光唇魚(Acrossocheilus fasciatus)Leptin基因克隆及禁食-再投喂對(duì)其表達(dá)的影響*

穆方申 苗 亮 李明云 侯紅紅 李笑萌 徐玉敏

(寧波大學(xué) 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315211)

光唇魚(Acrossocheilus fasciatus)Leptin基因克隆及禁食-再投喂對(duì)其表達(dá)的影響*

穆方申 苗 亮①李明云①侯紅紅 李笑萌 徐玉敏

(寧波大學(xué) 教育部應(yīng)用海洋生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 寧波 315211)

瘦素(Leptin)是在動(dòng)物攝食和能量代謝調(diào)節(jié)中具有重要作用的一種蛋白。為研究光唇魚(Acrossocheilus fasciatus)中Leptin基因(AfLep)的結(jié)構(gòu)和功能, 作者克隆了其cDNA序列全長(zhǎng)。結(jié)果顯示AfLep由1315個(gè)核苷酸組成, 含1個(gè)長(zhǎng)度為516bp的開放閱讀框, 預(yù)測(cè)編碼蛋白由171個(gè)氨基酸殘基組成并具有長(zhǎng)度為20aa的信號(hào)肽。系統(tǒng)進(jìn)化樹中AfLep與其他鯉科魚類的Leptin蛋白聚為一簇, 與齊口裂腹魚(Schizothorax prenanti)進(jìn)化相關(guān)性最高。多重序列比對(duì)顯示AfLep與齊口裂腹魚Leptin蛋白相似性最高(86.7%), 與鯉科其他魚類間的相似性均在 80%以上。AfLep具有脊椎動(dòng)物L(fēng)eptin蛋白的4個(gè)保守α螺旋結(jié)構(gòu), 其三級(jí)結(jié)構(gòu)與人Leptin相似。AfLep在光唇魚肝臟中的表達(dá)量最高, 其次是腦和腎, 其他組織中僅有微弱表達(dá)。實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)顯示禁食后光唇魚肝臟AfLep表達(dá)量降低(P＜0.05), 禁食1d、3d、7d時(shí)的表達(dá)量分別比與禁食前降低了58.25%、73.82%和92.05%;禁食1d和3d的魚經(jīng)再投喂后肝臟AfLep表達(dá)量均顯著升高(P＜0.05), 但禁食7d的魚再投喂后AfLep表達(dá)量?jī)H略有升高(P＞0.05)。上述結(jié)果表明AfLep參與了光唇魚的攝食管理和能量代謝調(diào)控。

光唇魚; Leptin基因; 組織表達(dá); 禁食-再投喂

由于天然餌料的季節(jié)性豐度變化以及人工養(yǎng)殖中的限制性投餌, 魚類無(wú)論在野生還是養(yǎng)殖條件下都可能會(huì)經(jīng)歷一定的食物匱乏期。饑餓狀態(tài)導(dǎo)致的魚體生理生化、代謝變化會(huì)影響攝食行為、能量代謝、物質(zhì)組成及生長(zhǎng)發(fā)育、生殖等生命活動(dòng)(王婷等, 2015;賀詩(shī)水等, 2016)。Leptin又稱瘦素, 是在動(dòng)物攝食和能量平衡的調(diào)節(jié)中有重要的作用一種蛋白質(zhì)激素,并在生殖和發(fā)育、免疫、心血管功能調(diào)節(jié)等方面有重要作用(Klok, 2007)。在哺乳動(dòng)物中, Leptin可通過下丘腦-垂體軸的反饋調(diào)節(jié)使動(dòng)物攝食減少、能量消耗增加(Sahu, 2004)。目前已獲得了斑馬魚(Danio rerio)、虹鱒(Oncorhynchus mykiss)、鯉(Cyprinus carpio)、草魚(Ctenopharyngodon idella)、大西洋鮭(Salmo salar)等多種魚類的Leptin基因序列, 雖然魚類的Leptin蛋白有著相似的高級(jí)結(jié)構(gòu), 但各科、目之間氨基酸序列卻有較大差異, 關(guān)于魚類中Leptin的功能也存在爭(zhēng)議(Copelandet al, 2011)。就攝食調(diào)節(jié)方面而言, 鯉(C.carpio)和草魚(C.idella)均為禁食后 Leptin基因表達(dá)上調(diào)、攝食表達(dá)后下調(diào)(盧榮華等, 2015), 且對(duì)金魚(Carassius auratus)和虹鱒(O.mykiss)側(cè)腦室注射Leptin蛋白后可以抑制攝食、導(dǎo)致體重降低(de Pedroet al, 2006; Aguilaret al, 2010); 但在點(diǎn)帶石斑魚(Epinephelus coioides)、虹鱒(O.mykiss)中則發(fā)現(xiàn)饑餓狀態(tài)下Leptin基因表達(dá)上調(diào)(Klinget al, 2009; Zhanget al, 2013)。魚類中Leptin的功能可能比哺乳動(dòng)物復(fù)雜,要弄清 Leptin在魚類攝食管理和能量代謝調(diào)控中的功能及作用機(jī)制還需要進(jìn)行更加廣泛和深入的研究。

