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    HPLC測(cè)定小米中非法添加姜黃素及不確定度分析

    2017-12-13 13:11:31李卓張亞鋒李榮董曼曼賈寒冰
    食品研究與開發(fā) 2017年24期
    關(guān)鍵詞:冰乙酸姜黃標(biāo)準(zhǔn)溶液

    李卓,張亞鋒,李榮,董曼曼,賈寒冰

    (西安市食品藥品檢驗(yàn)所,陜西西安710054)

    HPLC測(cè)定小米中非法添加姜黃素及不確定度分析

    李卓,張亞鋒,李榮,董曼曼,賈寒冰

    (西安市食品藥品檢驗(yàn)所,陜西西安710054)

    采用高效液相色譜法(HPLC)對(duì)小米中非法染色姜黃素進(jìn)行定性定量測(cè)定,并對(duì)其不確定度進(jìn)行分析。以乙腈-4%冰乙酸(45+55)為流動(dòng)相,流速1.0 mL/min,經(jīng)C18柱分析,檢測(cè)波長(zhǎng)425 nm。采用外標(biāo)法定量,姜黃素在0.585 μg/mL~4.88 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,相關(guān)系數(shù)r2=0.999 9,平均回收率92%,檢出限為0.08 mg/kg,整個(gè)試驗(yàn)的合成不確定度為1.937%,擴(kuò)展不確定度為X=(7.15±0.29)mg/kg;k=2。本方法操作簡(jiǎn)單,重復(fù)性好,檢出限低,可用于小米中姜黃素非法染色的測(cè)定。

    高效液相色譜法(HPLC);姜黃素;小米;不確定度

    姜黃素是從姜科姜黃屬植物姜黃、莪術(shù)等根莖中提取的一種有效成分,是一種二酮、二羥基,帶有共軛苯環(huán)和雙鍵結(jié)構(gòu)的天然黃色素[1]。在GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中規(guī)定姜黃和姜黃素可作為著色劑在部分食品中添加并有相應(yīng)的限量要求,但在小米中沒有明確規(guī)定[2],應(yīng)不得使用。但有些不法商販為了掩蓋陳小米或小米輕度發(fā)霉現(xiàn)象,將小米漂洗后加入姜黃粉或姜黃素進(jìn)行再加工,使色暗的陳小米變得顏色鮮黃誘人,充當(dāng)新小米進(jìn)行售賣,長(zhǎng)期食用這種小米對(duì)人體健康有害無益?,F(xiàn)姜黃素檢測(cè)方法主要有高效液相色譜法[3-5]、液質(zhì)聯(lián)用法[6]、薄層色譜法[7]等,尚未有小米非法染色姜黃素的檢測(cè)方法。

    本文通過優(yōu)化檢測(cè)波長(zhǎng)、流動(dòng)相、樣品提取等檢測(cè)條件,建立了一種小米中非法染色姜黃素的高效液相色譜測(cè)定方法,做了方法學(xué)考察,并采用JJF 1059.1-2012《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》[8]對(duì)試驗(yàn)過程中的不確定度分量進(jìn)行了分析,找出影響結(jié)果的因素,為結(jié)果準(zhǔn)確性,可靠性提供真實(shí)、有效的依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    小米:市售;姜黃素(批號(hào)0823-9802):中國(guó)食品藥品檢定院;甲醇為色譜純;其他試劑均為分析純。

    1.2 儀器與設(shè)備

    Ulimate 3000型高效液相色譜儀(配DAD檢測(cè)器):美國(guó)Thermo公司;MS105電子分析天平、ME204E電子分析天平:瑞士Mettler公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

    準(zhǔn)確稱取1.95 mg姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL棕色容量瓶中,用甲醇溶解并定容,配制成195 μg/mL姜黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液。移取1 mL姜黃素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液于10 mL容量瓶,用甲醇定容,制成姜黃素標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。再移取 0.3、0.5、1、2、2.5 mL 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)中間液于10 mL容量瓶,用甲醇定容,制成0.585、0.975、1.95、3.90、4.88 μg/mL 系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

