立枯絲核菌選擇性培養(yǎng)基的研究

李 悅

(安康市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，陜西 安康 725021)

立枯絲核菌(Rhizoctoniasolanikühn)的寄主范圍非常廣，據(jù)報道，在自然條件下，立枯絲核菌可以侵染200多種植物，通過人工接種的方法可以成功侵染32科的188種植物，產(chǎn)生多種不同的癥狀，例如腐爛、枯萎、猝倒，褐變等等[1]。立枯絲核菌作為一種嚴重危害作物的土傳病原菌，以菌絲或菌核形式在土壤中殘留越冬，在條件適宜的情況下侵染作物，引發(fā)病害，由立枯絲核菌引起的重要植物病害，如水稻紋枯病和玉米紋枯病，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了重大的損失[2]。選擇性培養(yǎng)基是根據(jù)不同種類菌株對化學(xué)物質(zhì)的敏感度不同，通過添加特定的物質(zhì)來配制，用于對目的菌株進行有效篩選[3]。本研究的目的是找尋一種選擇性培養(yǎng)基，可抑制部分常見土壤寄生菌，但不影響立枯絲核菌的生長。利用這種選擇性培養(yǎng)基，可以有效的測定土壤中是否有立枯絲核菌的存在，通過生成的菌落預(yù)估土壤菌源量，從而積極采取措施，達到提前預(yù)防病害的目的。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

供試微生物：立枯絲核菌Rhizoctoniasolanikühn、黃曲霉Aspergillusflavus、黑曲霉Aspergillusnige、木霉Trichodermasp.、根霉Rhizopussp.、鏈格孢霉Alternariaalternata、尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum、致病疫霉Phytophtorainfestans。

主要試劑：K2HPO4、MgSO4·7H2O 、KCl 、FeSO4·7H2O 、NaNO2、氯霉素 、醫(yī)用鏈霉素、孟加拉紅，以上所用試劑均為市售分析純。

供試農(nóng)藥：98%甲霜靈原藥，山東沾化天元精細化工有限公司生產(chǎn)；95%咪鮮胺原藥，湖北巨勝科技有限公司生產(chǎn)。

1.2 試驗方法

1.2.1 選擇性培養(yǎng)基篩選 參考已有報道配方制作基礎(chǔ)培養(yǎng)基[4～5]，配方如下：K2HPO41 g；MgSO4·7H2O 0.5 g；KCl 0.5 g；FeSO4·7H2O 10 mg；NaNO20.2 g；氯霉素0.05 g；瓊脂20 g；蒸餾水1 000 mL。制備完成后在高壓蒸汽滅菌鍋中121℃滅菌20 min，在培養(yǎng)基冷卻到50～55℃時加入0.1 g·L-1鏈霉素和0.035 g·L-1孟加拉紅，然后分別加入以下三種混配藥劑，①0.06 g·L-1甲霜靈，0.005 g·L-1咪鮮胺；②0.08 g·L-1甲霜靈，0.007 g·L-1咪鮮胺；③0.1 g·L-1甲霜靈，0.01 g·L-1咪鮮胺。

分別在培養(yǎng)黃曲霉、黑曲霉、木霉、根霉、鏈格孢霉、尖孢鐮刀菌、致病疫霉和立枯絲核菌等土壤中常見病原菌的菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌餅，分別移至各配方培養(yǎng)基平板中央，重復(fù)3次，28℃培養(yǎng)，以加入等量無菌水的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對照，3 d后測量各菌塊在培養(yǎng)基上的菌落直徑，篩選出最適合立枯絲核菌的選擇性培養(yǎng)基配方。

1.2.2 選擇性培養(yǎng)基效果驗證 將立枯絲核菌菌株接種于麥麩培養(yǎng)基中(50 g麥麩+50 g水的麥麩培養(yǎng)基中放入5塊直徑5 mm的菌絲塊)，28℃培養(yǎng)14 d，每日搖動培養(yǎng)基若干次，備用。分別將帶菌麥麩與大田土壤按照5 ∶ 5，3 ∶ 7，1 ∶ 9的體積比混勻，制成含菌量不同的帶菌土，混勻后置于25℃的恒溫烘箱中24 h，風(fēng)干后研磨，稱取0.1 g均勻地撒在已制備好的選擇性培養(yǎng)基平板上，置于28℃培養(yǎng)24 h, 通過鏡檢確定長出的菌落是立枯絲核菌后統(tǒng)計菌落數(shù)。每處理測定5皿，重復(fù)3次，以無菌土作為對照。

2 結(jié)果與分析

2.1 選擇性培養(yǎng)基篩選結(jié)果

選擇性培養(yǎng)基的篩選試驗結(jié)果如表1所示，配方1對根霉以及致病疫霉的抑制效果不理想，配方2和3均可有效抑制除立枯絲核菌以外的其它病菌的生長，但是與對照處理比較，加入藥劑后的培養(yǎng)基對 立枯絲核菌的生長也有一定的抑制作用，配方3由于加入的藥劑濃度更高，對立枯絲核菌的抑制作用更強，因此選擇使用配方2作為立枯絲核菌的選擇性培養(yǎng)基(表1 )。

2.2 選擇性培養(yǎng)基效果驗證

將培養(yǎng)皿置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h后觀察有白色菌落生成， 通過鏡檢確定長出的菌落全部是立枯絲核菌，未見其他微生物菌落。經(jīng)菌落數(shù)統(tǒng)計，各處理土壤含菌量差異顯著，各處理中加入菌源量是5 ∶ 3 ∶ 1，經(jīng)選擇性培養(yǎng)基篩選后，統(tǒng)計土壤菌量結(jié)果是5.70 ∶ 3.37 ∶ 1，結(jié)果近似初始加入菌源量(表2)。

表1 不同植物病原菌在3種選擇性培養(yǎng)基上的生長情況

表2 各處理土壤中立枯絲核菌含量

3 結(jié)論與討論

通過試驗驗證，配方2對除立枯絲核菌以外的其他常見土壤寄生菌有較強的抑制作用，可以作為立枯絲核菌的一種選擇性培養(yǎng)基，利用其特殊作用將立枯絲核菌從土壤中鑒別出來。用篩選的選擇性培養(yǎng)基測定混有不同比例帶菌土中立枯絲核菌的含量，從最終結(jié)果來看，該培養(yǎng)基可以較為準確的測得土壤中立枯絲核菌的含量，所以在實際生產(chǎn)過程中，這種選擇性培養(yǎng)基可以有效用于測定土壤中是否有立枯絲核菌的存在，通過生成的菌落預(yù)估土壤菌源量，從而積極采取預(yù)防措施，達到控制病害發(fā)生的目的。

立枯絲核菌有多個菌絲融合群，來自不同融合群的菌株之間存在一定差異，本次試驗只選用了一株菌株，后期還需利用來自不同菌絲融合群的菌株進行效果驗證。另外土壤中寄生菌復(fù)雜多樣，本試驗只選取了常見的幾種，選擇性培養(yǎng)基在實際應(yīng)用過程中還可不斷完善優(yōu)化，確保其選擇的有效性。