光唇魚(Acrossocheilus fasciatus)俗稱淡水石斑魚,屬鯉形目、 鯉科、鲃亞科、光唇魚屬, 不但有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值, 還可作為小型觀賞魚(潘娜等, 2015)。近年來(lái)光唇魚的人工繁育和養(yǎng)殖技術(shù)逐漸成熟, 養(yǎng)殖規(guī)模不斷擴(kuò)大, 但在攝食調(diào)控、能量代謝調(diào)節(jié)等方面鮮有研究報(bào)道。本研究克隆光唇魚Leptin基因(AfLep),并檢測(cè)禁食期間及恢復(fù)投喂后AfLep的表達(dá)變化, 以期為研究魚類 Leptin的功能及其光唇魚的攝食和能量代謝調(diào)節(jié)中的作用提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及禁食-再投喂實(shí)驗(yàn)

光唇魚由浙江省新昌縣新漁水產(chǎn)養(yǎng)殖專業(yè)合作社提供, 為人工繁育、養(yǎng)殖的12月齡光唇魚, 共450尾, 平均體重(3.13±1.14)g、平均體長(zhǎng)(6.82±0.64)cm。將魚隨機(jī)分配到9個(gè)容積為50L的塑料桶中, 每桶50尾, 暫養(yǎng)4天后開始實(shí)驗(yàn)。暫養(yǎng)期間每天投喂2次通威牌顆粒飼料, 每次投喂量為魚體重的 2%。每 3個(gè)桶為1組, 處理如下: 第1組禁食1d后恢復(fù)投喂, 第2組禁食3d后恢復(fù)投喂, 第3組禁食7d后恢復(fù)投喂。

1.2 樣品采集

在禁食前(0d)和禁食后 1d、3d、7d以及再投喂后3h分別采樣1次, 每次每桶隨機(jī)取樣5尾。取樣時(shí)將魚用丁香酚麻醉后立即解剖, 其中禁食前取肌肉、鰓、心、肝臟、脾、腸、腎、腦等組織, 用于AfLep基因克隆、組織表達(dá)分析和表達(dá)量檢測(cè); 禁食及再投喂后取肝臟, 用于檢測(cè)AfLep基因表達(dá)變化。樣品經(jīng)液氮速凍后–80℃保存, 用 Trizol法提取各組織總RNA, 反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。

1.3 AfLep基因克隆

檢索GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中鯉科魚類Leptin蛋白序列, 經(jīng)序列比對(duì)后根據(jù)保守區(qū)域設(shè)計(jì) 3對(duì)兼并引物(lep1, lep2和lep3, 見表1)對(duì)光唇魚AfLep基因cDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增。用 ExTaq?Hot Start Version聚合酶體系(TaKaRa)進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 50μL反應(yīng)體系包括: 5U/μL的ExTaqHS 0.25μL, 10×ExTaqBuffer (Mg2+Plus) 5μL,dNTP Mixutre 4μL, 上、下游引物各0.5μL, cDNA模板1μL, dH2O 38.75μL。反應(yīng)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性5min;94℃變性 30s、退火(引物退火溫度見表 1)30s、72℃合成30s, 循環(huán)30次; 72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后連接入 pMD-19T載體,轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌, 挑選陽(yáng)性克隆菌落送測(cè)序。引物合成和測(cè)序均由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行。對(duì)測(cè)得的序列進(jìn)行拼接后獲得光唇魚AfLep基因核心序列。

