深色有隔內(nèi)生真菌與褐環(huán)乳牛肝菌雙接種對樟子松生長及抗立枯病的影響

鄧勛，宋小雙，尹大川，宋瑞清

(1 黑龍江省森林保護(hù)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040； 2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，遼寧 沈陽 110000； 3 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

深色有隔內(nèi)生真菌與褐環(huán)乳牛肝菌雙接種對樟子松生長及抗立枯病的影響

鄧勛1，宋小雙1，尹大川2，宋瑞清3

(1 黑龍江省森林保護(hù)研究所，黑龍江 哈爾濱 150040； 2 沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院，遼寧 沈陽 110000； 3 東北林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

通過測定樟子松苗木生物量、抗逆生理指標(biāo)及立枯病發(fā)生率，探討單接種與雙接種深色有隔內(nèi)生真菌PhialocephalafortiniiD575和褐環(huán)乳牛肝菌SuillusluteusN94后對樟子松生長及抗病性的影響。結(jié)果表明：雙接種處理對樟子松苗木促生效果最好，苗高、地徑、鮮重和干重比對照分別提高11.18%，14.11%，24.13%，41.09%。接種內(nèi)生真菌和外生菌根菌可提高樟子松苗木對立枯絲核菌的抗性，在接種立枯絲核菌后，雙接種處理的樟子松苗木保護(hù)酶CAT、POD和SOD酶活性比對照分別提高32.65%，10.96%和19.39%，丙二醛含量降低23.42%，β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性分別提高33.97%和36.92%，內(nèi)生真菌和外生菌根菌的存在可以降低苗木立枯病的發(fā)生率，提高苗木成活率。

樟子松；深色有隔內(nèi)生真菌；外生菌根菌；促生抗病

外生菌根菌在提高根系對營養(yǎng)元素和水分的吸收，產(chǎn)生生長激素促進(jìn)植物生長，改善植物根際環(huán)境等多方面發(fā)揮著不可替代的作用[1]，同時外生菌根菌通過產(chǎn)生抗生素、提高宿主植物抗逆性等來防治或減輕某些植物病害，特別是土傳病害，如用外生菌根菌純培養(yǎng)物對落葉松Larixspp.、樟子松Pinussylvestrisvar.mongolica幼苗進(jìn)行人工接種，降低了松苗猝倒病的發(fā)病率[2]。接種外生菌根菌增加了植物的抗性，對非根部病害如枯梢病、爛皮病等也有一定的防治作用[3]。深色有隔內(nèi)生真菌是植物內(nèi)生真菌的主要類群，在針葉樹中，主要的深色有隔內(nèi)生真菌種類是子囊菌(Ascomycetes)中的Phialocephalafortiniis.l.—Acephalaapplanataspecies complex (PAC)類群集合[4]，可以在宿主根系定殖，并有效抑制土傳病害的發(fā)生，如P.subalpina的存在可以降低腐霉菌對云杉苗木的危害，同時增加云杉苗木的生物量[5]。部分PAC菌株具有代謝出抑制病原菌生長的產(chǎn)物，P.europaea的代謝產(chǎn)物中分離得到的sclerin，sclerolide，sclerotinin A以及sclerotinin B，可以顯著抑制病原菌生長[6]。

樟子松是我國北方主要造林樹種，在生態(tài)建設(shè)、環(huán)境修復(fù)方面發(fā)揮重要作用[7]，外生菌根菌與深色有隔內(nèi)生真菌在針葉植物根際的雙接種對植物的促生抗逆是否能發(fā)揮協(xié)同增效作用，目前還未見報道，褐環(huán)乳牛肝菌SuillusleutusN94和深色有隔內(nèi)生真菌PhialocephalafortiniifortiniiD575是課題組前期分離篩選的高效菌株[8-9]，本研究通過不同試驗設(shè)計，研究雙接種和單一接種條件下，深色有隔內(nèi)生真菌與褐環(huán)乳牛肝菌對樟子松生長及抗立枯病的影響。

