺激造成的基因表達(dá)特征和結(jié)構(gòu)特征具有一定理論意義。

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EXPRESSION OF TLR1 AND TLR2 GENES OF JAPANESE FLOUNDERPARALICHTHYS OLIVACEUSINDUCED BYEDWARDSIELLA TARDA

LI Qing-Ya1, ZHOU Mi1, ZHANG Jie1, ZHENG Jin-Hui1, GENG Xu-Yun2, PAN Bao-Ping1,SUN Jin-Sheng1,2, GAO Hong1
(1.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance,College of Life Sciences,Tianjin Normal University,Tianjin300387,China;2.Tianjin Aquaculture Disease Prevention & Treatment Center,Tianjin300221,China)

Toll-like receptors (TLRs) are a class of proteins that play an important role in the innate immunity.Toll-like receptor 1 (TLR1) forms a heterodimer with Toll-like receptor 2 (TLR2) to recognize lipopeptides of pathogenic bacteria and initiate host innate immunity system.We detected the mRNA levels of TLR1 and TLR2 in various tissues of healthy orEdwardsiella tardainduced Japanese flounderParalichthys olivaceusby quantitative real time reverse transcription-PCR(RT-qPCR) and discussed the roles of TLR1 and TLR2 in the innate immunity ofP.olivaceus.The results indicate that TLR1 and TLR2 were widely expressed in various tissues of healthyP.olivaceus.The highest expression level of TLR1 was observed in spleen, followed by heart, muscle, liver, intestine, gills, and head kidney, and that of TLR2 in intestine,followed by liver, heart, muscle, gills, and spleen.Immunostimulation test shows that TLR1 transcript peaked in level 6h afterE.tardachallenge in most tissues; the highest expression level soared to 92.2 fold increase (P＜0.01) from that of the initial point in the spleen.Similarly, TLR2 transcript topped in 1h in the spleen for a 17.8 fold increase (P＜0.01), and 14 fold increase (P＜0.01) in the heart; and then the TLR2 expression stayed.These facts suggest that the TLR1 and TLR2 genes were involved in immune response toE.tardainfection.In addition, expressions of MyD88, TNF-α, and IL-1 genes were up-regulated afterE.tardachallenge.Therefore, we believe thatE.tardacould up-regulate MyD88 expression via TLR1 pathway and up-regulate ultimately the expression of inflammatory factors TNF-α and the IL-1 genes against pathogen infection.

TLR1; TLR2;Paralichthys olivaceus;Edwardsiella tarda; expression; real-time PCR

S917.4

10.11693/hyhz20170200040

* 天津市自然科學(xué)基金重點項目資助, 14JCZDJC34200號。李慶亞, 碩士研究生, E-mail: liqingya0914@163.com

① 通訊作者: 高 虹, 副教授, E-mail: skygh@mail.tjnu.edu.cn

2017-02-28, 收修改稿日期: 2017-03-19