根據(jù)所獲核心序列設(shè)計(jì)引物 lep-3′-RACE和lep-5′-RACE(表 1), 用 3′-Full RACE Core Set Ver.2.0和5′-Full RACE Kit (TaKaRa)擴(kuò)增光唇魚AfLep基因cDNA的3′端和5′端序列, 擴(kuò)增體系及反應(yīng)程序均按照說(shuō)明書進(jìn)行。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng) 1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后連接入pMD-19T載體, 轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌,挑選陽(yáng)性克隆菌落送測(cè)序, 拼接后獲得光唇魚AfLep基因cDNA序列全長(zhǎng)。

表1 引物信息Tab.1 Information of the primers

1.4 AfLep序列分析及系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建

對(duì)獲得的AfLep基因cDNA序列, 用在線ORF Finder工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)分析開放讀碼框(open reading frame, ORF); 用SingalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)預(yù)測(cè)信號(hào)肽; 用 SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org//SWISS-MODEL.html)的 ProMod II功能對(duì) AfLep蛋白進(jìn)行二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)(以蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)中的人 Leptin結(jié)構(gòu)作為參照); 從 GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索魚類及其他脊椎動(dòng)物的 Leptin序列(表 2), 經(jīng) Cluastal X1.83軟件進(jìn)行多重比對(duì)后用MEGA5.0軟件構(gòu)建基于氨基酸序列的 NJ法(Neighbor-joining)系統(tǒng)進(jìn)化樹, 設(shè)置 bootstraps驗(yàn)證次數(shù)為1000次。

表2 多重序列比對(duì)及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹所用序列Tab.2 Sequences that used for multiple alignment and phylogenetic tree construction

1.5 AfLep組織表達(dá)及禁食-再投喂后表達(dá)變化

根據(jù)獲得的AfLep基因cDNA序列設(shè)計(jì)1對(duì)表達(dá)檢測(cè)引物q-lep、并以β-actin作為內(nèi)參(表1), 檢測(cè)AfLep基因在光唇魚各組織中的表達(dá)情況及禁食-再投喂后的表達(dá)變化。

以提取的正常投喂健康光唇魚各組織 cDNA為模板, 通過半定量RT-PCR檢測(cè)各組織中AfLep基因的表達(dá)情況。20μL反應(yīng)體系包括: 2×TaqPremix-Dye酶 10μL, 正反向引物各 1μL, 模板 cDNA 1μL, dH2O 7μL。程序?yàn)? 94℃預(yù)變性 5min: 94℃變性30s、58℃退火30s、72℃延伸30s, 循環(huán)30次; 72℃延伸10min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后凝膠成像。

對(duì)禁食期間及再投喂后光唇魚肝臟中 AfLep基因的表達(dá)變化進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量 PCR (real-time quantitative PCR, RT-qPCR)檢測(cè)。反應(yīng)使用 SYBR?PremixEx TaqTM試劑盒(TaKaRa), 20μL反應(yīng)體系包括: SYBR?Premix ExTaq(Tli RNaseH Plus) 10μL,正、反向引物各1μL, cDNA模板 1μL, ddH2O 7μL。反應(yīng)程序?yàn)? 94℃預(yù)變性2min; 94℃變性15s、58℃退火15s、72℃延伸30s, 循環(huán)40次并記錄CT值。反應(yīng)完成后, 系統(tǒng)在 65—94℃、每次升溫 0.5℃生成溶解曲線。以β-actin 為內(nèi)參、用 2–ΔΔCt法(Livaket al, 2001)計(jì)算AfLep基因相對(duì)表達(dá)量。用Excel2007軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì), 計(jì)算平均數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)差; 用 SPSS16.0軟件對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)的基因相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行單因素方差(One way ANOVA)分析, 以P＜0.05為具有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 AfLep序列特征

