玉米淀粉及黃漿發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖抗氧化活性

◎ 高洪增

（秦皇島驪驊淀粉股份有限公司，河北 秦皇島 066300）

小核菌多糖又被稱為硬葡聚糖，而小核菌膠則是由絲狀真菌齊整小核菌產(chǎn)生的非離子水溶性多糖，在試驗中發(fā)現(xiàn)其分子中含有β-D（1,6）-葡萄糖殘基側(cè)鏈線性β-D-（1,3）-葡糖殘基鏈構(gòu)成，小核菌多糖所具有的顯著特征是穩(wěn)定性和流變性。在礦化度和廣泛pH（1～12）、溫度（130 ℃）環(huán)境下都具有良好的穩(wěn)定性。小核菌多糖在石油工業(yè)中有著較大的應(yīng)用價值，對于提升原油采收率有著積極的作用。所以，將小核菌發(fā)酵培養(yǎng)和玉米淀粉當(dāng)成主要碳源，玉米黃漿則是碳源，經(jīng)過發(fā)酵之后得到小核菌粗多糖。再對其體外抗氧化能力進(jìn)行分析，從而為抗氧化功能性食品中的應(yīng)用提供更多的參考和指導(dǎo)。

1 試驗方法

1.1 小核菌粗多糖制備

控制在4 ℃環(huán)境下對小核菌菌種在PDA斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行接種，并且在溫度為29 ℃的環(huán)境下恒溫培養(yǎng)2 d，選擇培養(yǎng)液3 mL注入到培養(yǎng)后斜面培養(yǎng)基中，然后輕刮幾次菌絲，將其混勻，并倒入種子培養(yǎng)基中，搖勻處理[1]。選擇培養(yǎng)后的種子發(fā)酵液直接種在玉米淀粉、黃漿發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液輕微過濾掉菌絲，利用等電法去除醇沉、蛋白、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)掉乙醇，凍干蒸發(fā)后得到相應(yīng)的小核菌粗多糖。

1.2 體外抗氧化活性

利用雙蒸水來配制ABTS自由基儲備液，控制在4 ℃環(huán)境下對其進(jìn)行保存，使用已經(jīng)稀釋40倍的液體作為工作液，工作液吸光度控制為0.7±0.001，準(zhǔn)確量選擇0.1 mL不同濃度的粗多糖溶液，并且將其加入10 mL試管中，融入ABTS自由基液體中，控制劑量為1.9 mL，在6 min進(jìn)行反應(yīng)后在700 nm波長處對溶液混合物的吸光度進(jìn)行測定。將其標(biāo)注為A（混合物），同樣方法進(jìn)行操作，使用等體積的雙蒸水來替代小核菌多糖溶液，并且對溶液吸光度進(jìn)行測定，將其記錄為B（雙蒸水）。ABTS自由基清除率按照公式（1）計算。

ABTS自由基清除率=（A-B）/A×100% （1）

1.3 小核菌粗多糖對超氧陰離子自由基清除率測定

和鄰苯三酚自氧化法相似，選擇劑量為2.25 mL pH為8.34磷酸鹽緩沖液PBS，然后加入2 mL蒸餾水，控制體積為4.5 mL，并且混勻之后在25 ℃環(huán)境下保溫；4 min后加入10 mol/L滴反應(yīng)終止。并且在325 nm對空白管的吸光度進(jìn)行測量，將其記作C，還要對樣品清除能力進(jìn)行測量，選擇試劑之前還需要加入鄰苯三酚，并在此之前加入劑量為2 mL樣液替代蒸餾水，并在終止反應(yīng)后測量吸光度，超氧陰離子自由基清除率則按照公式（2）計算。

超氧陰離子自由基清除率=（C-A）/C×100% （2）

1.4 小核菌粗多糖對亞硝基自由基清除率測定過程

選取0.5 mL亞硝酸鈉溶液，控制濃度為5 μg/mL，融入小核菌粗多糖溶液，在其反應(yīng)10 min之后，加入濃度為0.4%多糖的溶液，搖勻反應(yīng)5 min后加入濃度為0.2%的N-1-苯基乙二胺鹽酸鹽1 mL后搖勻15 min，并在波長5540 nm處對吸光度進(jìn)行測量，將其記作A，同樣方法來操作，并利用雙蒸水來替代小核菌多糖溶液，并且對溶液吸光度進(jìn)行測定，將其記為A0。小核菌多糖對于NO2清除率按照公式（3）計算。

小核菌多糖對于NO2清除率=（A-A0）/A0×100% （3）

1.5 小核菌粗糖對亞油酸過氧化的作用

選擇劑量為10 mL的試管，加入劑量為2 mL的粗多糖溶液、亞油酸溶液、蒸餾水、磷酸鹽緩沖液；對照管則使用劑量為各2 mL的乙醇來替代樣品進(jìn)行試驗。要保證所有試管避光，并且在40 ℃的水浴鍋中加速進(jìn)行氧化試驗。1 d后選擇劑量為0.1 mL的培養(yǎng)液，加入硫氰酸銨溶液和乙醇以及氯化鐵溶液，準(zhǔn)確進(jìn)行3 min反應(yīng)。在500 nm處對紅色化合物的吸光度進(jìn)行測量。