1 材料與方法

樟子松種子購自章古臺樟子松苗木繁育基地，保存于-20℃冰箱備用。種子處理及播種參考尹大川[10]方法，將經(jīng)催芽的樟子松種子播入營養(yǎng)缽中，每缽30粒，上覆無菌土，澆透水后放入大棚中培養(yǎng)，待幼苗出土后，定苗至每缽20株，常規(guī)管護(hù)。

1.2 接種試驗設(shè)計

菌劑制備：用5 mm的無菌打孔器分別切取培養(yǎng)好的深色有隔內(nèi)生真菌D575和外生菌根菌褐環(huán)乳牛肝菌N94，接種到250 mL PD液體培養(yǎng)基中，置于搖床上(25℃，150 r/min)振蕩培養(yǎng)，D575培養(yǎng)7 d，N94培養(yǎng)20 d，得到液體菌劑，使用前將菌絲體攪碎做勻漿處理。

接種試驗設(shè)計： 在播種樟子松苗1個月后，進(jìn)行深色有隔內(nèi)生真菌和褐環(huán)乳牛肝菌的接種處理，共4種處理方式：1.雙接種深色有隔內(nèi)生真菌D575和褐環(huán)乳牛肝菌N94(簡稱D575+N94)；2.單接種深色有隔內(nèi)生真菌D575(簡稱D575)；3.單接種褐環(huán)乳牛肝菌N94(簡稱N94)；4.PD培養(yǎng)基空白對照(CK)。在苗木根際打孔，接種液體菌劑，每缽接種100 mL，每組處理20缽，共80缽。

1.3 立枯絲核菌的接種 內(nèi)生真菌和外生菌根菌接種處理1個月后，接種立枯絲核菌。立枯絲核菌菌土及接種參考唐明[11]的方法進(jìn)行，用無菌打孔器切取培養(yǎng)好的立枯絲核菌菌餅，接種到250 mL PD液體培養(yǎng)基中，置于搖床上(25℃，150 r/min)振蕩培養(yǎng)7 d。接種前按照菌液與栽培基質(zhì)1∶100體積比混合，攪拌均勻后用于接種，每缽接種菌土100 mL，覆蓋到土表。

1.4 取樣及相關(guān)指標(biāo)測定

1) 樟子松苗病情調(diào)查。立枯絲核菌接種15 d后調(diào)查苗木發(fā)病情況，計算發(fā)病率及相對防治效果。

第二,至40年代，英美陌生化文學(xué)特點初步形成。在這一階段,英美作家受到一戰(zhàn)的影響,戰(zhàn)前的繁華變?yōu)閺U墟，面對無邊的廢墟，作家們再也無法將對美好生活的憧憬和向往寄托于田園生活,只能通過更為虛幻的語言形式來表現(xiàn)內(nèi)心的空虛和迷亂。因此，這個階段的陌生化文學(xué)作品重點描述人物的主觀感受，而不是外部的客觀現(xiàn)實。

2)抗病相關(guān)生理指標(biāo)測定。參考唐明[11]的方法，在立枯絲核菌接種前和接種15 d后分別取樣，采用南京建成生物工程公司的試劑盒測定[12]抗氧化酶，如超氧化物岐化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和 抗病保護(hù)酶(幾丁質(zhì)酶和β-1,3-葡聚糖酶)活性，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法測定[13]，每處理3次重復(fù)。

3)生長指標(biāo)測定。在內(nèi)生真菌和外生菌根菌接種3個月后，每處理隨機(jī)挖取30株樟子松苗木，測定苗木生長指標(biāo)，用直尺和游標(biāo)卡尺分別測量苗高和地徑。取樣苗木，用刷子小心清理掉根際泥土，用電子天平測定苗木鮮重后，在鼓風(fēng)干燥箱中85℃烘干后稱量苗木的干重。