經(jīng)測(cè)序和拼接, 獲得 AfLep基因序列全長(zhǎng)1315bp, 其中 5′端 175bp, 3′端 699bp; 該序列含有 1個(gè)長(zhǎng)度為516bp的開放閱讀框(ORF), 編碼171個(gè)氨基酸; 經(jīng)SignalP4.1預(yù)測(cè), 編碼蛋白有長(zhǎng)度為20aa的信號(hào)肽(圖1)。

基于各種動(dòng)物 Leptin氨基酸序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹中(圖 2), 魚類 Leptin獨(dú)立于兩棲類、鳥類、哺乳類等其他脊椎動(dòng)物而聚為一個(gè)大簇; 在魚類Leptin中鯉科、鰻鱺科、石首魚科、鮭科魚類均單獨(dú)聚為一個(gè)小簇; AfLep位于鯉科魚類的分支中, 優(yōu)先與齊口裂腹魚 Leptin相聚。多重序列比對(duì)顯示AfLep與齊口裂腹魚 Leptin相似性最高(86.7%), 與鯉科其他魚類 Leptin的相似性均在 80%以上, 與非鯉科魚類Leptin的相似性較低(30%左右), 而與兩棲類、鳥類和哺乳類等其他脊椎動(dòng)物L(fēng)eptin相似性僅約20%。

圖1 AfLep基因cDNA核苷酸序列及預(yù)測(cè)編碼的氨基酸序列Fig.1 The nucleotide sequences of AfLep cDNA and deduced amino acid sequence

圖2 Leptin系統(tǒng)進(jìn)化樹(NJ法, bootstraps=1000)Fig.2 The phylogenetic tree of Leptin (neighbor-joining method, bootstraps=1000)

序列比對(duì)(圖 3)顯示光唇魚、齊口裂腹魚、鯉等鯉科魚類的 Leptin氨基酸序列較為保守, 而與非鯉科魚類以及其他脊椎動(dòng)物的Leptin序列差異較大; 但各種動(dòng)物L(fēng)eptin蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)高度保守, 均有4個(gè)α螺旋(Helix A-D), 且具有長(zhǎng)度約 20aa的信號(hào)肽。預(yù)測(cè)的AfLep蛋白三級(jí)空間結(jié)構(gòu)也與人Leptin蛋白相似(圖4)。

圖3 AfLep與其他生物L(fēng)eptin氨基酸序列比對(duì)Fig.3 Amino acid sequence alignment among AfLep and Leptin of other species

圖4 Leptin蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.4 The tertiary structures of Leptin protein

2.2 組織表達(dá)特征

半定量RT-PCR檢測(cè)顯示了AfLep基因在光唇魚肝臟中的表達(dá)量最高, 其次是腦和腎, 在肌肉、脾、心臟、鰓和腸等組織中僅有微弱表達(dá)(圖5)。

圖5 AfLep基因在光唇魚各組織中的表達(dá)Fig.5 The expression of AfLep gene in various tissues of A.fasciatus

2.3 禁食及再投喂后光唇魚肝臟AfLep基因的表達(dá)變化

經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)(圖6), 禁食后光唇魚肝臟中 AfLep基因表達(dá)顯著下調(diào)(P＜0.05), 且表達(dá)水平隨禁食時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸降低: 禁食 1d、3d、7d后AfLep基因表達(dá)量分別比禁食前(0d)降低了58.25%、73.82%和92.05%。禁食-再投喂后AfLep基因表達(dá)上調(diào), 其中禁食1d組和禁食3d組分別顯著升高了1.79倍和2.65倍(P＜0.05), 而禁食7d組的表達(dá)水平僅略有升高、差異不顯著(P＞0.05)。

圖6 禁食及再投喂后光唇魚肝臟中AfLep基因表達(dá)變化Fig.6 Changes in expression of AfLep in liver of A.fasciatus during fasting and after refeeding