    1.3.2 樣品制備

    稱取粉碎均勻的樣品5.00 g于100 mL具塞三角瓶中,精密加入甲醇20 mL,超聲提取10 min,放置至室溫,搖勻后,用0.45 μm有機(jī)系濾膜過濾于棕色樣品瓶中,待測(cè)。

    1.3.3 色譜條件

    流動(dòng)相:乙腈+4%冰乙酸=45+55;色譜柱:Agela,C184.6 mm×250 mm,5 μm;柱溫:30 ℃;流速:1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng):425 nm;進(jìn)樣體積:10 μL。

    1.4 結(jié)果計(jì)算

    式中:X為姜黃素的含量,mg/kg;C為由標(biāo)準(zhǔn)曲線得到樣品溶液中姜黃素的濃度,μg/mL;m為樣品的質(zhì)量,g;V 為甲醇加入體積,mL。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 色譜條件的選擇

    2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

    姜黃素光譜圖見圖1。

    圖1 姜黃素光譜圖Fig.1 Spectrum of curcumin

    如圖1所示,采用二極管陣列檢測(cè)器在190 nm~800 nm波長(zhǎng)下對(duì)姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行掃描,結(jié)果顯示姜黃素在425 nm處有最大吸收峰,為了使其靈敏度最佳,選擇425 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

    2.1.2 流動(dòng)相的選擇

    姜黃素具有兩個(gè)羥基,羥基氫易解離,在流動(dòng)相中加入一定量酸可以抑制姜黃素的解離,以改善其在C18柱中的保留及峰型。本試驗(yàn)比較了乙腈-水、乙腈-1%磷酸、乙腈-0.1%冰乙酸、乙腈-4%冰乙酸4個(gè)體系的流動(dòng)相,結(jié)果表明,在乙腈-水、乙腈-1%磷酸、乙腈-0.1%冰乙酸流動(dòng)相體系下,姜黃素目標(biāo)峰都有不同程度的拖尾現(xiàn)象,而以乙腈-4%冰乙酸體系為流動(dòng)相,目標(biāo)峰峰型對(duì)稱效果好,故選擇乙腈-4%冰乙酸為流動(dòng)相。圖2、圖3為姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品及樣品溶液色譜圖。

    圖2 姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 Chromatogram of curcumin

    圖3 樣品中姜黃素色譜圖Fig.3 Chromatogram of sample

    2.1.3 提取溶劑的選擇

    姜黃素極性較小,不溶于水,易溶于甲醇、乙醇、冰乙酸等試劑中[9]。本試驗(yàn)比較了甲醇、無水乙醇、乙酸乙酯、冰乙酸、70%冰乙酸5種提取溶劑,結(jié)果如圖4。

    圖4 不同溶劑提取率Fig.4 Different solvent extraction rate

    由圖4可知,提取率由大至小依次為:甲醇>冰醋酸>無水乙醇>乙酸乙酯>70%冰醋酸,甲醇的提取率最高,故選擇甲醇為提取溶劑。

    2.2 方法學(xué)考察

    2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

    取1.3.1項(xiàng)下姜黃素系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液在本試驗(yàn)所選色譜條件下測(cè)定,以姜黃素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,回歸方程為y=0.890 7x-0.029 4,相關(guān)系數(shù)為r2=0.999 9,結(jié)果表明,姜黃素在0.585 μg/mL~4.88 μg/mL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

    2.2.2 回收率與重復(fù)性

    取陰性小米樣品,分別添加了3個(gè)水平濃度,每個(gè)水平添加3個(gè)平行,按照本試驗(yàn)的方法測(cè)定姜黃素質(zhì)量濃度,加標(biāo)回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見表1。由結(jié)果可以看出,該方法具有良好的準(zhǔn)確性和精密度。

    表1 回收率及其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 1 Recovery and relative standard deviation