1.5 數(shù)據(jù)處理 所得數(shù)據(jù)用SPSS 13.0進(jìn)行單因素差異顯著性分析(ANOVA)，α=0.05，并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同接種處理對樟子松苗木生長的影響

1)對樟子松苗高的影響。各接種處理組均提高了苗木的高生長，與對照差異顯著(Plt;0.05)(表1)。接種3個月后，與CK相比，單接種N94與D575苗高分別提高12.65%和8.12%，雙接種N94+D575苗高提高11.18%。方差分析結(jié)果表明單接種N94 、D575與雙接種N94+D575處理之間對苗高影響差異不顯著(Pgt;0.05)。

2)對地徑的影響。各處理組均顯著提高苗木的地徑(表1)。接種3個月后，與CK相比，單接種N94與D575分別提高地徑生長12.94%和5.88%，雙接種N94+D575提高14.11%。與單接種N94和D575相比，雙接種處理地徑分別提高1.04%和7.78%，N94 +D575和N94單接種處理與CK和D575單接種處理相比，差異顯著(Plt;0.05)。

3)對苗木生物量的影響。各處理組苗木生物量顯著提高，與對照差異顯著(Plt;0.05)(表1)。

在苗木鮮重方面：接種3個月后，與CK相比，單接種N94與D575分別提高20.68%和13.79%，雙接種苗高提高24.13%；而這3個接種處理之間對苗高影響差異不顯著(Pgt;0.05)。

在苗木干重方面：單接種N94與D575苗木的干重分別比CK高35.67%和21.61%，雙接種比CK高41.09%。

上述結(jié)果證明，雙接種對提高樟子松苗木生長具有促進(jìn)作用，苗高、地徑、苗木鮮重和干重比對照顯著增加，菌株D575和N94具有良好的兼容性，有效促進(jìn)苗木的生長，增加其生物量。單接種方面，外生菌根菌N94在提高苗木生長方面作用明顯。D575在提高苗木抗病性方面的作用，需要在立枯絲核菌接種后，用苗木抗病性生理指標(biāo)的變化來驗證。

表1 不同接種處理對樟子松苗木生長指標(biāo)的影響

注：進(jìn)行單因素方差分析，同列標(biāo)有不同字母者表示組間差異顯著性水平不同(Plt;0.05)。

2.2 不同接種處理對樟子松苗木抗猝倒病的影響

1)對苗木抗氧化酶活性的影響。接種病原菌前后樟子松苗木的抗氧化酶活性均有提高，根際益生菌的存在可提高苗木的保護(hù)酶活性。接種后的保護(hù)酶SOD、POD、CAT活性由大到小排序為D575+N94，D575，N94，CK。除POD外，益生菌D575和N94存在條件下，立枯絲核菌接種處理后，樟子松苗木的SOD和CAT活性與對照相比均有顯著性差異(Plt;0.05)。不同接種處理之間除SOD外，POD和CAT活性差異不顯著(Pgt;0.05)。不同接種處理之間比較，雙接種效果最好，與對照相比，CAT、POD和SOD酶活分別提高32.65%，10.96%和19.39%，證明雙接種處理有效增加植物體內(nèi)的保護(hù)酶活性，以抵抗生物脅迫等逆境條件(表2)。