3 討論

自Zhang等(1994)率先在小鼠中得到Leptin基因以來(lái), 已在包括魚類在內(nèi)的脊椎動(dòng)物各類群中都發(fā)現(xiàn)有與哺乳類Leptin同源的基因存在。在哺乳動(dòng)物及非洲爪蟾的基因組中Leptin基因僅有1個(gè)拷貝、編碼1種蛋白, 而在某些魚類中則發(fā)現(xiàn)存在多個(gè)拷貝以及不同的Leptin蛋白亞型(Kurokawaet al, 2009; Angotziet al, 2013; 盧榮華等, 2015), 這可能與魚類在進(jìn)化過程中發(fā)生過基因組復(fù)制有關(guān)(周莉等, 2006)。另外,魚類中Leptin基因的起源進(jìn)化關(guān)系也比較復(fù)雜, 例如鯉(C.carpio)2個(gè)Leptin基因拷貝所編碼的蛋白相似性較高(84%), 而斑馬魚(D.rerio)中2個(gè)Leptin蛋白亞型的相似性卻僅有 24%(盧榮華等, 2015)。本研究通過同源克隆從光唇魚中獲得了一個(gè) Leptin基因(AfLep), 但不能確定光唇魚基因組中是否還存在該基因的其他拷貝。

在本研究構(gòu)建的Leptin系統(tǒng)進(jìn)化樹中, 包括光唇魚AfLep在內(nèi)的各種鯉科魚類Leptin聚為一簇, 其氨基酸序列相似性在80%以上, 而與非鯉科魚類Leptin的相似性僅 30%左右。魚類不同科、目之間 Leptin氨基酸序列有較大差異, 這可能與魚類種系發(fā)生和系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系復(fù)雜有關(guān); 但研究顯示在各種脊椎動(dòng)物基因組中Leptin基因有著相似的線性排列, 表明它們可能有相同的起源; 并且各類動(dòng)物L(fēng)eptin蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)高度保守, 均含2個(gè)半胱氨酸和形成4個(gè)α螺旋(盧榮華等, 2015; 張沛等, 2016); 本研究預(yù)測(cè)的光唇魚AfLep蛋白的空間結(jié)構(gòu)也與人類Leptin蛋白相似。結(jié)構(gòu)上的保守可能對(duì) Leptin蛋白的穩(wěn)定性和活性有重要影響, 而氨基酸序列的低相似性則反映了Leptin基因在物種進(jìn)化中的差異, 這種差異可能導(dǎo)致該基因在不同生物中功能的多樣化。

小鼠等哺乳動(dòng)物中 Leptin基因主要在脂肪組織表達(dá)(Trayhurnet al, 1995), 兩棲類Leptin則是腦和心臟中表達(dá)量較高。在光唇魚肝臟中AfLep基因高表達(dá),斑馬魚(D.rerio)、花鱸(Lateolabrax maculatus)、鱖魚(Siniperca chuatsi)、點(diǎn)帶石斑魚(E.coioide)等魚類中也是肝臟中 Leptin基因表達(dá)量最高(Gorissenet al,2009; Zhanget al, 2013; 張沛等, 2016; Yuanet al,2016); 但也有些魚類在其他組織中出現(xiàn) Leptin的高表達(dá), 如團(tuán)頭魴(Megalobrama amblycephala)腎臟、鰓、腸、性腺中 Leptin的表達(dá)量遠(yuǎn)均高于肝臟(趙鴻昊等, 2016), 大西洋鮭(S.salar)Leptin則是在腦中表達(dá)量最高、肌肉中也有較高表達(dá)(Ronnestadet al,2010); Leptin基因組織表達(dá)的這種差異性提示該基因在魚類中可能有多種功能, 并且在不同魚類中的功能可能有較大差異。