    2.2.3 穩(wěn)定性

    由于姜黃素分子結(jié)構(gòu)中含有共軛雙鍵,易在光與熱作用下發(fā)生氧化降解[10],故應(yīng)將提取溶液過濾后貯存于棕色樣品瓶中,在室溫下放置 0、3、6、12、24、48 h進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)姜黃素在0~24 h內(nèi)比較穩(wěn)定,24 h時(shí)后有小幅度下降,說明處理好的樣品應(yīng)盡快測(cè)定,不宜放置過久。

    圖5 姜黃素穩(wěn)定性Fig.5 Stability of curcumin

    2.2.4 檢出限與定量限

    在本試驗(yàn)所選色譜條件下,用空白樣品溶液稀釋姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液至10倍信噪比、3倍信噪比,結(jié)果10S/N時(shí)姜黃素質(zhì)量濃度為0.06 μg/mL,3S/N時(shí)姜黃素質(zhì)量濃度為0.02 μg/mL,經(jīng)計(jì)算,姜黃素定量限為0.24 mg/kg,檢出限為 0.08 mg/kg。

    2.3 不確定度分析

    2.3.1 A類不確定度

    2.3.1.1 樣品的重復(fù)性引入的不確定度

    在重復(fù)條件下,對(duì)樣品進(jìn)行了6次測(cè)定,含量分別是 7.15、7.20、7.22、7.13、7.22、7.20 mg/kg, 平 均 值 為7.19 mg/kg,則由樣品重復(fù)性引入的相對(duì)不確定度為:

    2.3.1.2 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線求樣品濃度引入的不確定度

    采用了5個(gè)水平的姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別進(jìn)行1次測(cè)定,以相應(yīng)的峰面積與標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度用最小二乘法進(jìn)行擬合,結(jié)果如表2。

    表2 最小二乘法擬合標(biāo)準(zhǔn)曲線數(shù)據(jù)Table 2 Uncertainty resulting from least square curve fitting

    擬合曲線求樣品溶液中姜黃素引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    式中:s為殘余標(biāo)準(zhǔn)差s=0.023 372;Scc為標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度殘差和Scc=13.910 93;C為樣品溶液的質(zhì)量濃度C=1.786 4;為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的平均質(zhì)量濃度=2.458;a為回歸方程斜率a=0.890 7;N為樣品平行測(cè)定次數(shù)N=2;n為標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定次數(shù)n=5。

    2.3.2 B類不確定度

    2.3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)引入的不確定度

    由于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)信息中并未給出不確定度,故暫忽略不計(jì)。

    2.3.2.2 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量引入的不確定度

    由檢定證書查得,該電子天平在0≤m≤50 g范圍示值誤差為為±0.03 mg,稱取標(biāo)準(zhǔn)品1.95 mg,按矩形分布,則由稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    2.3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容及稀釋過程引入的不確定度

    按照1.3.1配制標(biāo)準(zhǔn)工作溶液引入的不確定度主要包括移液管、容量瓶以及溫度效應(yīng)。其中移液管和容量瓶根據(jù)JJG 196-2006《常用玻璃量器檢定規(guī)程》[12],按矩形分布計(jì)算。溫度效應(yīng)由于溫度變化引起液體體積變化明顯大于容量瓶體積的變化,所以溫度變化帶來的不確定度只考慮液體體積帶來的不確定度,已知甲醇的體積膨脹系數(shù)為1.2×10-3,實(shí)驗(yàn)室室溫在±2℃之間變動(dòng),按照矩形分布計(jì)算,引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如表3。

    表3 標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋過程引入的相對(duì)不確定度Table 3 Uncertainty during standard solution dilution

    由表3中數(shù)據(jù)合成,配制姜黃素標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度如下:

    2.3.2.4 樣品稱量引入的不確定度

    由檢定證書查得,該電子天平在0≤m≤50 g范圍示值誤差為±0.000 1 g,稱取樣品5.00 g,按矩形分布,則由樣品稱量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    2.3.2.5 樣品提取劑加入量引入的不確定度