表2 D575、N94不同接種處理在病原菌接種前后對樟子松抗氧化酶的影響

注：進(jìn)行單因素方差分析，同列標(biāo)有不同字母者表示組間差異顯著性水平不同(Plt;0.05)。

2)對苗木丙二醛和抗病保護(hù)酶活性的影響。活性氧代謝是植物對逆境脅迫的初始反應(yīng)，生物脅迫條件下，植物體內(nèi)活性氧的積累加劇，導(dǎo)致膜質(zhì)過氧化產(chǎn)物丙二醛含量迅速增加，而外生菌根菌和內(nèi)生真菌可提高宿主植物保護(hù)酶系活性，從而清除生物脅迫所產(chǎn)生的超氧自由基和活性氧，減輕逆境對宿主植物的傷害。未接種外生菌根菌N94和內(nèi)生真菌D575條件下，立枯絲核菌處理后，樟子松苗木丙二醛含量顯著增加(表3)，CK與其他接種處理比較存在顯著性差異(Plt;0.05)。與對照相比，D575+N94、D575和N94這3種接種處理丙二醛含量分別降低23.42%，22.15%和10.75%，其中雙接種降低效果最顯著，證明植物根際益生菌的存在可提高宿主植物的抗逆抗病性。

各接種處理組均可提高苗木β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性(表3)。與對照相比，單接種N94和D575苗木的β-1,3-葡聚糖酶活性分別提高14.66%和33.72%，雙接種N94+D575提高33.97%；與對照相比，單接種菌株N94和D575苗木的幾丁質(zhì)酶活性分別提高9.23%和30.76%，雙接種N94+D575提高36.92%。

無論是丙二醛含量還是β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性在立枯絲核菌接種前后均有顯著性變化，植物根際益生菌N94和D575的存在可有效緩解宿主植物在逆境脅迫條件下體內(nèi)的生理變化，降低有害物質(zhì)累積，提高抗病保護(hù)酶活性。其中內(nèi)生真菌D575的存在對提高樟子松苗木抗病性方面發(fā)揮了重要作用。

表3 D575、N94不同接種處理在病原菌接種前后對樟子松丙二醛含量和抗病保護(hù)酶活性的影響

注：進(jìn)行單因素方差分析，同列標(biāo)有不同字母者表示組間差異顯著性水平不同(Plt;0.05)。

2.3 不同接種處理對樟子松抗立枯病的影響 通過人工接種，在建立“內(nèi)生菌—外生菌根菌—針葉苗木”體系基礎(chǔ)上，進(jìn)行絲核菌接種處理，結(jié)果表明，內(nèi)生真菌和外生菌根菌的存在可以降低苗木立枯病的發(fā)生(表4)，其中雙接種D575+N94、單接種D575、N94的防治效果分別為55.25%，53.56%和46.02%，成活率分別為70.25%，70.11%和65.14%。

表4 不同接種處理對樟子松抗立枯病的影響

注：進(jìn)行單因素方差分析，同列標(biāo)有不同字母者表示組間差異顯著性水平不同(Plt;0.05)。

3 結(jié)論與討論

多數(shù)根際有益微生物間的互作包括共生、拮抗、競爭，對植物的作用主要表現(xiàn)為協(xié)同增效、相互的功能抑制等，多數(shù)研究表明有益微生物的共同使用相對單一使用表現(xiàn)出對植物更強(qiáng)的促生作用和抗病能力。外生菌根菌和深色有隔內(nèi)生真菌是針葉樹根際重要的益生真菌，本研究通過單接種和雙接種方式，測定了褐環(huán)乳牛肝菌N94與深色有隔內(nèi)生真菌D575對樟子松苗木生長和抗立枯病的影響。