在人、小鼠等哺乳動(dòng)物中的實(shí)驗(yàn)顯示饑餓后Leptin基因表達(dá)量和血漿Leptin蛋白水平顯著降低、進(jìn)食后升高(Kolaczynskiet al, 1995; Saladinet al,1995; Trayhurnet al, 1995; Weigleet al, 1997)。本研究中 AfLep在光唇魚肝臟中的表達(dá)也表現(xiàn)為禁食后顯著降低、恢復(fù)喂食后升高, 提示該基因有降低食欲的作用, 在草魚(C.idella)、金魚(C.auratus)、鱸魚(Morone saxatilis)、虹鱒(O.mykiss)等魚類中也得到了相似的結(jié)果(盧榮華等, 2015), 但在點(diǎn)帶石斑魚(E.coioides)和虹鱒(O.mykiss)中則發(fā)現(xiàn)禁食后Leptin基因表達(dá)上調(diào)、血漿Leptin蛋白含量升高(Klinget al,2009; Zhanget al, 2013)。這可能與不同魚類在攝食和糖、脂代謝管理方式上有著很大的差異有關(guān), 例如通常情況下機(jī)體處于饑餓狀態(tài)時(shí)會(huì)分解脂肪提供能量,但真鯛(Pagrus major)幼魚經(jīng)過短期饑餓后卻出現(xiàn)了脂肪含量的升高(Kaneko, 2016); 而肉食性和植食性魚類在糖代謝上也有很大不同(Moon, 2001)。另外,本研究中禁食1d和3d的光唇魚在攝食后肝臟AfLep基因表達(dá)量均顯著升高, 提示此時(shí)魚體的能量?jī)?chǔ)備可能消耗不大; 而禁食7d組攝食后肝臟AfLep基因表達(dá)仍處于較低水平, 提示魚體脂肪消耗過多、需攝取更多食物進(jìn)行補(bǔ)充。賀詩(shī)水等(2016)也發(fā)現(xiàn)鯽魚(Carassius auratus)饑餓 4d后脂肪含量?jī)H下降了約10%, 而饑餓6d后已減少了50%以上。雖然本研究表明AfLep基因參與了光唇魚的攝食管理, 但要弄清其作用機(jī)制以及在能量代謝中的功能仍需進(jìn)一步研究。

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CLONING AND EXPRESSION OF LEPTIN GENE INACROSSOCHEILUS FASCIATUSDURING FASTING AND REFEEDING

MU Fang-Shen, MIAO Liang, LI Ming-Yun, HOU Hong-Hong, LI Xiao-Meng, XU Yu-Min
(Key Laboratory of Applied Marine Biotechnology,Ministry of Education,Ningbo University,Ningbo315211,China)

Leptin plays an important role in regulation of food intake and energy expenditure in animals.To study the structure and function of Leptin gene in commercial fishAcrossocheilus fasciatus, we cloned the cDNA sequence of Leptin gene inA.fasciatus, named AfLep.The full-length of AfLep cDNA sequence was 1315bp, contained an open reading frame(ORF) of 516bp encoding 171 amino acids; and the initiative 20 amino acid consisted of signal peptide.In the phylogenetic tree, AfLep gathered with Leptin of other Cyprinidae fish and was most closely related to Leptin ofSchizothorax prenanti.The multiple sequence alignment showed that AfLep shared the highest amino acid sequence identify (86.7%) with Leptin ofS.prenanti, and had more than 80% sequence identity to other Cyprinidae fish.The predicted protein of AfLep has four α helices regions, which is conserved in vertebrates.The predicted tertiary structure of AfLep is similar to human Leptin.AfLep gene had the highest expression level in liver, followed by brain and kidney, and weakly expressed in other tissues.Real-time fluorescent quantitative PCR (RT-qPCR) showed that the expression of AfLep decreased significantly in liver after being fasted (P＜0.05), and reduced by 58.25%, 73.82%, and 92.05% after fasting 1d, 3d, and 7d, respectively,compared to pre-fasting.When the fish were refed 1d and 3d after fasting, the expression level of AfLep in liver significantly increased (P＜0.05), but in the group of fasting 7d the AfLep expression was slightly elevated after refeeding(P＞0.05).All these results indicate that AfLep participates in the adjustment of feeding regulation and energy metabolism.

Acrossocheilus fasciatus; Leptin gene; tissue expression; fasting and refeeding

Q346

10.11693/hyhz20170100023

* 浙江省海洋與漁業(yè)項(xiàng)目, 浙海漁計(jì)[2012]83號(hào); 國(guó)家星火計(jì)劃項(xiàng)目, 2011GA701001號(hào)。穆方申, E-mail: mufangshen@126.com

① 通訊作者: 苗 亮, 博士, 碩士生導(dǎo)師, E-mail: miaoliang@nbu.edu.cn; 李明云, 教授, 博士生導(dǎo)師, E-mail:limingyun@nbu.edu.cn

2017-01-26, 收修改稿日期: 2017-03-03