    樣品中精密加入甲醇20 mL,與2.3.2.2同理,20 mL A類單標(biāo)吸量管容量允差為±0.030 mL,溫度在±2℃之間變動(dòng),引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

    2.3.3 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度及擴(kuò)展不確定度的計(jì)算

    3 結(jié)論

    本文建立了HPLC測(cè)定小米中非法染色姜黃素的方法,優(yōu)化了色譜條件,方法操作簡(jiǎn)單,且具有較好的準(zhǔn)確度和重復(fù)性,可為非法添加物質(zhì)測(cè)定提供一定參考。另外,對(duì)該方法進(jìn)行了不確定度分析,分析了各個(gè)影響結(jié)果的分量,發(fā)現(xiàn)在不確定因素5個(gè)分量中,對(duì)結(jié)果影響最大的主要為標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制和標(biāo)準(zhǔn)工作溶液曲線擬合求濃度。針對(duì)這些不確定度因素,在實(shí)際檢測(cè)過程中可通過選擇適當(dāng)量器、增加標(biāo)準(zhǔn)溶液和樣品的測(cè)定次數(shù)、增大標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稱量等措施減小測(cè)量結(jié)果的不確定度,提高測(cè)量結(jié)果的可信度。

    [1]蔡小明.反相高效液相色譜法測(cè)定肉松制品中姜黃素的含量[J].廣州化學(xué),2014,39(3):7-10

    [2]中華人民共和國(guó)國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì).GB 2760-2014食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2014

    [3]單勝艷,張丹,王春茹,等.高效液相色譜法測(cè)定保健品中姜黃素含量的研究[J].飲料工業(yè),2014,17(2):24-26

    [4]孫鵬堯,李丹丹,牟德華.HPLC法測(cè)定姜黃根莖及姜黃素飲料中姜黃素類化合物的含量[J].食品工業(yè)科技,2016,37(21):313-316

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    [6]李占彬,楊昌彪,譚紅,等.高效液相色譜儀串聯(lián)三重四級(jí)桿質(zhì)譜法快速測(cè)定姜茶中的姜黃素[J].分析儀器,2014(2):65-68

    [7]徐仲溪,王坤波.姜黃素的高效薄層色譜法[J].食品科學(xué),2004,25(6):156-159

    [8]中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局.JJF 1059.1-2012測(cè)量不確定度評(píng)定與表示[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2012

    [9]劉莉,趙振東,劉志榮,等.不同溶劑對(duì)姜黃中姜黃素化合物提取率的比較[J].湖北中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2016,18(1):33-35

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    Detection of Curcumin Illegally Added in Millet by HPLC and Uncertainty Analysis

    LI Zhuo,ZHANG Ya-feng,LI Rong,DONG Man-man,JIA Han-bing
    (Xi'an Institute for Food and Drug Control,Xi'an 710054,Shaanxi,China)

    High performance liquid chromatography(HPLC)was used to qualitatively and quantitatively determine curcumin in millet and its uncertainty was analyzed.Acetonitrile-4%acetic acid(45+55)solution was used as the mobile phase,and 1.0 mL/min as the flow rate,and C18as the analysis column.Good linear relationship was obtained in the concentration range of 0.585 μg/mL-4.88 μg/mL of curumin,with correlation coefficient of 0.999 9.Under the optimized conditions,the average recoveries were 92%.The limit of detection(S/N=3)of curcumin was 0.08 mg/kg.The combined uncertaincy was 1.937%and the expanded uncertainty was X=(7.15±0.29)mg/kg;k=2.The method was sample,reproducible,low detection limit,and can be used to determine the illegal staining of curcumin in millet.

    high performance liquid chromatography(HPLC);curcumin;millet;uncertainty

    10.3969/j.issn.1005-6521.2017.24.034

    李卓(1984—),女(漢),工程師,碩士研究生,主要從事食品安全檢測(cè)方向。

    2017-04-06

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