在促生方面，益生菌的接種對苗木具有較強(qiáng)的促生作用，雙接種處理對苗高、地徑、鮮重和干重分別比對照提高11.18%，14.11%，24.13%和41.09%。褐環(huán)乳牛肝菌N94是項目組篩選得到的高效外生菌根菌，其對樟子松和紅皮云杉均具有促生抗逆作用[14-15]，N94與木霉菌的雙接種也表現(xiàn)出良好的兼容性。在提高樟子松苗木抗逆性方面，雙接種處理可提高樟子松苗木對立枯絲核菌的抗性，在接種立枯絲核菌后，保護(hù)酶CAT、POD和SOD酶活性與對照相比分別提高32.65%，10.96%和19.39%，丙二醛含量降低23.42%，β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶活性分別提高33.97%和36.92%。宿主植物在受到立枯絲核菌等病原菌侵染后，抗逆相關(guān)酶活性的迅速升高是宿主植物抗病能力強(qiáng)弱的表現(xiàn)之一，對宿主植物防衛(wèi)反應(yīng)的啟動和快速應(yīng)答具有重要意義。接種菌根菌和深色有隔內(nèi)生真菌后，與對照相比，可顯著提高宿主植物的保護(hù)酶(SOD、POD和CAT酶)和抗病酶(β-1,3-葡聚糖酶和幾丁質(zhì)酶)活性，從而抑制病害的發(fā)生。而保護(hù)酶的活性提升，可以降低逆境條件下宿主植物丙二醛的大量累積，減少對植物的傷害。在立枯絲核菌的接種試驗中，內(nèi)生真菌和外生菌根菌的存在可以降低苗木立枯病的發(fā)生，其中雙接種D575+N94和單接種D575的防治效果好于單接種N94，表明深色有隔內(nèi)生真菌D575的存在更多的是起到提高植物抗逆性的作用，與生防菌株如木霉菌[16-17]、生防細(xì)菌[18-19]等相比，防治效果有一定差距，而內(nèi)生菌和外生菌的主要作用是在提高植物耐旱[20-21]、耐鹽堿[22]、耐污染土壤方面的，因此建議在后續(xù)的苗木根部保健劑制備中加入木霉菌、生防細(xì)菌等以有效控制病害發(fā)生，課題組在下一步工作中也計劃加入木霉菌、多粘類芽孢桿菌等，探討多重益生菌接種對樟子松苗木生長的影響。

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(責(zé)任編輯 楊靜莉)

EffectofinoculatingPhialocephalafortiniiD575andSuillusluteusN94onthegrowthofPinussylvestrisvar.mongolicaanditsresistanttodamping-off/

DENG Xun,et al.

( Forestry Protection Institute of Heilongjiang Forestry Academy,Harbin 150040,China)

The dark septate endophyte(DSE) fungi and ectomycorrhiza fungi are two main rhizosphere microorganism groups of coniferous species,and play an important role in growth promotion and stress resistance to host.Seedling biomass,physiological index of disease resistance and the incidence of damping off were determinated to research the growth promotion and disease resistant ofPinussylvestrisvar.mongolica inoculated by dark septate endophyte fungi D575 and ectomycorrhiza fungi N94 in this paper.The results indicate that:dual inoculation of D575 and N94 have the best effection on seedling growth promotion,the seedling height,ground diameter,fresh and dry weight enhanced 11.18%,14.11%,24.13% and 41.09% respectively in contrast to control.Inoculated D575 and N94 can enhance the seedling disease resistant.After inoculatingRhizoctoniasolani,the seedling CAT,POD and SOD enzyme activity enhanced 32.65%,10.96% and 19.39%,the MDA content decreased 23.42%,and the β-1,3-glucanase and chitinase activity enhanced 33.97% and 36.92% in contrast to control.In the end,damping-off incidence of inoculate seedlings were lower than that of the uninoculate treatments.

Pinussylvestrisvar.mongolica；dark septate endophyte(DSE) fungi;ectomycorrhiza fungus;growth promotion and disease resistant

2015-12-14

國家自然科學(xué)基金項目(31200484，31170597)，國家“十二五”科技攻關(guān)項目專題(2012BAD19B0801)，黑龍江省森工總局項目(SGZJY2010014，SGZJY2012016)

鄧勛(1978—)，男，研究員，農(nóng)學(xué)博士，主要研究方向：菌物開發(fā)利用及林木病害可持續(xù)控制，E-mail:dxhappy@126.com

宋瑞清，教授，主要研究方向：菌物開發(fā)利用及食用菌遺傳育種。

S763.15

A

1671-0886(2017)01-0021-05