2 結(jié)果分析

2.1 碳源對于發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的作用

選擇馬鈴薯淀粉、玉米淀粉、蔗糖、木薯淀粉、葡萄糖以及果糖作為碳源，控制具體的添加劑量為30 g/L，控制發(fā)酵時間為3 d，對不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響見表1。

表1 不同碳源對發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響表

從表1中可發(fā)現(xiàn)，將馬鈴薯淀粉、玉米淀粉和葡萄糖當(dāng)成碳源時，小核菌多糖的產(chǎn)量相對較高，木薯和蔗糖次之，其他碳源則對于多糖的合成產(chǎn)生不利影響。葡萄糖和蔗糖作為碳源時，1%的小核菌多糖溶液有著較高的年度，綜合考慮小核菌多糖產(chǎn)品品質(zhì)和產(chǎn)量，可以選擇玉米淀粉作為菌株SCL2010發(fā)酵生產(chǎn)小核菌多糖的碳源。

2.2 葡萄糖添加量對發(fā)酵產(chǎn)小核菌多糖的影響

具體如圖1所示。

圖1 葡萄糖碳源轉(zhuǎn)化率分析圖

通過圖1結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在葡萄糖添加量逐漸增加的影響下，小核菌多糖產(chǎn)量開始上升；葡萄糖添加量為45 g/L時，小核菌多糖產(chǎn)量為29.8 g/L，生物量為15.04 g/L，則碳源轉(zhuǎn)化率超過60%。葡萄糖添加劑超過45 g/L，則多糖產(chǎn)量增加速度受到影響，碳源轉(zhuǎn)化率也下降，餐糖量增加。所以，生產(chǎn)小核菌多糖適宜的葡萄糖添加劑量為45 g/L。

3 討論

根據(jù)相關(guān)研究不難發(fā)現(xiàn)多糖對ABTS自由基清除能力和與其所涵蓋的官能團(tuán)數(shù)量以及種類息息相關(guān)，包括羥基、羧基等官能團(tuán)的存在類可能加多糖對ABTS自由基的實際清除能力。小核菌多糖紅外掃描結(jié)果充分顯示，小核菌多糖含有羥基，不難推測這類官能團(tuán)的存在能夠讓小核菌多糖產(chǎn)生顯著的ABTS自由基清除能力[3]。

亞硝酸鹽作為防腐劑，將其添加到肉制品中，而蔬菜中硝酸鹽在細(xì)菌影響下出現(xiàn)亞硝酸鹽，在一定環(huán)境下亞硝酸鹽會轉(zhuǎn)變成亞硝胺，該種物質(zhì)會產(chǎn)生致癌的功效。有專家學(xué)者提出亞硝酸鹽進(jìn)入到人體之后，在抗氧化劑攝入的影響下，胃內(nèi)綜合作用后無法形成亞硝胺。

當(dāng)前多糖抗氧化機(jī)理還比較模糊，根據(jù)研究發(fā)現(xiàn)在對硫酸化進(jìn)行修飾之后，能夠讓糖環(huán)上游離羥數(shù)量減少，讓紅棗多糖的自由基清除活性提升[4]。在今后的研究過程中需要進(jìn)一步提升小核菌多糖的空間構(gòu)象和抗氧化能力的關(guān)系，找到關(guān)鍵作用的空間結(jié)構(gòu)和官能團(tuán)，立足于本質(zhì)角度來探討小核菌多糖清除自由基的機(jī)理和作用[5]。

小核菌多糖能夠在一定程度上清除ABTS自由基，對于超氧陰離子的亞硝基自由基有著積極的作用，這就充分表明小核菌多糖是一種天然、良好的自由基清除劑。

[1]張永剛，王 偉，張艷敏，等.齊整小核菌SCL2010產(chǎn)小核菌多糖培養(yǎng)基優(yōu)化的研究[J].中國釀造，2017，36（11）：49-53.

[2]張永剛，董學(xué)前，王 偉，等.一株小核菌多糖高產(chǎn)菌及其發(fā)酵特征[J].化學(xué)與生物工程，2017，34（11）：19-22.

[3]王立東，肖志剛.氣流粉碎對玉米淀粉結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2016，32（24）：276-281.

[4]張雅媛，洪 雁，顧正彪，等.玉米淀粉與黃原膠復(fù)配體系流變和凝膠特性分析[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報，2011，27（9）：357-362.

[5]李 娜，張英華.用RVA儀分析玉米淀粉的糊化特性[J].中國糧油學(xué)報，2011，26（6）：20-24.